췌장 인트라바이탈 이미징 창이 있는 뮤린 모델에서 췌장의 생체 내 세포 수준 시각화안정화

요약

췌장의 생체 내 고해상도 이미징은 췌장 내 생체 내 이미징 창으로 촉진되었다.

초록

살아있는 작은 동물 모형에 있는 췌장의 생체 내 세포 분해능 화상 진찰은 기술적으로 도전적이고 있습니다. 복부 화상 진찰 창이 있는 최근 인트라바이탈 화상 진찰 연구 결과는 생체내 복부 기관에 있는 세포 역학의 시각화를 가능하게 했습니다. 그러나, 생리적 운동(예를 들어, 연동성 및 호흡)에 의해 쉽게 영향을 받을 수 있는 마우스 췌장의 연약한 시트 와 같은 아키텍처로 인해, 마우스 췌장에 있는 섬 또는 암세포를 식별, 추적 및 정량화하기 위해 세포 수준에서 몇 주 동안 생체 내 이미징에서 안정화된 세로를 수행하기가 어려웠다. 본명, 췌장 미세구조의 경도 경과 내인스탈 이미징을 위해 췌장을 창자로부터 공간적으로 분리할 수 있는 새로운 지지기반, 통합췌장 내 인트라바탈 이미징 창을 이식하는 방법을 설명한다. 이미징 창을 가진 생체 내 생체 내 이미징은 안정적인 시각화를 가능하게 하여 3주 동안 의 섬 추적과 미세 구조의 고해상도 3차원 이미징을 허용하며, 여기서 입증된 바와 같이 치열토성 췌장암 모델에서 입증된다. 우리의 방법을 사용하여, 추가 인트라바이탈 이미징 연구는 세포 수준에서 췌장을 포함하는 각종 질병의 병생리학을 해명할 수 있습니다.

서론

췌장은 소화관에 있는 외분 염 기능 및 혈 류로 호르몬을 분비의 내 분 비 기능을 가진 복 기관. 췌장의 고해상도 세포 화상 진찰은 췌장염, 췌장암 및 당뇨병 mellitus^1을포함하여 췌장을 관련시키는 각종 질병의 병리생리학을 드러낼 수 있었습니다. 컴퓨터 단층 촬영, 자기 분해영상 및 초음파와 같은 기존의 진단 영상 도구는 임상 분야^1,2에서널리 이용된다. 그러나, 이러한 이미징 양식은 구조적 또는 해부학적 변화만을 시각화하는 것으로 제한되며, 세포 또는 분자 수준에서의 변화는 결정될 수 없다. 인간내 당뇨병 또는 췌장암의 분자 변화가 진단^3,4전에 10년 이상 시작할 수 있다는 점을 감안할 때, 잠기 기간 동안 분자 전환에서 췌장질환의 검출은 조기 진단과 적시개입을 제공할 가능성이 있다. 따라서, 해상도의 한계를 극복하고 기능에 대한 귀중한 통찰력을 제공하는 이미징은 당뇨병의 진행 중에 췌장암의 조기 진단 또는 섬 변경의 고급 식별을 제공함으로써 현저하게 주의를 얻을 것이다^5.

특히 섬, 핵 이미징, 생물 발광 이미징 및 광학 일관성 단층 촬영과 함께 비침습적 섬 이미징 기술^6으로제안되었다. 그러나 이러한 방법의 해상도는 수십 에서 수백 마이크로미터에 이르는 일반적인 값으로 실질적으로 낮으며, 섬내 셀룰러 수준에서 변화를 감지하는 제한된 기능을 제공합니다. 다른 한편으로는, 이전 의 고해상도 연구는 전 생체^7,8 (예를 들어, 췌장의 슬라이스 또는 소화), 비 생리⁹ (예를 들어, 췌장의 외부화) 및 이성피 조건^10,11,12 (예를 들어, 신장 캡슐 아래 이식, 간 내, 및 안과 의 안팎의 방안하에 이식) 및 안과 의 안하에 있는 안팎의 해석하에 수행되었다. 고해상도 이미징의 생체 내,생리학적 및 직교 모델을 확립할 수 있다면 췌장 섬 조사를 위한 중요한 플랫폼이 될 것이다.

