자기 적고를 이용한 세포 밀도 및 항원 적 특성의 정량화

Summary

이 논문은 고정 밀도를 가진 포획 구슬의 부양 높이의 변화를 정량화하여 용해성 또는 멤브레인 바운드항원들의 존재를 구체적으로 검출할 수 있는 자기 부양 기반 방법을 설명합니다.

Abstract

설명된 방법은 자기 적 부상의 원리에 기초하여 개발되었으며, 이는 밀도와 자기 특성에 따라 세포와 입자를 분리합니다. 밀도는 그 대사 속도, 분화 및 활성화 상태와 직접적으로 관련된 특성을 식별하는 세포 유형입니다. 자기 부양은 순환 혈액 세포를 성공적으로 분리, 이미지 및 특성화하고 빈혈, 겸상적혈구 질환 및 밀도 및 자기 특성에 따라 순환 종양 세포를 검출하는 1 단계 접근법을 허용합니다. 이러한 접근법은 또한 각각 포획 및 검출 항체로 코팅된 저밀도 비드 세트를 사용하여 용액에 존재하는 수용성 항원들을 검출할 수 있다. 항원이 용액에 존재하는 경우, 두 세트의 구슬을 교개하여 항체 코팅 구슬의 행 사이에 부과되는 새로운 구슬 비드 복합체를 생성합니다. 용액에서 표적 항원의 농도가 증가하면 항원 농도가 낮아지면 더 많은 수의 비드 비드 복합체가 생성되어 표적 항원의 정량적 측정이 가능합니다. 자기 부상은 감소된 시료 준비 시간과 고전적인 판독 방법에 대한 의존도 부족으로 인해 다른 방법에 유리하다. 생성된 이미지는 스마트폰이나 태블릿과 같은 표준 현미경 또는 모바일 장치를 사용하여 쉽게 캡처및 분석할 수 있다.

Introduction

자기부상은 세포 유형^1,2,3,단백질^4,5 및 오피오이드^6을 특정 밀도 및 파라자성 특성에 기초하여 분리, 분석 및 식별하도록 개발된 기술입니다. 세포 밀도는 대사율 및 분화상태^{7,8,9,10,11,12,13,14와}직접 관련된 각 세포 유형의^고유하고본질적인 특성이다. 꾸준한 상태 조건 동안 세포 밀도에 미묘 하 고 일시적인 변화를 정량화, 그리고 다양 한 세포 과정 동안, 세포 생리학 및 병리 생리학에 대 한 타의 추종을 불허 하는 통찰력을 감당할 수 있습니다. 세포 밀도의 변화는 세포분화(15,^16,세포 주기 진행^9,17,18,19,세포 세포세포^{20,21,22, 23}및 악성 변환^{24,25,26)와 연관된다.} . 따라서, 세포 밀도의 특정 변화의 정량화는, 다양한 활성화 과정을 겪고 있는 세포의 동일 모형 사이에서 차별할 뿐만 아니라, 다른 모형의 세포를 분화하기 위하여 이용될 수 있다. 이를 통해 특정 세포 하위 집단을 대상으로 하는 실험을 가능하게 하며, 밀도의 동적 변화는 변화된 세포^{대사(27)의}지표역할을 한다. 변화하는 환경에 대응하여 세포가 밀도를 변경할 수 있다는 것이 확립된 바와 같이^7,그 밀도와 관련하여 세포의 역학을 측정하여 이를 완전히 이해하는 것이 필수적이며, 현재 의 방법은^12를제공하지 않을 수 있다. 반면에 자기 부상은 세포 및 그^{성질(28)의}동적 평가를 허용한다.

