질량분석 분석을 위한 최적의 절단 온도 화합물에 내장된 인체 조직의 준비

Summary

스핑 고지 질은 인간 질병에서 잘 확립 된 역할을 가진 생리 활성 대사 산물입니다. 질량 분석법으로 조직의 변화를 특성화하면 질병 병인학에서 역할을 밝히거나 치료 표적을 식별할 수 있습니다. 그러나 생물 저장소에서 냉동 보존에 사용되는 OCT 화합물은 질량 분석을 방해합니다. OCT에 내장된 인간 조직의 스핑고지질을 LC-ESI-MS/MS로 분석하는 방법을 간략하게 설명합니다.

Abstract

Sphingolipids는 인간의 신진 대사와 질병에서 잘 확립 된 역할을하는 세포 구성 요소입니다. 질량 분석법은 스핑고지질이 질병에서 변경되었는지 여부를 결정하고 스핑고지질이 임상적으로 표적화될 수 있는지 여부를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 수술실에서 직접 조직을 획득하는 적절하게 전원이 공급되는 전향적 연구는 시간이 많이 걸리고 기술적, 물류적, 행정적으로 어려울 수 있습니다. 대조적으로, 후향적 연구는 조직 생물 저장소에서 이미 많은 수의 냉동 보존된 인간 표본을 활용할 수 있습니다. 생물 저장소에서 조직을 조달하는 다른 이점은 조직학, 병리학 및 일부 경우 임상 병리학 변수를 포함하여 조직 표본과 관련된 정보에 대한 액세스를 포함하며, 이들 모두는 지질체학 데이터와의 상관 관계를 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 동결보존 및 질량분석에 사용되는 최적 절단 온도 화합물(OCT)의 비호환성과 관련된 기술적 한계는 지질 분석의 기술적 장벽입니다. 그러나 우리는 이전에 OCT가 스핑고지질 함량을 변경하지 않고 세척 및 원심분리의 주기를 통해 인간 생물 저장소 표본에서 쉽게 제거될 수 있음을 보여주었습니다. 우리는 또한 이전에 OCT에서 동결 보존 된 인간 조직의 스핑 고지 질이 최대 16 년 동안 안정적이라는 것을 확립했습니다. 이 보고서에서는 조직 세척, 데이터 정규화를 위한 조직 칭량, 지질 추출, 액체 크로마토그래피 전기분무 이온화 탠덤 질량분석법(LC-ESI-MS/MS)으로 분석할 샘플 준비, 질량분석법 데이터 통합, 데이터 정규화 및 데이터 분석을 포함하여 OCT에 내장된 인체 조직 표본에서 스핑고지질을 분석하는 단계와 워크플로를 간략하게 설명합니다.

Introduction

Sphingolipids는 인간 대사 및 질병 ^1,2에서 역할로 알려진 생리 활성 대사 산물입니다. 그들은 세포 이동, 세포 생존 및 죽음, 세포 이동, 수포 트래피킹, 세포 침윤 및 전이, 혈관 신생 및 사이토 카인 1,2,3,4,5,6,7,8,9 생성과 같은 복잡한 세포 과정을 조절합니다. . 스핑고지질 대사 조절의 결함은 암의 시작과 진행에 기여하고, 암이 얼마나 공격적인지, 암^{이 치료에 어떻게} 반응하고 내성을 발달시키는지를 결정합니다^3,10. 따라서 질병의 원인에 대한 이러한 광범위한 영향 때문에 질병 특이 적 스핑 고지 질 변화를 정확하게 확립 할 수있는 분석 방법이 중요한 도구입니다. 질량 분석법(MS)은 스핑고지질의 변화를 분석하는 가장 정확하고 신뢰할 수 있는 방법입니다.

스핑고지질 변화 분석에 사용할 수 있는 인간 표본은 수술실에서 전향적으로 또는 조직 생체 저장소에서 후향적으로 얻을 수 있습니다. 수술로 인한 신선한 조직은 MS 또는 다른 분석 방법으로 직접 분석 할 수 있기 때문에 유리합니다. 그러나 전향적으로 조직을 획득하는 것은 행정적, 기술적, 물류적 장애물이 있으며 통계적 검정력에 도달하기에 충분한 표본을 수집하는 것은 어려울 수 있습니다. 생물 저장소에서 조직을 얻는 것은 소급 적으로 대량으로 획득 할 수 있고 생물 저장소가 조직학 및 병리를 확인하고 표준 운영 절차를 사용하여 극저온 적으로 조직을 보존 및 저장하며 상관 분석에 사용할 수있는 임상 병리학 적 데이터를 제공 할 수 있기 때문에 유리합니다. 그러나 분자 및 구조적 특징을 보존하기 위해 생물 저장소는 조직을 최적 절단 온도(OCT) 화합물에 내장하여 조직을 냉동 보존할 수 있으며, 이는 데이터 정규화 분석 및 액체 크로마토그래피 전기분무 이온화 탠덤 질량분석법(LC-ESI-MS/MS)에 의한 스핑고지질의 정량화를 방해하는 것으로 나타났습니다.¹¹ . 또한 OCT 화합물의 주성분인 폴리비닐알코올과 폴리에틸렌글리콜이 다른 MS 분석 플랫폼^12,13,14,15에서 이온 억제를 초래하는 것으로 나타났습니다. 따라서 OCT 화합물은 MS에 의한 스핑고지혈증 분석 전에 조직에서 제거되어야 합니다.