살아있는 동물의 현미경 해상도 수준에서 병리학을 드러내는 인트라바이탈 이미징은 최근 큰 관심을 받고 있다^13. 생체 내 이미징 방법 중, 마우스의 복부에 창을 이식하는 복부 이미징^창(14)의개발은 새로운 발견(즉, 초기 간 전이의 사전 미세메타증 단계^및 장 상피^16)에서줄기 세포 유지 장치의 메커니즘을 발견할 수 있게 하였다. 복부 화상 진찰 창은 귀중한 결과를 제공하지만, 췌장에 대한이 창의 응용 프로그램과 췌장을 포함하는 질병에 기초한 그 결과 중요한 화상 진찰 연구는 광범위하게 조사되지 않았습니다.

인간 췌장의 잘 정의된 고체 장기 특성과는 달리, 마우스의 췌장은 확산분포된 연조직형^{구조(17)이다.} 따라서 연동 및 호흡을 포함한 생리적 움직임에 끊임없이 영향을 받습니다. 췌장에 대한 복부 이미징 창의 적용에 대한 이전 연구는 배회가 배변^(18)에의해 유도된 운동 유물로 인해 발생한다는 것을 입증했다. 심한 흐림은 마이크로 스케일 구조의 시각화 및 식별을 방해하는 결과 평균 이미지에서 관찰되었다.

본명, 췌장과 관련된 질병의 종방향 세포 수준 사건을 조사하기 위해^19,20의 인포탈 현미경 검사법과 결합된 새로운 지지 기체 통합 췌장 내 인트라바이탈 이미징 창의 사용을 설명한다. 이전 연구^18의방법론에 대한 상세한 설명 외에도 췌장과 관련된 다양한 질병에 대한 췌장 이미징 창의 확장된 적용이 이 논문에서 해결될 것이다. 이 프로토콜에서는 맞춤형 비디오 속도 레이저 스캐닝 공초점 현미경 시스템을 중요한 현미경 시스템으로 활용했습니다. 4개의 레이저 모듈(405, 488, 561, 640 nm의 파장)이 여기원으로 활용되었고, 밴드패스 필터(BPF1: FF01:FF01-442/46)를 통해 광증관(PMT)에 의해 4개의 방출 신호 채널이 검출되었다. BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). 레이저 스캐닝은 회전다각형 거울(X축)과 갈바노미터 스캐닝 미러(Y축)로 구성되어 비디오 속도 스캔(초당 30프레임)을 가능하게 했습니다. 인트라바이탈 현미경 검사법에 대한 자세한 정보는 이전 연구에서 기재되어^{있다(10,18,19,20,21,22,23)}.

우리의 이전 섬 연구^18에서,우리는 성공적으로 안정적으로 섬이 GFP로 태그된 형질 마우스 모델 (MIP-GFP)^24를 사용하여 살아있는 마우스에서 섬을 이미지화. 이 방법을 사용하면 1주일 동안 섬의 변경 내용을 고해상도 시각화할 수 있었습니다. 또한 당뇨병의 발병기 동안 기능 추적 또는 모니터링을 위한 췌장 섬의 장기 연구의 타당성을 건의하는 최대 3주 동안 동일한 섬의 이미징을 촉진했다^18. 더욱이, 우리는 형광 췌장암세포(PANC-1 NucLight Red)^25가 마우스의 췌장에 직접 이식되는 직소 췌장암 모델을 개발하였다. 췌장 내 인트라베이시브 이미징 창의 적용으로, 이 모형은 췌장암의 종양 미세 환경에서 세포 및 분자 병생리학을 조사하고 새로운 약 후보의 치료 감시를 위한 플랫폼으로 이용될 수 있었습니다.

프로토콜

이 논문에 설명된 모든 절차는 실험실 동물 관리 및 사용 가이드 8제1판(2011)^26에 따라 진행되었으며, 한국과학기술원(KAIST)과 서울대학교 분당병원(SNUBH)의 기관동물관리 및 이용위원회의 승인을 받았습니다.

1. 창 및 기타 재료의 준비

1. ^{복강(18)의} 창자로부터 췌장을 한적한 폐적하기 위해 췌장 내 화상 진찰 창을 사용자 정의설계(도 1A,B). 창의 상세한 청사진은 이전 연구^18의보충 그림에 설명된다.
2. C57BL/6N 마우스를 사용 하 여, 8-12 주 된 남성, 중요 한 췌 장 이미징에 대 한. 알카 647 플루오로포어와 결합된 항 CD31 항체를 영상 촬영 전 2시간, 용기 라벨링^18을목적으로 한다.
3. 섬 연구를 위해, 섬이 형광 기자 단백질로 태그되는 형질 마우스 모델을 준비한다. 여기서, 우리는 MIP-GFP를 이용했는데, 여기서 녹색 형광 단백질은 마우스 인슐린 1 유전자 프로모터의 통제 하에 발현되었으며, 이는^{마우스(24)의}모든 섬의 베타 세포에서 활성화된다.
4. 췌장암 연구를 위해 형광 기자 단백질과 BALB/C 누드 마우스로 태그된 형질암세포를 준비하십시오. 이 연구에서는 PANC-1 NucLight 적색 세포가 사용되었습니다. PANC-1^{암세포(25)는} NucLight 적색 형광 프로브로 표지되었다.
5. 모든 수술 도구, 커버 글래스(PEG 여부) 및 자동 클래브를 사용하여 이미징 창을 살균합니다.
6. 페그 코팅을 커버 글래스에 적용하여 염증 반응을 방지하고 생체 적합성을 증가시며 장기적인 이미징에 적합합니다.

