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방법 논문

Leishmania braziliensis 감염률 및 선천성 숙주 면역 반응을 평가하기 위해 인간 단핵구에서 대식세포 획득

1.1K 조회수

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DOI:

10.3791/62555

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2021년 8월 7일

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1Oswaldo Cruz Foundation, Gonçalo Moniz Institute, 2Federal University of Bahia, 3National Institute of Science and Technology (INCT), Research Institute in Immunology, 4Senai Institute for Innovation in Advanced Health Systems, National Service for Industrial Learning, Integrated Manufacturing and Technology Campus, SENAI - CIMATEC Salvador

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 Leishmania braziliensis에 감염되기 위해 단핵구에서 인간 대식세포를 얻는 과정을 설명합니다. 또한 연구자들은 감염률과 기생충 생존력, 형광 현미경 검사에 의한 ROS 생산, 배양 상등액의 염증 매개체 생성을 평가하여 감염에 대한 대식세포 반응을 조사할 수 있습니다.

초록

대식세포는 면역 체계 기능에 필수적인 다기능 세포로, 리슈마니아 브라질리엔시스(Lb) 감염의 주요 숙주 세포입니다. 이 세포는 미생물 인식 및 식균작용에 특화되어 있을 뿐만 아니라 다른 면역 세포를 활성화하고 항원을 제시할 뿐만 아니라 염증 및 조직 복구를 촉진합니다. 여기에서는 건강한 기증자의 말초 혈액(PBMC)에서 단핵 세포를 얻어 단핵구를 분리한 다음 대식세포로 분화하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 그런 다음 이러한 세포를 다양한 Lb 농도로 체외에서 감염시켜 감염 제어 능력을 평가하고 숙주 세포 면역 반응을 평가할 수 있으며, 이는 여러 방법으로 측정할 수 있습니다. PBMC는 먼저 Ficoll-Hypaque gradient로 원심분리하여 분리한 다음 단핵구가 배양 플레이트에 부착될 수 있도록 도금했습니다. 비부착성 세포는 세척에 의해 제거하였다. 다음으로, 대식세포 분화를 유도하기 위해 대식세포-집락자극인자(M-CSF)로 부착 세포를 7일 동안 배양하였다. 2 x 105 대식세포를 얻기 위해 24웰 플레이트에 웰당 2 x 106 셀을 도금하는 것이 좋습니다. 완전히 분화된 대식세포는 4시간 또는 24시간 동안 Lb에 감염될 수 있습니다. 이 프로토콜은 광학 또는 형광 현미경으로 평가할 수 있는 상당한 비율의 감염된 세포를 생성합니다. 감염 지수 외에도 기생충 부하는 각 세포 내부의 기생충 수를 세어 측정할 수 있습니다. 배양 상층액 또는 대식세포 자체 내에서 추가 분자 및 기능 분석을 수행할 수도 있으며, 이를 통해 이 프로토콜을 다양한 상황에 적용할 수 있으며 다른 세포 내 기생충 종에도 적용할 수 있습니다.

서론

리슈마니아(Leishmania) 속의 세포 내 원생동물 기생충은 리슈마니아증(leishmaniasis)으로 알려진 방치된 질병 복합체의 원인 병원체이다1. 이러한 열대성 질환은 피부 병변에서 내장성 질환으로 인한 합병증에 이르기까지 다양한 임상 증상을 보이며, 치료하지 않으면 치명적일 수 있습니다. 피부 리슈마니아증(CL)은 리슈마니아증의 가장 흔한 형태로, 악화된 만성 염증을 동반한 단일 또는 소수의 궤양 피부 병변이 특징이다2. 질병의 발병은 리슈마니아(Leishmania) 종에 의존하며, 숙주 면역 반응과 관련된 요인들의 조합에 따라 달라지며, 둘 다 임상적 결과를 정의한다 3,4. Leishmania braziliensis는 브라질에서 CL을 유발하는 주요 종으로, 브라질의 모든 주에서 사례가 보고되었습니다5. L. braziliensis에 대한 면역 반응은 기생충을 접종 부위로 제한하고 대식 세포, 호중구 및 림프구와 같은 여러 ....