이전 보고서에서 우리는 LC-ESI-MS/MS 분석¹¹ 을 위해 인간 표본에서 OCT 화합물을 제거하기 위한 프로토콜과 데이터 정규화11을 위해 조직 칭량에 사용되는 방법론을^{검증했습니다.} 여기에서는 스핑고지혈증성 OCT 화합물 제거 프로토콜(sOCTrP)의 단계를 자세히 설명하고 인간 폐 선암 종양 및 정상 인접 비관련 조직의 대표 데이터를 보여줍니다.

Protocol

식별되지 않은 인간 폐 조직은 내부 검토 위원회(IRB) 승인 프로토콜(#HM2471)에 따라 버지니아 커먼웰스 대학교(VCU) 조직 및 데이터 수집 및 분석 코어에서 얻었습니다. 마우스 조직의 연구 및 수확을 위한 마우스의 사용은 VCU 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 재료 준비

알림: 이 단계는 티슈 세척 하루 전에 수행해야 합니다.

1. 1.5mL 폴리프로필렌 원심분리 튜브에 사전 라벨을 붙이고 무게를 측정하여 다음 날 처리될 각 샘플에 대해 간결하지만 명확한 식별 코드를 지정합니다. 반복적인 튜브 취급으로 퇴색하지 않는 내화학성 영구 마커( 재료 표 참조)를 사용하십시오.
2. 전자 스프레드시트를 열고 다음 열 머리글로 연속된 열에 레이블을 지정합니다: 튜브 식별자(ID), 튜브 단독, 조직이 있는 튜브 및 전체 조직. 튜브 ID라고 표시된 열에 처리할 튜브 식별자를 입력합니다.
3. 분석 스케일을 사전 교정하고 영점화합니다. 깨끗한 10mL 삼각 플라스크를 밸런스 플레이트 중앙에 놓습니다(플라스크는 튜브 홀더 역할을 함). 칭량실 도어를 닫고 플라스크로 스케일을 칭량하십시오.
4. 1.5mL 원심분리 튜브의 무게를 잰다. 튜브를 플라스크에 조심스럽게 넣고 칭량 챔버 도어를 닫습니다. 무게가 안정화되도록 하고 튜브라고 표시된 컬럼에만 무게를 기록합니다.
   참고: 튜브를 칭량할 때 10mL 삼각 플라스크를 움직이지 마십시오. 플라스크가 이동되면 플라스크를 다시 중앙에 놓고 저울을 다시 감쌉니다. 닫힌 튜브를 랙에 놓고 필요할 때까지 보관하십시오.
5. 13 x 100mm 스크류 탑 유리관과 캡에 식별자 코드를 사전 라벨링하고 2mL의 LC-MS 등급 메탄올로 채웁니다. 튜브 랙에 넣고 튜브를 덮고 사용할 때까지 냉장고(4°C)에 보관하십시오.
   알림: 병 상단 솔벤트 디스펜서를 사용하십시오( 재료 표 참조). 사용할 수 없는 경우 유리 피펫을 사용하여 유기 용제를 분배할 때 플라스틱을 사용하지 마십시오.
6. 13 x 100mm 유리 시험관에 사전 라벨링. 실온에서 시험관을 덮고 보관하십시오.
7. 자동 주사기 바이알에 식별자 코드로 사전 라벨을 붙입니다. 사용할 때까지 자동 주입기 바이알을 덮고 실온에서 보관하십시오.
8. 조직 건조 심지를 준비하십시오.
   1. 수술용 가위를 LC-MS 등급 메탄올에 5분 동안 담가 세척한 다음 깨끗한 실험실 등급 티슈로 닦습니다.
   2. 파우더가없는 장갑을 사용하여 미세하게 가늘어지는 30-40mm 심지가 형성 될 때까지 실험실 등급 조직 ( 재료 표 참조)의 끝을 돌립니다.
   3. 메탄올로 세척 한 가위를 사용하여 두꺼운 끝의 심지를 자릅니다. 심지를 깨끗한 판지 상자에 넣으십시오. 모든 샘플을 처리하는 데 필요한 것보다 심지 수를 두 배로 늘리십시오.
9. 단축된 1mL 피펫 팁을 준비합니다. 메탄올로 세척한 수술용 가위를 사용하여 1mL 피펫 팁의 끝에서 4-5mm를 자르고 팁을 팁 홀더에 다시 놓습니다. 처리 할 샘플보다 두 배 많은 팁을 준비하십시오.
   알림: 이들은 튜브에서 세척 된 조직을 검색하는 데 사용됩니다. 팁 끝을 만지지 마십시오.
10. 분자 생물학 등급 인산염 완충 식염수(PBS)를 4°C(0.5L이면 충분함)로 사전 냉각합니다. 이것은 표본을 검색하는 데 사용됩니다. 처리할 각 샘플에 대해 60mL의 초순수 탈이온수를 사전 냉각(4°C)합니다.
11. 질량 분석 내부 표준을 준비합니다. 다음 지질을 에탄올 : 메탄올 : 물 (7 : 2 : 1; v / v/v)에 25 nmol / mL의 농도로 녹입니다 : d17 : 1- 스 핑 고신, (2S, 3R, 4E) -2- 아미노 헵타 덱 -4- 엔 -1,3- 디올; D17 : 1- 스 핑고 신 -1- 포스페이트, 헵 타데 카스핑 -4- 에닌 -1- 포스페이트; C12- 세라마이드 (d18 : 1 / C12 : 0), N- (도데 카노 일) - 스 핑 -4- 에닌; C12- 스 핑고 미엘린 (d18 : 1 / C12 : 0), N- (도데 카노 일) - 스 핑 -4- 에닌 -1- 포스 포 콜린; C12- 글루코 실 세라마이드 (d18 : 1 / C12 : 0), N- (도데 카노 일) -1- β- 글루코 실 - 스핑 -4- 에인; C12- 락토 실 세라마이드 (d18 : 1 / C12 : 0), N- (도데 카노 일) -1- ß- 락토 실 - 스핑 -4- 엔.

