RNA 시퀀싱을 위한 3개의 차동 발현 분석 방법: 림마, EdgeR, DESeq2

Summary

RNA 시퀀싱을 위한 차동 발현 분석 방법의 상세한 프로토콜이 제공되었다: 림마, EdgeR, DESeq2.

Abstract

RNA 시퀀싱 (RNA-seq)은 유전 적 변경과 복잡한 생물학적 과정 사이의 관계를 밝힐 수 있으며 종양의 진단, 예후 및 치료에서 큰 가치를 가지고 있기 때문에 전사학에서 가장 널리 사용되는 기술 중 하나입니다. RNA-seq 데이터의 차동 분석은 비정상적인 전사를 식별하는 데 매우 중요하며 림마, EdgeR 및 DESeq2는 차동 분석을 위한 효율적인 도구입니다. 그러나, RNA-seq 차동 분석은 R 언어를 가진 특정 기술과 의학 교육의 교과 과정에서 부족한 적당한 방법을 선택하는 기능이 필요합니다.

본 명세서에서는, 당사는 각각 림마, DESeq2 및 EdgeR을 통해 담랑고아르시노마(CHOL) 및 정상 조직 간의 분화유전자(DEGs)를 식별하고, 그 결과는 화산 플롯및 벤 다이어그램에 도시된다. limma, DESeq2 및 EdgeR의 세 가지 프로토콜은 유사하지만 분석 프로세스 마다 다른 단계가 있습니다. 예를 들어 선형 모델은 림마의 통계에 사용되는 반면 음수 이비알 분포는 edgeR 및 DESeq2에서 사용됩니다. 또한, 정규화된 RNA-seq 카운트 데이터는 EdgeR 및 림마에 필요하지만 DESeq2에는 필요하지 않습니다.

여기서는 림마, EdgeR 및 DESeq2의 세 가지 차동 분석 방법에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 세 가지 방법의 결과는 부분적으로 겹칩니다. 세 가지 방법 모두 고유한 장점이 있으며 메서드 선택은 데이터에만 따라 다릅니다.

Introduction

RNA-시퀀싱(RNA-seq)은 많은 장점(예를 들어, 높은 데이터 재현성)을 가진 전사학에서 가장 널리 사용되는 기술 중 하나이며, 복잡한 생물학적 과정의 기능 및 역학에 대한 이해를 크게^{증가시켰습니다 1,2.} 다른 생물학적 맥락에서 비정상적인 전사체의 식별은 또한 분화 유전자 (DEGs)로 알려져 있으며, RNA-seq 분석에서 중요한 단계입니다. RNA-seq는 병인과 관련된 분자 메커니즘 및 생물학적 기능에 대한 깊은 이해를 얻을 수 있게 합니다. 따라서, 차동 분석은^종양의진단, 예후 및 치료에 귀중한 것으로 간주되어 왔다^3,4,5. 현재, RNA-seq 차동 발현 분석, 특히 림마, DESeq2 및 EdgeR^1,6,7을위해 더 많은 오픈 소스 R/바이오 컨덕터 패키지가 개발되었다. 그러나, 차등 분석은 R 언어와 특정 기술과 의료 교육의 교육 과정에....

Protocol

참고: R-스튜디오 프로그램을 열고 R 파일 "DEGs.R"을 로드하면 추가 파일/스크립트에서 파일을 얻을 수 있습니다.

1. 데이터 다운로드 및 사전 처리

1. 암 게놈 아틀라스(TCGA)에서 콜린고이오사르키노마(CHOL)의 고처리량 시퀀싱(HTSeq) 카운트 데이터를 다운로드한다. 이 단계는 다음 R 코드로 쉽게 수행할 수 있습니다.
   1. R 패키지를 설치하려면 실행을 클릭합니다.
   2. R 패키지를 로드하려면 실행을 클릭합니다.
      if(!requireNamespace("BiocManager", 조용히=TRUE))
      + 설치.패키지 ("바이오 매니저")
      바이오매니저::설치(c("TCGAbiolinks", "요약실험"))
   3. 작업 디렉터리 설정합니다.
      라이브러리 (TCGAbiolinks)
      라이브러리(요약실험)
      setwd("C:/사용자/류시이/데스크탑")
   4. 암 유형을 선택합니다.
      암 <- "TCGA-CHOL"
   5. "GDCquery.R" 파일에서 R 코드를 실행하여 데이터를 다운로드합니다. 파일 "GDCquery.R"은 보충 파일 / 스크립트에서 수집 할 수 있습니다 ....

Results

화산 플롯과 Venn 다이어그램이 특히 사용되는 차동 식 분석의 결과를 시각화하는 다양한 접근 방식이 있습니다. 림마는 |로그FC|≥2와 adj를 가진 CHOL과 정상 조직 사이 3323개의 DEG를 확인했습니다. P.Val<0.05는 임계값으로, 그 중 1880은 CHOL 조직에서 하향 조절되었고 1443은 업규제(그림 1a)였다. 한편, EdgeR은 1578개의 다운 규제 DEGs와 3121개의 업 규제 DEGs(그림1b);를 확인했습니다. DESeq2는 1616개의 하향 규제 DEGs와 2938개의 UP-regulated DEGs(그림1c)를 확인했습니다. 이들 세 가지 방법의 결과를 비교하면, 1431개의 상향 조절 된 DEGs 와 1531 개의 다운 규제 DEGs가 겹쳐졌다(그림 2).

Discussion

암에 있는 풍부한 수차성 전사체는 RNA-seq 차동 분석에 의해 쉽게 확인할 수 있습니다^5. 그러나, RNA-seq 차동 발현 분석의 적용은 R 언어와 적절한 방법을 선택할 수 있는 특정 능력을 필요로 하기 때문에 종종 제한됩니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 RNA-seq 차동 발현 분석을 적용하기위한 세 가지 가장 잘 알려진 방법 (limma, EdgeR 및 DESeq2)에 대한 자세한 소개및 자습서를 제공합니다. 이를 통해 세 가지 방법 모두에 걸쳐 유사점과 차이점을 쉽게 이해하고 개별 데이터에 적합한 방법을 선택할 수 있으며 복잡한 동적 생물학적 과정을 이해할 수 있습니다.

여기서, 우리는 각각 리마, EdgeR 및 DESeq2를 통해 RNA-seq 차동 발현 분석을 위한 상세한 프로토콜을 제시합니다: (i) 데이터의 다운로드 및 사전 처리, (ii-iv) 리마를 통한 차동 발현 분석, (ii-iv) 리마, 에지R 및 DE.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
R		버전 3.6.2	자유 소프트웨어
Rstudio			자유 소프트웨어