이 논문은 고정 밀도를 가진 포획 구슬의 부양 높이의 변화를 정량화하여 용해성 또는 멤브레인 바운드항원들의 존재를 구체적으로 검출할 수 있는 자기 부양 기반 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
설명된 방법은 자기 적 부상의 원리에 기초하여 개발되었으며, 이는 밀도와 자기 특성에 따라 세포와 입자를 분리합니다. 밀도는 그 대사 속도, 분화 및 활성화 상태와 직접적으로 관련된 특성을 식별하는 세포 유형입니다. 자기 부양은 순환 혈액 세포를 성공적으로 분리, 이미지 및 특성화하고 빈혈, 겸상적혈구 질환 및 밀도 및 자기 특성에 따라 순환 종양 세포를 검출하는 1 단계 접근법을 허용합니다. 이러한 접근법은 또한 각각 포획 및 검출 항체로 코팅된 저밀도 비드 세트를 사용하여 용액에 존재하는 수용성 항원들을 검출할 수 있다. 항원이 용액에 존재하는 경우, 두 세트의 구슬을 교개하여 항체 코팅 구슬의 행 사이에 부과되는 새로운 구슬 비드 복합체를 생성합니다. 용액에서 표적 항원의 농도가 증가하면 항원 농도가 낮아지면 더 많은 수의 비드 비드 복합체가 생성되어 표적 항원의 정량적 측정이 가능합니다. 자기 부상은 감소된 시료 준비 시간과 고전적인 판독 방법에 대한 의존도 부족으로 인해 다른 방법에 유리하다. 생성된 이미지는 스마트폰이나 태블릿과 같은 표준 현미경 또는 모바일 장치를 사용하여 쉽게 캡처및 분석할 수 있다.
서론
자기부상은 세포 유형1,2,3,단백질4,5 및 오피오이드6을 특정 밀도 및 파라자성 특성에 기초하여 분리, 분석 및 식별하도록 개발된 기술입니다. 세포 밀도는 대사율 및 분화상태7,8,9,10,11,12,13,14와직접 관련된 각 세포 유형의고유하고본질적인 특성이다. 꾸준한 상태 조건 동안 세포 밀도에 미묘 하 고 일시적인 변화를 정량화, 그리고 다양 한 세포 과정 동안, 세포 생리학 및 병리 생리학에 대 한....
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프로토콜
이 연구에서 사용된 실험 프로토콜은 베스 이스라엘 Deaconess 의료 센터 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인되었습니다.
1. 악기 설정
참고: 이미징 부양 세포는 자기장을 생성하기 위해 서로 마주보고 동일한 극으로 배치하기 위해 z 축에 자화 된 두 개의 희토류 네오디뮴 자석이 필요합니다. 자석 사이의 거리는 자기장의 강도와 대상의 밀도에 따라 사용자 정의 할 수 있습니다. 이 경우 자석은 50mm 길이의 1x1 mm 제곱 유리 모세관 튜브를 삽입하기에 충분한 1mm 공간으로 분리됩니다. 이 장치는 요청 시 사용할 수 있는 AutoCAD 설계를 사용하여 3D 인쇄되었습니다.
- 현미경을 측면에 완벽하게 수평으로 놓습니다.
참고: 표준 직립 위치에 배치된 현미경은 응축기 및 목표에 대하여 자석의 위치 때문에 응고물 객체를 화상 진찰에 직접 적당하지 않습니다. 이러한 제한은 현미경을 측면에 배치하여 우회할 수 있으며, 완벽하게 수평으로 응축기가 모세관에 빛을 집중할 수 있게 하고, 객관적인 렌즈는 Köhler 조명 요구 사항을 유지하면서 자석 사이에 부풀어 올리는 세포를 이미지화할 수 있습니다. - 2~3개의 랩 잭을 사용하여 브레드보드 테이블에서 스탠....
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결과
자기 부상은 물체의 밀도, 자기 서명, 파라마그네틱 용액의 농도 및 두 개의 강한 희토류 자석에 의해 생성된 자기장의 강도에 따라 서로 다른 굴밀도의 물체를 집중시킵니다. 두 자석이 서로 위에 놓이기 때문에, 시료를 부유시키는 것은 Köhler 조명을 유지하면서, 그 측에 켜진 현미경을 사용하여 볼 수 있습니다(도 1). 각 세포 유형에 의해 도달된 최종 부양 높이는 파라마그네틱 용액의 농도를 변경하여 쉽게 변형될 수 있다. 도 2는 가돌리늄의 다양한 농도를 이용하여 상이한 순환 혈액세포의 분리를 도시한다. 밀도가 다른 두 비드 유형(1.05 및 1.2 g/mL)은 밀도 부양 높이 및 크기 참조를 제공하는 데 사용되었습니다. 주어진 세포 유형의 부양 높이는 본질적인 밀도에 따라 달라지므로 자기 부상은 중요한조작(24)없이관심 있는 세포를 격리하는 직접적인 수단을 제공한다. 이 프로.......