2. 조직 세척

참고: 하루 전에 섹션 1의 모든 단계를 완료하면 숙련된 연구원이 하루에 최대 40개의 샘플을 처리할 수 있으며 초보자는 하루에 ~10-15개의 샘플을 처리할 수 있습니다. 아침 일찍 시작하여 섹션 2.1-3.8의 모든 단계가 완료 될 때까지 멈추지 마십시오.

1. 조직이 처리되는 날에는 보텍서, 완전히 충전 된 혈청 피펫 터 및 얼음 트레이를 장착하여 생물 안전 캐비닛 작업 영역을 준비하십시오. 이 섹션의 모든 단계에서 실험실 코트, 이중 장갑 및 보호 안경을 포함한 적절한 PPE를 착용하십시오. 주의 : 인체 조직 및 체액은 생물학적 위험 물질로 간주되고 취급되어야합니다.
2. 스윙 버킷 원심분리기, 15mL 원뿔형 원심분리기 튜브 및 원심분리기 생물봉쇄 뚜껑을 고정하는 데 필요한 모든 어댑터를 사전 냉각(4°C). 1.5mL 원심분리 튜브를 고정할 수 있는 고정각 원심분리기를 사전 냉각(4°C).
3. 조직이 15mL 폴리프로필렌 원심분리 튜브에 분취되지 않은 경우 메탄올로 세척된 주걱(각각의 새 조직 샘플에 대해 깨끗함)을 사용하여 미리 라벨링된 15mL 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. 15mL 캡에도 라벨을 붙입니다.
   1. 15mL 원심분리기 튜브를 담을 수 있는 튜브 랙을 얼음 트레이에 넣고 트레이에 얼음을 채웁니다. 그날 처리 될 조직을 얼음 위의 선반에 넣어 해동하십시오.
      참고: 최소 3-4mg의 조직이 처리를 위해 생물저장소로부터 요청되어야 하는데, 이는 조직 세척 및 칭량 프로토콜이 이러한 중량(¹¹)에서 정확하고 신뢰할 수 있음이 이전에 입증되었기 때문이다.
4. 샘플이 담긴 얼음 트레이를 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다.
5. 아래에 설명된 대로 3개의 sOCTrP 주기⁽¹¹ )를 수행합니다(즉, 2.5.1-2.5.5단계를 3회 수행).
   1. 얼음처럼 차가운 초순수 탈이온수 10mL를 각 튜브에 넣고 단단히 덮습니다. 튜브를 10분 동안 배양합니다.
   2. 10-20초 동안 또는 튜브 벽에 침착된 모든 조직 또는 조직 펠릿이 완전히 재부유될 때까지 각 튜브를 격렬하게 소용돌이합니다.
      알림: sOCTrP 사이클 2-3에서는 펠릿의 모든 OCT가 세척 용액에 희석되도록 펠릿을 재현탁하는 것이 중요합니다.
   3. 튜브를 사전 냉각된(4°C) 스윙 버킷 원심분리기로 옮깁니다. 4°C에서 10분 동안 4,000-5,000 x g 의 샘플을 원심분리합니다.
      알림: 원심분리 캐리어를 생물학적 격리 뚜껑으로 밀봉하여 원심분리 중에 생성된 생물학적 위험 에어로졸의 생성 및 노출을 피하십시오( 재료 표 참조).
   4. 원심 분리기에서 샘플을 회수하여 얼음 트레이로 옮깁니다. 트레이를 생물 안전 캐비닛에 넣고 튜브의 뚜껑을 풉니 다. 캡을 저장하십시오.
   5. 세척 용액을 조심스럽게 흡인하십시오. 튜브에 ~0.5mL의 상청액을 남겨 펠릿의 조직 재료를 흡인하지 마십시오. 튜브를 덮고 라벨이 붙은 캡을 튜브와 일치시켜 교차 오염을 피하십시오.
      알림: 2.5.5단계의 세척액(상청액)은 생물학적 유해 물질입니다. 인간 기원의 표본에 적합한 생물 안전 지침에 따라 취급하고 폐기하십시오.