2. 수술

1. 멸균 수술 플랫폼을 준비하고 70 %의 에탄올로 표면을 살균하십시오.
   참고: 세로 이미징 세션의 경우 무균 기술이 필수적입니다.
2. 틸타민/졸라제팜(30 mg/kg)과 자일라진(10 mg/kg)을 혼합하여 쥐를 마취시합니다.
   참고: 타일타민/졸라제팜의 사용은 고혈당증의 부작용 때문에 케타민 대신 에 권장 됩니다. 최적의 마취는 실험^9,27의목적을 위해 선택되어야 한다.
3. 홈더믹 제어 가열 패드가 있는 직장 프로브를 사용하여 체온을 모니터링합니다.
4. 마우스의 왼쪽 측면을 면도하고 교대술과 요오드 기반 스크럽의 세 라운드를 적용합니다.
   참고: 디필 크림을 사용하는 경우 화학 적 화상을 피하기 위해 1 분 이상 방치하지 마십시오.
5. 마우스의 왼쪽 측면에 1.5cm 절개를 하고 피부와 근육을 해부합니다.
6. 절개 여백에서 검은 색 또는 나일론 4-0 봉합사와 지갑 문자열 봉합사를 수행합니다.
7. 절개에 마이크로 리트랙터를 사용하고 부드럽게 비장을 노출.
8. 조심스럽게 링 집게로 비장을 풀링하고 췌장을 식별합니다.
9. 창을 마우스 측면에 놓고 비장과 췌장을 창의 열린 공간을 통과합니다. 췌장의 조작은 출혈이나 췌장염을 일으킬 수 있으므로 매우 이방적이어야합니다.
10. 화상 진찰 창의 접시에 췌장을 부드럽게 놓습니다. 비장은 창의 열린 공간에 배치됩니다.
11. 암 세포 연구를 위해 PANC-1 NucLight Red(1.0 x 10⁶ 세포)를 췌장에 직접 주입하십시오.
    참고: 직교 인간 췌장암 이종이식을 이미징하기 위해 PANC-1 또는 다른 인간 췌장암 세포와 같은 암세포의 직접 이식이 촉진될 수^{있다 28.} 중요한 형광 현미경으로 시각화하기 위해 PANC-1 세포는^핵(29)에라벨을 붙이는 NucLight Red lentiviral 시약을 사용하여 적색 형광 단백질로 변형되었다. 최대 사출 부피는 불확실하지만 췌장의 압력 효과를 피하기 위해 가능한 한 볼륨을 줄입니다.
12. 이미징 창의 여백에 N 부틸 시아노아크라일트 접착제 방울을 발라주세요.
    1. 적용된 접착제의 양을 최소화하려면 31 G 카테터 바늘을 사용하여 응용 프로그램에 사용하십시오. 낙하량이 크면 조직은 의도치 않게 창이나 덮개 유리를 부착합니다.
13. 이미징 창의 여백에 12mm 원형 커버 글래스를 부드럽게 발라주세요.
14. 봉합사 루프를 당겨 창의 측면 홈에 맞고 세 번 묶습니다.
15. 이 마우스가 깨어있을 때 단단한 바늘의 중단을 방지하기 위해 매듭의 최대 근접 부위를 잘라.
16. 마우스가 마취(2-3시간)에서 회복하고 케토프로펜(5 mg/kg, 동물의 목 또는 엉덩이의 밑에 느슨한 피부에 피하)을 주입하여 통증 완화를 허용합니다. 12시간마다 통증의 징후를 재평가하고 케토프로펜은 1-3일 동안 24시간마다 고려해야 합니다.
    참고: 진통증은 포도당^9에반응하여 인슐린 분비에 영향을 미친다. 진통제의 선택과 타이밍은 실험적 목적을 위해 개별화되어야 합니다.
17. 케이지에 있는 창의 접촉을 피하기에 충분한 침구로 마우스를 수용합니다. 창 수술없이 쥐와 집을 주택하지 마십시오.

