스핑 고지 질은 인간 질병에서 잘 확립 된 역할을 가진 생리 활성 대사 산물입니다. 질량 분석법으로 조직의 변화를 특성화하면 질병 병인학에서 역할을 밝히거나 치료 표적을 식별할 수 있습니다. 그러나 생물 저장소에서 냉동 보존에 사용되는 OCT 화합물은 질량 분석을 방해합니다. OCT에 내장된 인간 조직의 스핑고지질을 LC-ESI-MS/MS로 분석하는 방법을 간략하게 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
Sphingolipids는 인간의 신진 대사와 질병에서 잘 확립 된 역할을하는 세포 구성 요소입니다. 질량 분석법은 스핑고지질이 질병에서 변경되었는지 여부를 결정하고 스핑고지질이 임상적으로 표적화될 수 있는지 여부를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 수술실에서 직접 조직을 획득하는 적절하게 전원이 공급되는 전향적 연구는 시간이 많이 걸리고 기술적, 물류적, 행정적으로 어려울 수 있습니다. 대조적으로, 후향적 연구는 조직 생물 저장소에서 이미 많은 수의 냉동 보존된 인간 표본을 활용할 수 있습니다. 생물 저장소에서 조직을 조달하는 다른 이점은 조직학, 병리학 및 일부 경우 임상 병리학 변수를 포함하여 조직 표본과 관련된 정보에 대한 액세스를 포함하며, 이들 모두는 지질체학 데이터와의 상관 관계를 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 동결보존 및 질량분석에 사용되는 최적 절단 온도 화합물(OCT)의 비호환성과 관련된 기술적 한계는 지질 분석의 기술적 장벽입니다. 그러나 우리는 이전에 OCT가 스핑고지질 함량을 변경하지 않고 세척 및 원심분리의 주기를 통해 인간 생물 저장소 표본에서 쉽게 제거될 수 있음을 보여주었습니다. 우리는 또한 이전에 OCT에서 동결 보존 된 인간 조직의 스핑 고지 질이 최대 16 년 동안 안정적이라는 것을 확립했습니다. 이 보고서에서는 조직 세척, 데이터 정규화를 위한 조직 칭량, 지질 추출, 액체 크로마토그래피 전기분무 이온화 탠덤 질량분석법(LC-ESI-MS/MS)으로 분석할 샘플 준비, 질량분석법 데이터 통합, 데이터 정규화 및 데이터 분석을 포함하여 OCT에 내장된 인체 조직 표본에서 스핑고지질을 분석하는 단계와 워크플로를 간략하게 설명합니다.
서론
Sphingolipids는 인간 대사 및 질병 1,2에서 역할로 알려진 생리 활성 대사 산물입니다. 그들은 세포 이동, 세포 생존 및 죽음, 세포 이동, 수포 트래피킹, 세포 침윤 및 전이, 혈관 신생 및 사이토 카인 1,2,3,4,5,6,7,8,9 생성과 같은 복잡한 세포 과정을 조절합니다. . 스핑고지질 대사 조절의 결함은 암의 시작과 진행에 기여하고, 암이 얼마나 공격적인지, 암이 치료에 어떻게 반응하고 내성을 발달시키는지를 결정합니다3,10. ....
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프로토콜
식별되지 않은 인간 폐 조직은 내부 검토 위원회(IRB) 승인 프로토콜(#HM2471)에 따라 버지니아 커먼웰스 대학교(VCU) 조직 및 데이터 수집 및 분석 코어에서 얻었습니다. 마우스 조직의 연구 및 수확을 위한 마우스의 사용은 VCU 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 재료 준비
알림: 이 단계는 티슈 세척 하루 전에 수행해야 합니다.
- 1.5mL 폴리프로필렌 원심분리 튜브에 사전 라벨을 붙이고 무게를 측정하여 다음 날 처리될 각 샘플에 대해 간결하지만 명확한 식별 코드를 지정합니다. 반복적인 튜브 취급으로 퇴색하지 않는 내화학성 영구 마커( 재료 표 참조)를 사용하십시오.
- 전자 스프레드시트를 열고 다음 열 머리글로 연속된 열에 레이블을 지정합니다: 튜브 식별자(ID), 튜브 단독, 조직이 있는 튜브 및 전체 조직. 튜브 ID라고 표시된 열에 처리할 튜브 식별자를 입력합니다.