3. 조직 칭량(데이터 정규화용)

1. 마지막 sOCTrP 세척 주기 후에 대부분의 세척 용액을 조심스럽게 흡입하되 펠릿을 방해하지 마십시오. ~0.5mL의 세척액을 튜브에 그대로 둡니다.
2. 단축된 피펫 팁(1.9단계에서 준비)을 사용하여 얼음처럼 차가운 PBS 500μL를 취하여 튜브에 추가합니다.
   1. 동일한 팁을 사용하여 펠릿을 부드럽게 다시 현탁하고 모든 조직을 회수합니다. 난류 피펫팅을 피하여 튜브와 피펫 팁 벽에 부착하여 조직 손실을 줄입니다.
3. 재현된 조직을 해당 사전 라벨링되고 사전 칭량된 1.5mL 원심분리 튜브에 넣고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 데이터 세트의 모든 조직에 대해 반복합니다.
4. 1.5mL 튜브를 사전 냉각된 원심분리기에 넣고 조직을 7,000 x g 에서 5-7분 및 4°C 동안 펠릿화합니다.
   1. 튜브를 회수하고 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 PBS를 조심스럽게 흡입하십시오. 튜브를 얼음 위에 다시 놓습니다.
5. 조직이 잘 펠릿화되도록 7,000 x g에서 3분 동안 추가로 원심분리 튜브를 사용합니다. 튜브를 얼음으로 옮깁니다.
   알림: 추가 원심분리 단계는 모든 세척 용액과 위킹을 제거할 때 조직 손실을 방지하는 데 중요합니다. 5개 이상의 시료를 처리하는 경우 5번째 시료를 처리한 후 3분, 7,000 x g 원심분리 단계를 반복하여 조직이 펠릿화된 상태로 유지되도록 합니다.
6. 1.8단계에서 준비한 심지를 사용하여 남아 있는 세척액을 부드럽게 제거합니다. 각 샘플에 깨끗한 심지를 사용하십시오. 심지로 티슈를 부드럽게 두드리는 것은 허용되며, 이는 대부분의 세척액을 제거하는 데 도움이 되지만 심지에 부착되어 조직이 손실되는 것을 방지합니다. 튜브를 닫고 얼음 위에 놓습니다.
7. 최근에 교정되고, 타링되고, 영점으로 조정된 분석 저울에서 각 튜브의 칭량.
   1. 각 튜브를 유리 삼각 플라스크에 넣고 챔버 도어를 닫습니다. 체중이 안정되면 튜브가 있는 티슈라고 표시된 전자 스프레드시트 열에 기록합니다.
   2. 무게를 잰 후 튜브를 얼음 위에 다시 놓습니다.
8. 얼음처럼 차가운 PBS 300μL를 추가합니다. 단축된 피펫 팁(단계 1.9)을 사용하여 모든 조직을 조심스럽게 검색하고 2mL의 얼음처럼 차가운 LC-MS 등급 메탄올이 포함된 미리 라벨이 부착된 스크류 탑 유리관(1.5단계에서 준비)에 침전합니다(튜브 측면이 아닌 메탄올에 티슈 추가).
9. 튜브 w/tissue 값에서 튜브만 빼서 세척된 조직의 양을 계산합니다. 이 숫자를 전체 조직 열에 기록하십시오. 총 조직 값은 6.12 단계에서 질량 분석 데이터를 정규화하는 데 사용됩니다.
10. 4.1-4.15단계를 수행할 준비가 될 때까지 샘플을 -80°C에서 보관하십시오.
    참고: 이것은 좋은 정지 지점이며 샘플은 -80 ° C에서 몇 주 동안 안전하게 보관할 수 있습니다. 단백질 농도 또는 지질 인산염 함량과 같은 다른 조직 정규화 방법에 대해서는 Rohrbach et ^al.11을 참조하십시오.

4. 지질 추출

참고: 특히 많은 샘플이 처리될 때 아침에 이러한 단계를 시작하는 것이 중요합니다. 시작하기 전에 수조 또는 인큐베이터를 48 ° C로 예열하십시오.