세포는 영구적인 자기 이폴 순간이 없다는 것을 의미하는 다각성입니다. 그러나, 외부 자기장에 노출되면, 약한 자기 이폴 모멘트는 적용된 필드의 반대 방향으로, 세포에서 생성된다. 따라서, 세포가 파라마그네틱 용액에서 중단되고 강한 수직 자기장에 노출된 경우, 자기 원에서 벗어나 높이로 멈추게 되며, 이는 주로 개별 밀도에 따라 달라집니다. 두 가지 기준이 충족될 때 불균일 자기장의 최소에 국한된 물체의 다이내자기 부유가 가능합니다: 1) 입자의 자기 감수성은 주변 매체보다 작아야 하며, 2) 자기력은 입자의 부력력에 대항할 만큼 충분히 강해야 한다. 두 기준 모두 자기 완충에서 RBC를 일시 중단하고 작고 저렴하며 시판되는 영구 자석^1을가진 강력한 자기장 그라데이션을 만들어 달성 할 수 있습니다. 중력방향을 따라 축상에 자기적으로 갇힌 입자의 평형 위치는 밀도(버퍼밀도에 비해), 자기 감수성(완충의 자기 감수성에 대한) 및 적용된 자기장의 시그니처에 의해 결정된다. 용액의 밀도와 자기 특성이 시스템 전반에 걸쳐 일정하기 때문에, 세포의 본질적인 밀도 특성은 덜 조밀한 세포에 비해 더 낮은 상승하는 조밀한 세포와 함께 세포의 부양 높이를 결정하는 주요 요인이 될 것이다. 이 방법은 밀도 측정을 위해 정밀하고 비율 측정 분석을 사용할 수 있는 두 개의 밀도 참조 구슬(1.05 및 1.2 g/mL) 집합을 사용합니다. 자기 용액의 농도를 변경하면 순환 세포의 밀도가 세포에 특정이므로 CBC에서 RBC와 같은 다른 세포 집단을 분리하여 격리 프로토콜 또는 기타 세포 조작의 필요성을 제거할 수 있습니다.

생물학 연구에 사용되는 검출 방법의 대부분은 선형 신호를 정량화하기 쉬운 특정 결합 이벤트의 추정에 의존한다. 이러한 판독 방법은 종종 복잡하고 특수 장비 및 전담 과학 인력이 포함됩니다. 세포의 혈장 막또는 세포외 소포의 혈장 막에서 발견되거나 플라즈마에서 용해되는 항원의 검출을 겨냥한 접근법은 하나 또는 두 개의 항체 코팅 구슬을 사용하여 본원에 설명되어 있습니다. 구슬은 서로, 심문대상의 밀도가 서로 달라야 한다. 임의의 주어진 생체 유체에서 표적 항원의 존재는 검출 비드에 바인딩되는 항원 양성 세포의 부양 높이에 있는 특정, 측정 가능한 변화로 변환됩니다. 용해성 항원 또는 세포 외 소포의 경우, 비드 세포 복합체가 아닌 비드 비드 복합체를 형성하여 포획 및 검출 비드 모두에 바인딩됩니다. 부양 높이의 변화는 비드 셀 또는 비드 비드 복합체의 새로운 밀도에 따라 달라집니다. 생물유체에서 항원의 존재를 나타내는 복합체의 부양 높이의 변화 외에도, 복합체의 수는 표적의 양에도 의존하여 자기 적 발화를 하는 것 또한 항원^{검출(24)에}대한 정량적 접근법이다.

Protocol

이 연구에서 사용된 실험 프로토콜은 베스 이스라엘 Deaconess 의료 센터 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인되었습니다.

1. 악기 설정

참고: 이미징 부양 세포는 자기장을 생성하기 위해 서로 마주보고 동일한 극으로 배치하기 위해 z 축에 자화 된 두 개의 희토류 네오디뮴 자석이 필요합니다. 자석 사이의 거리는 자기장의 강도와 대상의 밀도에 따라 사용자 정의 할 수 있습니다. 이 경우 자석은 50mm 길이의 1x1 mm 제곱 유리 모세관 튜브를 삽입하기에 충분한 1mm 공간으로 분리됩니다. 이 장치는 요청 시 사용할 수 있는 AutoCAD 설계를 사용하여 3D 인쇄되었습니다.