3. 인트라바이탈 이미징

1. 레이저 전원을 포함한 중요한 현미경을 켭니다.
2. 가열 패드를 켜고 홈더믹 레귤레이션을 37 °C로 설정합니다.
   참고: 또는 홈더믹 규정이 없는 경우 수동 가열 패드 나 램프를 자주 제어 할 수 있습니다.
3. 틸타민/졸라제팜(30 mg/kg)과 자일라진(10 mg/kg)의 혼합물로 근육 질증을 수행합니다.
   참고: 타일타민/졸라제팜의 사용은 고혈당증의 부작용 때문에 케타민 대신 에 권장 됩니다. 최적의 마취는 실험^9,27의목적을 위해 선택되어야 한다.
4. 주사를 위해 혈관 카테터를 삽입합니다.
   1. 지혈대 응용 프로그램의 대안으로 인덱스와 세 번째 손가락으로 꼬리의 근위 측에 압력을 가하십시오. 필요한 경우 꼬리를 램프로 가열합니다.
   2. 70% 에탄올 스프레이로 꼬리 정맥을 살균합니다.
   3. 측면 꼬리 정맥에 30 G 카테터를 삽입합니다. 혈액의 역류는 PE10 튜브에 시각화됩니다.
   4. 카테터에 실크 테이프를 바르면 안정화하십시오.
   5. FITC/TMR dextran 또는 기타 형광 프로브(알렉사 647와 결합된 안티 CD31의 25 μg)를 적절히 주입하여^{형광 프로브(18)의}조합에 따라 적절히 주입한다.
      참고: 형광 컨쥬게이드 항체 프로브의 경우 이미징 세션 전에 2h를 주입하십시오.
5. 수술 플랫폼에서 이미징 단계로 마우스를 전송합니다.
6. 직장 프로브를 삽입하여 홈더믹 가열 패드 시스템으로 체온을 자동으로 제어합니다.
7. 췌장 이미징 창을 인트라비티 현미경설정(도 2)동안준비된 창 홀더에 삽입합니다. 반전된 현미경의 경우 창 홀더가 필요하지 않을 수 있습니다.
8. 인트라바이탈 이미징을 수행합니다.
   1. 췌장 이미징의 경우 췌장 이미징 창(권장 시야: 2500 x 2500 μm)에서 췌장의 전체 보기를 스캔하기 위한 낮은 배율 목표 렌즈(예: 4x)로 시작합니다.
   2. 관심 영역을 결정한 후, 더 높은 배율 목표 렌즈(20x 또는 40x)로 전환하여 셀룰러 레벨 이미징(권장 시야: 500 x 500 μm 또는 250 x 250 μm)을 수행합니다. 이 실험에서, 측면 및 축 분해능은 각각 약 0.5 μm 및 3 μm이었다.
   3. z 스택 또는 시간 경과 이미징을 수행하여 세포 마이그레이션과 같은 3D 구조 또는 세포 수준 역학을 관찰합니다.
      참고: 형질전환 동물의 세포를 발현하는 형광 단백질(MIP-GFP)을 이미징하기 위해, 30초의 간헐적인 488nm 레이저 노출은 최대 0.43mW의 전력을 가진 눈에 띄는 광표백 또는 조직 손상 없이 견딜 수 있었다. Alexa 647로 표시된 형광 단백질을 이미징하기 위해 640 nm 레이저 전력은 최대 0.17mW까지 눈에 띄는 광표백 또는 조직 손상 없이 견딜 수 있었습니다. 이 설정 위의 힘으로 장기간 흥분 레이저 노출광 독성에 의해 광 표백 또는 조직 손상으로 이어질 수 있습니다. 적절한 이득과 힘을 조정하여 관심 영역을 적절하게 이미지화합니다. 인트라베이티 현미경 검사법의 파라미터의 상세한 설정은 연구소에서 제조된 각 인트라베이티 현미경 검사법에 대해 개별화되어야 합니다.