1. 단계 3.8에서 제조된 샘플 및 MS 지질 표준물질(단계 1.11에서 제조됨)을 냉동고로부터 회수한다. 20분 동안 실온과 평형을 이루도록 합니다.
2. 내부 표준 용액을 초음파 수조 ( 재료 표 참조)에 2-3 분 동안 또는 샘플에 분주하기 전에 MS 지질 표준이 완전히 용해 될 때까지 와동하고 담그십시오. 이렇게 하면 데이터 정규화 오류를 방지할 수 있습니다.
3. 반복 피펫을 사용하여 내부 질량 분석 표준물질의 250pmol(단계 1.11에서 제조된 25nmol/mL 용액에서 10μL)을 각 튜브에 추가합니다. 튜브를 가볍게 다시 캡을 다시 닫습니다.
4. 균질화를 촉진하려면 메탄올 부피를 2mL로 조정하십시오. LC-MS / MS 등급 메탄올 만 사용하십시오.
5. 한 번에 하나의 튜브를 작업하면서 균질화기를 사용하여 덩어리가 보이지 않을 때까지 조직을 분쇄합니다(일반적으로 5-20초). 균질화기 팁을 원을 그리며 움직이고 튜브 벽을 부드럽게 눌러 분쇄를 돕습니다. 튜브를 다시 캡핑하십시오.
   알림: 모든 조직이 미세하게 분쇄되었는지 확인하면 지질 추출이 극대화됩니다. 일회용 균질화기 팁은 클로로포름이 포함된 용액에 용해되는 플라스틱으로 만들어지므로 균질화 전에 샘플에 클로로포름을 첨가하지 마십시오.
6. 튜브를 초음파 수조에 45° 각도로 5-10초 동안 담그십시오.
   1. 초음파 수조에 담글 때 조직 덩어리가 형성되지 않으면 뚜껑을 덮고 다음 튜브로 이동하십시오.
   2. 튜브가 초음파 욕조에 잠길 때 조직 덩어리가 형성되면 다시 균질화하고 덩어리를 표적으로 삼습니다.
   3. 이 과정(균질화/초음파 수조에 담그기)을 반복하여 모든 큰 조직 덩어리가 분해될 때까지 반복합니다.
7. 흄 후드에서 LC-MS 등급 클로로포름과 메탄올을 각 튜브에 추가하여(병상단 디스펜서 사용) 2:1:0.1 메탄올:클로로포름:물의 비율을 달성합니다. 깨끗한 캡을 사용하여 튜브를 단단히 밀봉하고 하루가 끝날 때까지 벤치 탑에 두십시오.
   1. 무게가 50mg 이하인 조직의 경우 총 추출 부피 4mL를 사용하고 더 큰 표본의 경우 이 비율(50mg:4mL 추출 용액)을 사용하여 조정합니다.
8. 그날 저녁에 떠나기 전에 단단히 덮인 튜브를 48°C 수조 또는 인큐베이터에 넣고 밤새 배양하십시오.
   알림: 증발로 인해 용매 비율이 변하지 않도록 튜브를 단단히 캡핑하는 것이 중요합니다.
9. 다음날 아침, 48°C 수조에서 샘플을 회수하고 4°C에서 20분 동안 4,000-5,000 x g 로 원심분리하여 용매 불용성 파편을 펠릿화합니다.
10. 흄 후드에서 작업하면서 상층액을 사전 라벨링된 13 x 100mm 붕규산 유리 시험관에 조심스럽게 디캔팅합니다. 디캔팅을 용이하게 하기 위해 13 x 100mm 튜브를 30-45° 각도로 기울입니다.
    알림: 12개 이상의 샘플을 처리하는 경우 4.10단계를 수행할 때 펠릿이 부드러워지고 불용성 파편이 옮겨지므로 원심분리된 튜브를 장기간 그대로 두지 마십시오. 이를 방지하려면 한 번에 12개의 튜브만 원심분리기에서 꺼내고 디캔팅할 준비가 될 때까지 다른 튜브를 계속 원심분리하십시오.
11. 튜브를 13 x 100 mm 튜브를 고정할 수 있는 진공 농축기로 옮깁니다. 초기 1시간 가열 단계(40°C)로 모든 용매를 증발시키고 최대 진공 하에서 실행합니다.
12. 진공 농축기에서 튜브를 제거하고 각 튜브에 500μL의 LC-MS 등급 메탄올(병탑 디스펜서 사용)을 추가합니다.
13. 건조된 지질 추출물을 5-10초 동안 볼텍싱하여 재현탁한 다음, 튜브를 회전시키면서 2분 동안 초음파 수조에 45° 각도로 튜브를 담그십시오. 5 초 동안 다시 소용돌이하고 초음파 수조에 추가로 1 분 동안 담그십시오.
    알림: 이것은 추출 된 지질의 최대 회복을 보장하는 중요한 단계입니다. 튜브 벽의 모든 건조 된 재료가 다시 매달릴 때까지 앞으로 움직이지 마십시오.
14. 13 x 100mm 튜브를 사전 냉각된(4°C) 원심분리기에 넣고 4°C에서 20-30분 동안 4,000-5,000 x g 로 원심분리하여 불용성 파편을 제거합니다.
15. 정화된 상청액을 미리 라벨링된 자동 주사기 바이알에 조심스럽게 디캔트합니다. 자동 주입기 바이알을 30-45° 각도로 기울이면 디캔팅이 용이해집니다. 13 x 100mm 튜브의 전체 내용물이 오토로더 바이알에 기울어져 있는지 확인합니다.
16. 튜브를 단단히 캡핑하고 LC-ESI-MS/MS로 분석할 때까지 튜브를 -80°C에서 보관하십시오.