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토론
그라데이션 원심분리는 현재 고유한 밀도를 기반으로 하위 셀룰러 구성 요소를 격리하는 표준 기술입니다. 그러나 이러한 접근 방식은 전문 그라데이션 미디어와 원심분리기 장비를 사용해야 합니다. 여기에 제시된 자기 부양 접근법은 순환 세포의 형태학적 및 기능적 특성에 대한 상세한 조사를 최소한으로 허용하며, 세포의 조작이 있는 경우 순환 세포에 대한 생체 내 접근을 제공한다.
그러나 자기 부상을 사용할 때 몇 가지 점을 언급 할 가치가 있습니다. 첫째, 이미징에 사용되는 현미경은 설정이 시간이 많이 걸리기 때문에 이 방법에 전념해야 하며, 현미경이 부분적으로 분해되고 자석과 모세관 튜브와 정확하게 정렬된 광학과 수평으로 완벽하게 배치되어야 합니다. 둘째, 실험실 잭과 모세관 유리의 움직임을 조정하는 데 사용되는 번역 단계와 초점은 세 축 각각에 정확한 위치와 자유로운 움직임이 필요합니다. 아마도 전체 설정의 가장 중요한 정렬은, 상단 및 하단 자석이 완벽하게 수평뿐만 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 충돌이 없습니다.
감사의 글
저자는 세포 외 소포 작업에 대한 그의 도움에 대한 박사 Getulio 페레이라에게 감사드립니다.
이 작품은 ICG에 다음과 같은 국립 보건 원에 의해 지원되었다: RO1CA218500, UG3HL147353, UG3TR002881.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2 (N-Morpholino) ethanesulfonic 산성 수화물 | 시그마 Aldrich | M-2933 | (MES); 활성화 완충기 |
| 50x2.5x1 mm 자석, 도금된 니켈 (Ni Cu Ni), 급료 N52, 5mm (0.197") 간격 K&를 통해 자화되는 | ; J Magnetics | 맞춤형 | 자석 자기 부상 장치에 사용 |
| 모세관 실란트 (Critoseal) | Leica Microsystems | 267620 | 모세관 끝을 덮는 데 사용 |
| 원심 분리기 튜브 필터 (Corning Costar Spin-X)Sigma | Aldrich | CLS8163 | 비드 세척에 사용 |
| Compact Lab Jack | Thorlabs | LJ750 | 자기 부상 장치 조정에 사용 |
| DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음 | Gibco | 14190-144 | 비드 현탁액용 솔루션 |
| 에탄올아민 | 시그마 알드리치 | E9508-100ML | 비드 세척 단계에서 사용 |
| 형광 플라즈마 멤브레인 염색제(CellMask Green) | Invitrogen | C37608 | Rh+ 세포 염색에 사용 |
| 가도테리돌 주입 | ProHance | NDC 0270-1111-03 | 가돌리늄 (Gd3+); 세포를 현탁시키는 데 사용되는 자성 용액 |
| HBSS++ | Gibco | 14025-092 | 시료 준비를 위한 용액 |
| Human C5b,6 complex | Complement Technology, Inc | A122 | RBC Evs |
| Human C7 protein | Complement Technology, Inc | A124 | RBC Evs |
| Human C8 protein | Complement Technology, Inc | A125 | 데 사용 RBC 생성에 사용 Evs |
| Human C9 protein | Complement Technology, Inc | A126 | RBC Evs |
| Mini Series Post Collar | Thorlabs | MSR2 | 자기 부상 장치를 실험실 잭 |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E1769-10G | (EDC)에 고정하는 데 사용; 항체 결합 반응에 사용 |
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| 폴리소르베이트 20(트윈 20) | Sigma Aldrich | P7949-500ML | 활성화 완충액의 구성 요소 |
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참고문헌
- Tasoglu, S., et al. Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution. Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).
- Durmus, N. G., et al. Magnetic levitation of single cells. Proceedings of the National Academy of Sciences o....
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재인쇄 및 허가