1. 현미경을 측면에 완벽하게 수평으로 놓습니다.
   참고: 표준 직립 위치에 배치된 현미경은 응축기 및 목표에 대하여 자석의 위치 때문에 응고물 객체를 화상 진찰에 직접 적당하지 않습니다. 이러한 제한은 현미경을 측면에 배치하여 우회할 수 있으며, 완벽하게 수평으로 응축기가 모세관에 빛을 집중할 수 있게 하고, 객관적인 렌즈는 Köhler 조명 요구 사항을 유지하면서 자석 사이에 부풀어 올리는 세포를 이미지화할 수 있습니다.
2. 2~3개의 랩 잭을 사용하여 브레드보드 테이블에서 스탠드를 지원하고 레벨.
3. 진동을 제한하려면 고무 가미 된 발로 브레드 보드 테이블을 지원합니다.
4. 스테이지를 제거하고 부양장치(y축)의높이를 조정하기 위한 컴팩트한 랩 잭과 2개의 단일 축 번역 단계로 교체한다. 초점(z축)을조정하기 위한 것, 그리고 두 번째는 모세관 튜브를 스캔한다.
5. 두 개의 미니 시리즈 광학 포스트를 사용하여 자기 부상 장치를 실험실 잭에 부착합니다.

2. 카복시 미세 입자 / 구슬에 항체의 결합 (폴리안에 의해 프로토콜에서 수정)

참고: 저밀도 구슬(1.05g/mL)만 Rh(+) 검출을 위해 코팅해야 하지만, 세포외 소포를 검출하기 위해 고밀도 및 저밀도 구슬을 코팅합니다.

1. 비드 서스펜션의 1 mg 상당을 꺼내 서 활성화 버퍼의 0.5 mL에 추가 (50 mM MES (MW195.2, 9.72 mg 에 1 mL)) pH 5.0 및 0.001% 폴리소르 바테-20).
2. 갓 만든 1.5 M EDC (MW 191.7, 0.28755 g 1 mL)와 얼음 차가운 물에 0.3 M Sulfo-NHS (MW 217.14, 0.0651 g)의 12 μL을 추가하십시오.
3. 궤도 셰이커에 튜브를 놓고 실온에서 1 시간 동안 격렬하게 흔들어 구슬에 카복실 그룹을 활성화하십시오.
4. 결합 버퍼의 0.5 mL (10x PBS, 또는 0.1 M 인산염 pH 7-9)를 추가하여 1 시간 후에 활성화를 중지합니다.
5. 10분 동안 20,000 x g에서 원심분리하여 구슬을 펠렛하거나, 구슬을 펠렛할 수 없는 경우 0.45 μm 원심분리기 튜브 필터를 사용합니다. 슈퍼나플로루를 흡인한다.
6. 비드를 10x PBS 1mL로 3배, 2.5단계로 씻어낸다.
7. mg 구슬 당 항체의 25 μg를 계산하고 10X PBS에서 0.7-1.0 mg/mL 최종 항체 농도로 활성화된 구슬과 원하는 항체를 혼합합니다.
8. 튜브를 저속으로 설정된 튜브 로커에 놓습니다. 커플링을 위해 밤새 실온에서 튜브를 부드럽게 굴려보십시오.
9. 2.5단계를 반복하고 10x PBS의 1mL로 구슬을 두 번 씻으세요.
10. 완충 pH 8.0에서 0.5mL(98% 재고 = 16.2M)로 세척하여 실온에서 1시간 동안 1h로 부드럽게 흔들어 주세요.
11. 2.5단계를 반복하고 DPBS 의 1mL에서 한 번 구슬을 씻으세요. 구슬은 필요할 때까지 4°C에서 DPBS의 200 μL에 보관할 수 있습니다.
    참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.