5. LC-ESI-MS / MS 분석

알림: 다음 절차에서는 삼중 사중극자 모드에서 작동하는 자동 주입기, 탈기 장치 및 LC-MS/MS 시스템에 결합된 바이너리 펌프 시스템을 사용합니다. 컬럼 온도는 컬럼 오븐을 사용하여 유지하였다. 사용된 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 이동상 A1 (CH 3 OH : H₂O : HCOOH, 58 : 41 : 1, v : v : v, 5 mM 포름산 암모늄 포함) 및 이동상 B1 (CH₃OH : HCOOH, 99 : 1, v : v, 5 mM 포름산 암모늄 포함)을 준비합니다. LC-MS 등급 용매, 물 및 시약만 사용하십시오.
2. 각 샘플 세트에 대해 500μL의 LC-MS 등급 메탄올이 포함된 4개의 블랭크 오토로더 바이알을 준비합니다.
3. 각 샘플 세트에 대해 1.11단계에서 준비한 내부 표준물 용액 10μL(각 표준물질 총 250pmol)를 LC-MS 등급 메탄올 500μL로 희석하여 2개의 내부 표준(라벨 부착) 자동 로더 바이알을 준비합니다.
4. 컬럼 오븐 온도를 60°C로 설정하고 이온 소스 온도를 500°C로 설정합니다.
5. MS/MS 분석의 경우 분광계의 삼중 사중극자 모드를 활용하십시오. N2를 사용하여 분자적으로 독특한 생성물 이온을 전달하도록 세 번째 사중극자(Q1)를 설정하고(또는 Q1 또는 Q3에서 여러 m/z에 걸쳐 스캔) N2를 사용하여 충돌적으로 해리를 유도하기 위해 사중극자 2(Q2)에서 충돌적으로 해리를 유도합니다.
6. 다중 반응 모니터링 쌍(MRM) 검출 창을 120초로 설정하고 목표 스캔 시간은 1.0초입니다. MRM 쌍, 이온화 에너지 및 충돌 에너지 목록은 표 1 을 참조하십시오.
7. LC 단계에서 스핑고지질을 해결하려면 다음 파라미터를 사용합니다: 0.7mL/min의 유속을 사용하여 95% 이동상 A1 및 5% 이동상 B1의 용매 혼합물로 0.5분 동안 2.1(i.d) x 50mm C18 역상 컬럼을 평형화합니다.
   1. 샘플 주입 후 이동상 A1/B1 비율을 95/5에서 2.25분 동안 유지한 다음 1.5분에 걸쳐 100% B1까지 선형 그래디언트를 유지한 다음 100% B1에서 5.5분 동안 유지한 다음 0.5분 그래디언트 리턴을 95/5 A1/B1로 유지합니다.
   2. 실행 후 95/5 A1/B1의 혼합물로 컬럼을 0.5분 동안 다시 평형화합니다.
8. 시료 오토로더에 대해 다음 설정을 사용하십시오: 헹굼 부피, 500 μL; 바늘 스트로크, 52 mm (각 바이알의 바이알 크기와 부피에 따라 조정해야 함); 헹굼 속도, 35 μL/s; 샘플링 속도, 5.0 μL/s; 헹굼 딥 시간, 2 초; 헹굼 모드, 흡인 전후; 헹굼 시간, 2 초.
9. 4.15단계에서 준비한 샘플을 다음 순서로 자동 로더 트레이에 놓습니다. 이다; 빈; 단계 4.15에서 제조된 샘플; 공백, IS, 공백.
10. LC-ESI-MS/MS로 각 샘플의 5-10 μL를 분석합니다. 데이터 세트의 모든 샘플에 대해 동일한 부피를 분석합니다.

6. 데이터 처리, 통합 및 정규화

참고: 다음 단계에서는 특정 소프트웨어에 대한 절차를 간략하게 설명하지만( 재료 표 참조), 동등한 LC-MS 기기 및 소프트웨어에 대한 유사한 절차를 사용하여 분석된 지질 등급 및 해당 내부 표준에 대한 MRM 쌍을 통합할 수 있습니다.