결과

서포트베이스 통합 췌장 인내 영상 창과 결합된 인트라바이탈 현미경 검사는 마우스에 있는 췌장의 세로 세포 수준 이미징을 가능하게 합니다. 췌장 내 인트라바이탈 이미징 창을 가진 이 프로토콜은 고해상도 이미징을 획득하여 최대 3주 동안 개별 섬을 추적할 수 있는 장기 조직 안정성을 제공합니다. 그 결과, 확장된 시야를 위한 모자이크 이미징, z-스택 이미징의 3차원(3D) 재구성, 동일한 위치의 세로 추적을 달성할 수 있다. 또한, 당사의 중요 내 현미경 검사는 4개의 채널(405, 488, 561 및 647 nm)의 획득을 제공하여 상호 작용과 동시에 다중 세포 시각화를 가능하게 합니다.

예비 이미징의 경우, 창은 알렉사 647 플루오로호레와 결합된 항 CD31 항체를 정맥 주사한 C57BL/6N 마우스에 이식되었다. 췌장의 광역영상(도 3A)및 확대된 3D 이미징(도3B-D, 보충 비디오 1)은...

토론

여기서 설명된 프로토콜은 복부 화상 진찰 창에서 변형된 새로운 지지 기지 통합췌장 내 화상 진찰 창을 사용하여 췌장의 인트라비티 이미징으로 이루어져 있습니다. 위에서 설명한 프로토콜 중, 첫 번째 중요한 단계는 마우스에 있는 중요한 췌장 화상 진찰 창의 이식입니다. 창에 접착제를 적용하기 위해, 창의 여백과 커버 유리 사이에 접착제를 적용하는 것이 중요하지만 췌장 조직에는 그렇지 않으며, 이는 중요한 이미징을 현저히 방해할 수 있기 때문에. 유리와 조직 사이의 접착제 자체뿐만 아니라 접착이 조직에 직접 적용되는 경우 내부 먼지 입자는 이미징 중에 빛이 산란을 유도할 수 있습니다. 또한 접착제의 적용은 췌장에 독성 및 비생리적 영향을 미칠 수 있다.

두 번째 단계는 금속 지지 기판에 배치된 췌장 조직의 양입니다. 췌장 조직은 시트와 같은 구조이기 때문에 플레이트의 췌장 조직의 양을 제어해야합니다. 너무 큰 부피가 접시에 놓이면 링의 여백에 적용된 접착제가 조직을 부착할 수 있으며 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Alexa Fluor 647 숙시니미딜 에스테르(NHS 에스테르)	Invitrogen	A20006	항체와 접합용 형광 프로브
BALB/C 누드	OrientBio	BALB/C 누드	BALB/C 누드
BD 인트라메딕 폴리에틸렌 튜빙	BD Biosciences	427401	PE10 카테터, 바늘 연결용
C57BL/6N	오리엔트바이오	C57BL/6N	C57BL/6N
커버 안경 원형	Marienfeld	0111520	췌장 이미징 창용 커버 유리
FITC Dextran 2MDa	Merck (Former Sigma Aldrich)	FD200S	혈관 식별용
IMARIS 8.1	Bitplane	IMARIS	이미지 처리
생체 내 현미경	IVIM 기술	IVM-C	생체 내 현미경 IRIS
가위	JEUNGDO 바이오 & PLANT CO, LTD	S-1107-10	본 제품은 타사의 제품으로 교환 가능
Loctite 401	Henkel	401	N-butyl cyanoacrylate glue
Micro Needle holder	JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD	H-1126-10	본 제품은 타사
Micro rectractor	JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD	17004-03	본 제품은 타사
Microforceps	JEUNGDO BIO & 제품의 제품으로 교체 가능합니다. PLANT CO, LTD	F-1034	이 제품은 타사
MIP-GFP	The Jackson Laboratory	006864	. Cg-TG(Ins1-EGFP)1Hara/J
Nylon 4-0	AILEE	NB434	Non-Absorbable Suture
Omnican N 100 30G	B BRAUN		혈관 카테터의 경우 바늘 부분만 사용
PANC-1 NucLightRed	맞춤형	맞춤형	Made in laboratory
췌장 이미징 창	금토엔지니어링	맞춤형 주문	췌장 이미징 창 - 맞춤 주문
Physiosuite	Kent Scientific	PS-02	동종 온도 컨트롤러
정제 NA/LE 쥐 안티 마우스 CD31	BD Biosciences	553708	생체 내 혈관 라벨링용 항체
링 집게	JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD	F-1090-3	이 제품은 타사의 제품으로 교체 할 수 있습니다
Rompun	Bayer	Rompun	마취제
TMR Dextran 65-85kDa	Merck (Former Sigma Aldrich)	T1162	용기 식별
용 창 홀더	금토 엔지니어링	맞춤 주문	창 홀더 - 맞춤 주문
Zoletil	Virbac	Zoletil 100	마취제