3. Rh (+) 검출을 위한 혈액 의 수집 및 준비

1. 한 번의 클릭 으로 랜싱 장치를 사용하여 Rh (+) 기증자의 손가락을 찌르고 10 μL의 혈액을 DPBS 1 mL로 수집합니다.
2. 형광 혈장 막 얼룩을 가진 Rh+ 세포를 얼룩. 선택적으로, Rh+ 세포의 1mL 현탁액에 형광 염료 1μL을 추가합니다(1:1000 희석).
3. 15 분 동안 37 °C에서 형광 염료로 세포를 배양합니다.
4. 15s용 5,600 x g에서 회전하여 세포를 펠렛하고 DPBS 1mL을 사용하여 3번 세척합니다. 칼슘과 마그네슘 (HBSS ++)과 HBSS의 1 mL에서 다시 중단.
5. 원클릭 랜싱 장치를 사용하여 Rh(-) 기증자의 손가락을 찌르고 2 μL의 혈액을 수집합니다.
   참고: 2개 이상의 조건을 준비하는 경우, 각 튜브에 1 μL의 혈액을 추가하기에 충분한 혈액을 모으십시오.
6. 필요한 실험 튜브를 준비하십시오 : 구슬 혼자, IgG 제어, 샘플.
   1. 비드만: HBSS++의 174 μL, IgG 제어 구슬 1μL, 고밀도 구슬 1μL(1.2g/mL), 500m MD 3+(60mMMM)의 24μL을 추가합니다.
   2. IgG 제어: HBSS++의 172 μL, IgG 대조구 1μL, 고밀도 구슬 1μL, Rh-혈액 1 μL, 스테인드 Rh+ 혈액 현탁액 1μL, 500mM Gd^3+의24 μL을 추가합니다.
   3. 샘플 튜브는 HBSS++의 172 μL, 항 RhD 코팅 구슬 1μL, 고밀도 구슬 1μL, Rh-혈액 1μL, 스테인드 Rh(+) 혈액 현탁액 1μL, 500m Gd^3+의24 μL을 추가합니다.
      참고: 고밀도 구슬을 참조하기 위해 Rh 샘플에 추가됩니다.

4. 세포 분리 데모를 위한 PMN 격리

1. 호중구의 고립
   1. 40mL의 정맥혈액을 구연산 나트륨 6mL(0.15M, pH 5.5) 및 6%의 Dextran-70의 14mL을 포함하는 60mL 주사기에 그립니다.
   2. 퇴적물까지 50분 기다립니다.
   3. 피콜-파크 20mL 위에 버피 코트 세포를 천천히 겹쳐서 혈액 수집 튜브를 통해 50mL 튜브를 밀어 퇴적한 RPC로 오염을 피하십시오. 원래 혈액 수집 튜브에 남은 잔류 RBC로 오염을 최소화하기 위해 신선한 혈액 수집 세트를 사용하는 것이 좋습니다.
   4. 3,000 x g에서20 분 동안 원심 분리에 의해 버피 코트 세포를 펠렛. 호중구와 오염 RBC는 튜브의 바닥에 펠릿 것입니다. PBMC는 피콜-파크 위에 흰색 레이어를 형성합니다.
   5. 호중구를 새로운 50mL 튜브로 옮기십시오.
   6. 25초 동안 0.2% 콜드 NaCl 용액의 20mL로 호중구를 배양하고, 1.6%의 추가 20mL를 순으로 배양하여 잔류 RBC를 Lyse. NaCl의 최종 콘서트는 0.9 %(동위)여야 합니다.
   7. 3,000 x g에서10 분 동안 서스펜션원심분리.
   8. 상체를 제거하고 호중구를 원하는 농도로 되감습니다.
2. 림프구의 격리
   1. 6웰 배양판에 5%의 열 비활성화 세럼으로 RPMI의 PBMC를 플레이트.
   2. 플레이트를 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 단핵구는 접시에 부착되며 림프구는 자유롭게 떠있을 것입니다.
   3. 림프구가 들어 있는 버퍼를 제거하고 RPMI로 두 번 세척합니다.
   4. 원하는 농도에서 림프구를 다시 중단합니다.
3. 레이블 RPC, PMN, 림프구.
   1. 각 세포 유형에 다른 형광염으로 라벨을 부착하십시오. 각 염료형은 다른 채널에서 형광을 염색해야 합니다. 선택한 각 염료에 대한 제조업체의 지침을 따릅니다.