1. 정량 분석 소프트웨어를 엽니다. 수량 분석 탭에서 정량 분석 마법사를 두 번 클릭합니다. 팝업 창의 맨 왼쪽 작업 공간에서 올바른 데이터 세트로 이동하여 마우스 왼쪽 버튼을 클릭합니다. 사용 가능한 샘플이 중간 작업 영역에 표시됩니다.
2. 분석할 샘플을 강조 표시한 다음 오른쪽 화살표를 클릭하여 선택한 샘플 작업 영역에 샘플을 추가합니다. Next( 다음 )를 클릭하여 기본 설정이 일반적으로 사용되는 설정 및 쿼리 화면으로 이동합니다.
3. 히트 다음 통합 방법 선택 화면으로 이동합니다. 분석할 지질에 대한 MRM 전이 쌍을 포함하는 적절한 통합 방법을 선택합니다. MRM 전환 쌍에 대해서는 표 1 을 참조하십시오. 마침을 누르십시오.
   알림: 보존 시간은 계측기 및 개별 설정에 따라 다르므로 각 개별 설정에 대해 확인해야 합니다.
4. 탐색 모음에서 피크 검토 창을 클릭하여 MRM 쌍을 검사할 수 있도록 합니다. 검토를 용이하게 하려면 피크 검토 창을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 자동 확대/축소를 가장 큰 피크의 100%로 변경하고 확대/축소 창을 1.00 - 2.00분으로 변경합니다.
5. 정량 표시 창을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 분석물과 검사할 스핑고지질을 선택합니다. 블랭크 샘플에 피크가 없고 올바른 피크가 IS 샘플에 통합되었는지 확인합니다.
6. 알 수 없는 시료 통합을 시작합니다. 한 번에 하나의 스핑고지질 클래스를 작업하면서 내부 표준의 MRM 쌍에 대한 머무름 시간을 검사합니다(예: C12:0 ceramide)를 선택하고 소프트웨어가 올바른 피크를 통합했는지 확인합니다.
7. 동일한 지질 등급의 분석물에 계속 적용(즉, C14:0 세라마이드, C16 : 0- 세라마이드 등), 클래스에서 가장 짧은 사슬 길이의 지질로 시작합니다. 각 체인 길이 지질에 대해 소프트웨어 루틴이 올바른 MRM 쌍 피크를 통합했는지 확인합니다.
8. 모든 분석물이 통합되면 분석된 각 스핑고지질 종(예: 세라마이드, 스핑고미엘린 등)에 대한 전자 스프레드시트를 생성합니다. LC-MS/MS 정량 분석 소프트웨어의 분석물 및 체인 길이의 순서와 일치하도록 컬럼 헤더에 레이블을 지정합니다. 또한 3.9단계에서 결정된 샘플 ID 및 샘플 정규화 가중치에 대한 열 헤더를 포함합니다.
   참고: 앞서 설명한 바와 같이¹¹, 다른 일반적인 정규화 측정에는 총 지질 인산염 함량 또는 단백질 양이 포함됩니다.
9. 모든 분석물 및 내부 표준물질의 피크 영역을 전자 스프레드시트로 내보내거나 복사합니다.
10. 주어진 스핑고지질 클래스에 대한 각 사슬 길이 종의 통합 피크 면적을 해당 내부 표준의 피크 영역으로 나누어 데이터를 정규화합니다. 예를 들어 C14:0 세라마이드, C16:0 세라마이드, C18:1 세라마이드 등은 각각 C12:0으로 나누어야 합니다. 세라마이드 내부 표준 피크 영역.
11. 피크 면적을 정규화된 피크 면적(단계 6.10에서 계산)에 단계 4.3에서 샘플에 첨가된 내부 표준물질인 피코몰의 양을 곱하여 회수한 지질의 몰로 변환합니다. 이 프로토콜에서이 양은 250 pmol입니다.
12. 각 샘플에서 지질의 상대적인 양을 얻으려면 각 지질 사슬의 피코몰-길이를 단계 3.9에서 결정된 조직 무게로 나눕니다. 이것은 조직의 mg 당 지질의 피코몰 단위를 줄 것입니다.

Results

이 프로토콜에서는 냉동 보존된 인간 조직에서 OCT를 제거하고 LC-ESI-MS/MS로 분석하기 위해 조직의 무게를 측정하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 절차에 필요한 재료는 재료 표에 나열되어 있습니다. 도 1 에 도시된 것은 10개의 인간 폐 선암 종양과 10개의 정상 인접 조직을 세척하여 OCT를 제거하고 LC-ESI-MS/MS로 분석한 전형적인 실험의 결과이다. 중요하게도, 우리가 이전에¹¹을 보았듯이, 폐 선암 종양에서 정상 인접 비관련 조직과 비교하여 유의하게 상승하는 다양한 사슬 길이의 세라마이드(그림 1A) 및 모노헥소실-세라마이드(그림 1B)가 있다.

섹션 4에 요약된 지질 추출 단계에 대한 OCT의 효과를 평가하기 위한 대조군 실...