- 분석 스케일을 사전 교정하고 영점화합니다. 깨끗한 10mL 삼각 플라스크를 밸런스 플레이트 중앙에 놓습니다(플라스크는 튜브 홀더 역할을 함). 칭량실 도어를 닫고 플라스크로 스케일을 칭량하십시오.<....
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결과
이 프로토콜에서는 냉동 보존된 인간 조직에서 OCT를 제거하고 LC-ESI-MS/MS로 분석하기 위해 조직의 무게를 측정하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 절차에 필요한 재료는 재료 표에 나열되어 있습니다. 도 1 에 도시된 것은 10개의 인간 폐 선암 종양과 10개의 정상 인접 조직을 세척하여 OCT를 제거하고 LC-ESI-MS/MS로 분석한 전형적인 실험의 결과이다. 중요하게도, 우리가 이전에11을 보았듯이, 폐 선암 종양에서 정상 인접 비관련 조직과 비교하여 유의하게 상승하는 다양한 사슬 길이의 세라마이드(그림 1A) 및 모노헥소실-세라마이드(그림 1B)가 있다.
섹션 4에 요약된 지질 추출 단계에 대한 OCT의 효과를 평가하기 위한 대조군 실.......
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토론
OCT는 생물 저장소에 사용되는 일반적인 장기 냉동 보존제입니다. 그러나, OCT는 조직이 다양한 질량 분석 플랫폼(12,13,14,15)에 의해 분석될 때 이온 억제를 초래하거나, 샘플이 LC-ESI-MS/MS 11에 의해 분석될 때 신호의 손실을 초래할 수 있다. 동결 보존 조직의 OCT는 또한 Bradford 및 BCA11과 같은 칭량 및 단백질 정량 분석과 같은 조직 정규화 방법을 방해할 수 있습니다. 여기에서는 인간 조직에서 OCT를 제거한 후 질량 분석법으로 분석하는 자세한 프로토콜을 제시합니다. 상기 프로토콜은 폐가 아닌 다른 조직 공급원을 사용하거나, 또는 우리가 이전에 기술한 바와 같이 마우스 조직으로.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
연구 프로젝트의 서비스 및 지원은 VCU Massey Cancer Center 조직 및 데이터 수집 및 분석 코어와 VCU 지질체학 및 대사체학 코어에서 제공했으며, 이는 NIH-NCI 암 센터 지원 보조금 P30CA016059의 자금으로 부분적으로 지원됩니다. 이 작업은 국립 보건원 보조금 R21CA232234 (산티아고 리마)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 폴리프로필렌 피펫 팁 | NA | 검체 검색에 사용 | |
| 1.5 mL 폴리프로필렌 원심분리기 튜브 | NA | NA | |
| 10 mL Erlenmeyer 플라스크 | VWR | 89091-116 | 튜브 및 조직 계량에 사용 |
| AB Sciex Analyst 1.6.2 | Sciex | NA | MS 데이터 분석 및 통합을 위한 소프트웨어 |
| 포름산암모늄 | Fisher Scientific | A11550 | LC 이동상의 |
| 경우 분석 척도 | NA | NA | 0.1mg까지 정확한 |
| NA 저울 병 뚜껑 디스펜서 | Sartorius | LH-723071 | 용매 |
| C12-Ceramide (d18 : 1 / C12 : 0) 분배에 사용; N- (도데 카노일) - 스핑 -4- 에닌 | Avanti 극성 지질 | LM2212 | 내부 표준 |
| C12- 글루코실 세라미드 (d18 : 1 / 12 : 0); N-(도데카노일)-1-&베타;-글루코실-스핑-4-아인 | 아반티 극성 지질 | LM2511 | 내부 표준 |
| C12-락토실세라미드 (d18:1/12:0); N-(도데카노일)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene | Avanti Polar Lipids | LM2512 | 내부 표준 |
| C12-Sphingomyelin (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | LM2312 | 내부 표준 |
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| d17 : 1- 스핑 고신 -1- 포스페이트; 헵타 데카스 핑-4- 에닌 -1- 포스 | 페이트 Avanti Polar Lipids | LM2144 | 내부 표준 |
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참고문헌
- Maceyka, M., Spiegel, S. Sphingolipid metabolites in inflammatory disease. Nature. 510, 58-67 (2014).
- Ogretmen, B. Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy. Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M.
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재인쇄 및 허가