5. 보완 활성화를 통한 RBC 세포 외 소포 생성

1. EDTA 튜브를 사용하여 정맥을 통해 전혈을 얻습니다.
2. 백혈구 필터를 통해 혈액을 통과한 다음 원심분리기를 500 x g에서 3번 씩 10분 동안 적혈구를 분리합니다. HBSS++를 세척 버퍼로 사용합니다.
3. 1.5mL 튜브에 100 μL 포장 된 RBC의 알리쿼트를 만들고 HBSS ++를 추가하여 1 mL로 볼륨을 구성합니다.
4. HbSS++에서 0.18 μg/mL 최종 농도에 C5b,6을 추가한 다음 소용돌이를 넣습니다.
5. 실온에서 15분 동안 슬로우 셰이커를 착용하십시오.
6. 0.2 μg/mL의 최종 농도에 C7 단백질을 추가합니다. 튜브를 몇 번 부드럽게 반전시켜 섞는다. 이 시점에서 앞으로 소용돌이하지 마십시오.
7. 튜브를 실온에서 5분 동안 저속으로 설정된 튜브 셰이커에 놓습니다.
8. C8 단백질을 0.2 μg/mL, C9 단백질을 0.45 μg/mL에 추가합니다. 튜브를 몇 번 부드럽게 반전시켜 섞는다.
9. 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
10. 10 분 동안 10,000 x g에서 튜브를 원심 분리합니다.
11. 새로운 튜브에서 EV 함유 상체를 수집합니다. 셀 펠릿에 너무 가까이 있는 상체를 제거하지 마십시오.

6. 자기 부상 장치의 세포 분석

1. 제조업체 지침에 따라 계측기 시동을 수행합니다.
2. 튜브가 채워질 때까지 50 μL의 샘플을 모세관 튜브에 적재합니다. 모세관 실란트로 모세관 관의 끝을 밀봉하여 기포가 없는지 확인하십시오.
3. 모세관 튜브를 상단과 하단 자석 사이의 홀더에 적재합니다. 스테이지와 포커스를 조정하여 최적의 시청을 할 수 있습니다.
   참고: 세포/구슬은 밀도와 GD^3+의농도에 따라 자기 평형 위치에 도달하기 위해 5-20 분에서 어디서나 걸릴 수 있습니다. Gd^3+의농도가 높을수록 시간이 짧아지수 있습니다.

Results

자기 부상은 물체의 밀도, 자기 서명, 파라마그네틱 용액의 농도 및 두 개의 강한 희토류 자석에 의해 생성된 자기장의 강도에 따라 서로 다른 굴밀도의 물체를 집중시킵니다. 두 자석이 서로 위에 놓이기 때문에, 시료를 부유시키는 것은 Köhler 조명을 유지하면서, 그 측에 켜진 현미경을 사용하여 볼 수 있습니다(도 1). 각 세포 유형에 의해 도달된 최종 부양 높이는 파라마그네틱 용액의 농도를 변경하여 쉽게 변형될 수 있다. 도 2는 가돌리늄의 다양한 농도를 이용하여 상이한 순환 혈액세포의 분리를 도시한다. 밀도가 다른 두 비드 유형(1.05 및 1.2 g/mL)은 밀도 부양 높이 및 크기 참조를 제공하는 데 사용되었습니다. 주어진 세포 유형의 부양 높이는 본질적인 밀도에 따라 달라지므로 자기 부상은 중요한^{조작(24)없이}관심 있는 세포를 격리하는 직접적인 수단을 제공한다. 이 프로...

Discussion

그라데이션 원심분리는 현재 고유한 밀도를 기반으로 하위 셀룰러 구성 요소를 격리하는 표준 기술입니다. 그러나 이러한 접근 방식은 전문 그라데이션 미디어와 원심분리기 장비를 사용해야 합니다. 여기에 제시된 자기 부양 접근법은 순환 세포의 형태학적 및 기능적 특성에 대한 상세한 조사를 최소한으로 허용하며, 세포의 조작이 있는 경우 순환 세포에 대한 생체 내 접근을 제공한다.