Discussion

OCT는 생물 저장소에 사용되는 일반적인 장기 냉동 보존제입니다. 그러나, OCT는 조직이 다양한 질량 분석 플랫폼(^12,13,14,15)에 의해 분석될 때 이온 억제를 초래하거나^, 샘플이 LC-ESI-MS/^{MS 11}에 의해 분석될 때 신호의 손실을 초래할 수 있다. 동결 보존 조직의 OCT는 또한 Bradford 및 BCA¹¹과 같은 칭량 및 단백질 정량 분석과 같은 조직 정규화 방법을 방해할 수 있습니다. 여기에서는 인간 조직에서 OCT를 제거한 후 질량 분석법으로 분석하는 자세한 프로토콜을 제시합니다. 상기 프로토콜은 폐가 아닌 다른 조직 공급원을 사용하거나, 또는 우리가 이전에 기술한 바와 같이 마우스 조직으로...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL 폴리프로필렌 피펫 팁	NA		검체 검색에 사용
1.5 mL 폴리프로필렌 원심분리기 튜브	NA	NA
10 mL Erlenmeyer 플라스크	VWR	89091-116	튜브 및 조직 계량에 사용
AB Sciex Analyst 1.6.2	Sciex	NA	MS 데이터 분석 및 통합을 위한 소프트웨어
포름산암모늄	Fisher Scientific	A11550	LC 이동상의
경우 분석 척도	NA	NA	0.1mg까지 정확한
NA 저울 병 뚜껑 디스펜서	Sartorius	LH-723071	용매
C12-Ceramide (d18 : 1 / C12 : 0) 분배에 사용; N- (도데 카노일) - 스핑 -4- 에닌	Avanti 극성 지질	LM2212	내부 표준
C12- 글루코실 세라미드 (d18 : 1 / 12 : 0); N-(도데카노일)-1-&베타;-글루코실-스핑-4-아인	아반티 극성 지질	LM2511	내부 표준
C12-락토실세라미드 (d18:1/12:0); N-(도데카노일)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene	Avanti Polar Lipids	LM2512	내부 표준
C12-Sphingomyelin  (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	LM2312	내부 표준
CHLOROFORM OMNISOLV 4L	VWR	EM-CX1054-1
ClickSeal Biocontainment Lids	Thermo Scientific	75007309	원심분리 중 생물학적 위험 에어레졸 방지
Conflikt	Decon Labs	4101	Decontaminant
CTO-20A/20AC 란 오븐	Shimadzu	NA	LC
d17:1-Sphingosine;   (2S, 3R, 4E) -2- 아미노 헵타 덱 -4- 엔 -1,3- 디올	Avanti Polar Lipids	LM2000	내부 표준
d17 : 1- 스핑 고신 -1- 포스페이트; 헵타 데카스 핑-4- 에닌 -1- 포스	페이트 Avanti Polar Lipids	LM2144	내부 표준
DGU20A5R 탈기 장치	Shimadzu	NA
일회용 배양 튜브 13x100mm	VWR	53283-800	13x100 mm 스크류 탑 튜브
온수 목욕	NA	NA	하룻밤 지질 추출용
균질화기 150	Fisher Scientific	15-340-167	삼중산염 조직
균질화기 플라스틱 일회용 발전기 프로브	Fisher Scientific	15-340-177	균질화
Kimwipes	Kimtech	34120	심지를 만드는 데 사용되는 실험실 등급 조직
메탄올 LC-MS 등급 4L	VWR	EM-MX0486-1
Nexera LC-30 AD 바이너리 펌프 시스템	Shimadzu	NA	LC-MS용
영구 마커	VWR	52877-310
페놀 나사산 폐쇄, Kimble Chase(일회용 배양 튜브용 캡)	VWR	89001-502	13x100mm 나사 상단 튜브 캡
인산염 버프 식염수	Thermo Scientific	10010023	세척 후 튜브에서 시료 회수
리피터 피펫	Eppendorf	4987000118	LC-MS 내부 표준 분배
스크류 캡, 파란색, 빨간색 PTFE/흰색 실리콘	VWR	89239-020	자기인젝터 바이알 캡
ID 패치가 있는 나사산 유리 바이알	VWR	46610-724	자기인젝터 바이알
SIL-30AC 자기인젝터	Shimadzu	NA
SpeedVac	Thermo Scientific	SPD2030P1220	용매 건조용
Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 컬럼	Sigma Aldrich	581300-U	, LC-MS용
트리플 쿼드 5500+ LC-MS/MS 시스템	, Sciex	NA	LC-ESI-MS/MS용
초음파 수조	추출 및 건조된 지질의 균질화 및 재현탁을 위한	Branson	모델 2800
Vortexer	NA		NA sOCTrP 및 건조 지질 재현탁용
VWR 배양 튜브 일회용 붕규산 유리	VWR	47729572	13x100 유리 배양 튜브
Water Hipersolve Chromanorm LC-MS	VWR	BDH83645.400