그러나 자기 부상을 사용할 때 몇 가지 점을 언급 할 가치가 있습니다. 첫째, 이미징에 사용되는 현미경은 설정이 시간이 많이 걸리기 때문에 이 방법에 전념해야 하며, 현미경이 부분적으로 분해되고 자석과 모세관 튜브와 정확하게 정렬된 광학과 수평으로 완벽하게 배치되어야 합니다. 둘째, 실험실 잭과 모세관 유리의 움직임을 조정하는 데 사용되는 번역 단계와 초점은 세 축 각각에 정확한 위치와 자유로운 움직임이 필요합니다. 아마도 전체 설정의 가장 중요한 정렬은, 상단 및 하단 자석이 완벽하게 수평뿐만 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 (N-Morpholino) ethanesulfonic 산성 수화물	시그마 Aldrich	M-2933	(MES); 활성화 완충기
50x2.5x1 mm 자석, 도금된 니켈 (Ni Cu Ni), 급료 N52, 5mm (0.197") 간격 K&를 통해 자화되는	; J Magnetics	맞춤형	자석 자기 부상 장치에 사용
모세관 실란트 (Critoseal)	Leica Microsystems	267620	모세관 끝을 덮는 데 사용
원심 분리기 튜브 필터 (Corning Costar Spin-X)Sigma	Aldrich	CLS8163	비드 세척에 사용
Compact Lab Jack	Thorlabs	LJ750	자기 부상 장치 조정에 사용
DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음	Gibco	14190-144	비드 현탁액용 솔루션
에탄올아민	시그마 알드리치	E9508-100ML	비드 세척 단계에서 사용
형광 플라즈마 멤브레인 염색제(CellMask Green)	Invitrogen	C37608	Rh+ 세포 염색에 사용
가도테리돌 주입	ProHance	NDC 0270-1111-03	가돌리늄 (Gd3+); 세포를 현탁시키는 데 사용되는 자성 용액
HBSS++	Gibco	14025-092	시료 준비를 위한 용액
Human C5b,6 complex	Complement Technology, Inc	A122	RBC Evs
Human C7 protein	Complement Technology, Inc	A124	RBC Evs
Human C8 protein	Complement Technology, Inc	A125	데 사용 RBC 생성에 사용 Evs
Human C9 protein	Complement Technology, Inc	A126	RBC Evs
Mini Series Post Collar	Thorlabs	MSR2	자기 부상 장치를 실험실 잭
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma Aldrich	E1769-10G	(EDC)에 고정하는 데 사용; 항체 결합 반응에 사용
Normal Rabbit IgG Control	R& D Systems	AB-105-C	제어 조건으로 비드 코팅에 사용
인산염 완충 식염수(10X 용액, pH 7.4)	Boston Bioproducts	BM-220	세척 단계에 사용되는 커플링 버퍼의 구성 요소
폴리소르베이트 20(트윈 20)	Sigma Aldrich	P7949-500ML	활성화 완충액의 구성 요소
폴리스티렌 카르복실 폴리머	Bangs Laboratories	PC06004	항체 결합에 사용되는 최고 밀도 비드 (1.05 g / mL)
Rabbit RhD Polyclonal Antibody	Invitrogen	PA5-112694	적혈구에서 Rh 인자의 감지를 위해 비드를 코팅하는 데 사용
연구 학년 현미경	Olympus	Provis AX-70	Sensorsd 자기 부상 장치를 장착하고 공중 부양 세포를 보는 데 사용
고무 댐핑 피트	Thorlabs	RDF1	브레드보드 테이블을 지지하는 데 사용됨
Square Boro Tubing	VitroTubes	8100-050	에 시료를 적재하는 데 사용되는 모세관
Thermoscientific		24510	항체 결합 반응에 사용
Translational Stage	Thorlabs	PT1	초점 및 모세관 스캔에 사용