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프로토콜

Gonçalo Moniz Institute(Oswaldo Cruz Foundation-IGM-FIOCRUZ, Salvador, Bahia-Brazil)의 인간 연구 윤리를 위한 기관 검토 위원회(Institutional Review Board for Ethics in Human Research)는 이 연구를 승인했습니다(프로토콜 번호: CAAE 95996618.8.0000.0040).

1. 인간 PBMC의 분리

  1. 혈액 샘플, 1.077g/mL 밀도 구배(예: Ficoll-Histopaque) 및 식염수가 실온에 있는지 확인합니다.
  2. 혈액 샘플을 식염수로 1:1 비율로 희석합니다.
  3. 10-12 mL의 밀도 구배를 50 mL 튜브로 옮깁니다.
  4. 최대 40mL의 희석된 혈액 샘플을 밀도 구배 위에 조심스럽게 오버레이합니다. 혈액 및 밀도 구배 층을 분리합니다.
  5. 첫 번째 원심분리: 24ºC에서 30분 동안 400 x g 에서 혈액 및 밀도 구배층을 포함하는 원심분리 튜브.
    알림: 원심분리기를 시작하기 전에 브레이크를 끄십시오.
  6. 피펫으로 PBMC 링 위의 혈장을 제거합....

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결과

기생충과 숙주 세포의 상호 작용에 대한 이해는 여러 질병의 발병기전과 관련된 메커니즘을 밝히는 데 중요합니다. 배양된 인간 세포는 세포 계통에 비해 세포 배양의 한계로 인해 덜 사용되지만, 여기에 제시된 프로토콜은 인간 대식세포의 강력하고 재현 가능한 분화를 보여줍니다. 이 프로토콜을 통해 염증 매개체 생성부터 인간 대식세포의 감염원에 대한 감수성에 이르기까지 면역 반응 및 세포 생물학의 여러 측면을 분석할 수 있습니다.

세포 분화가 일어나고 있다는 첫 번째 증거는 대식세포 형태학(macrophage morphology)입니다(그림 1A). 도금 당일, 세포는 7일간의 배양 후 형태와 비교할 때 둥글고 작습니다. 세포 확산은 배양액에 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF)를 처리할 때 관찰됩니다. M-CSF가 없으면 세포 분화에 더 많은 시간이 걸리고 대식세포 유사 세포의 이질적인 집단이 생성됩니다(데이터는 표시되지 않음). 7.......

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토론

인간 단핵구가 대식세포로 분화된 후 L. braziliensis 의 두 균주에 감염되기 위해 여기에 제시된 프로토콜은 기생충-세포 상호 작용의 여러 측면을 평가할 수 있도록 합니다. 이러한 도구는 CL에 대한 답이 없는 질문을 해명하는 데 중요할 수 있습니다. 이 프로토콜의 확립으로 우리 그룹은 당뇨병 및 CL14가 있는 개인으로부터 얻은 대식세포의 면역 반응의 일부 측면을 밝힐 수 있었습니다.

단핵구가 인간 대식세포로 분화되는 과정은 복잡하며 배양 첫날부터 주의가 필요합니다. 연구자는 분화를 모니터링하여 매일 세포 형태에 의한 배양 발달을 확인해야 합니다. 일반적으로 M-CSF를 함유한 배지로 단핵구를 7일 동안 배양하면 완전한 분화가 가능합니다. 세포 형태는 공여자에 따라 달라지므로 공여자들 사이에서 세포 분화의 여러 단계를 관찰할 수 있다는 점을 언급하는 .......

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공개 사항

저자들은 자신들이 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언한다.

감사의 글

이 작업은 보조금 번호 PET0009/2016에 따라 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia(FAPESB)와 재정 코드 001에 따라 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brazil(CAPES)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AlamarBlue 세포 생존 가능성 시약InvitrogenDAL1100
세포 배양 플라스크 25 cm²SPL70125
CellROX 녹색 시약InvitrogenC10444
커버슬립 서클 13mmPerfecta10210013CE
DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐린돌)ThermoFisherD1306
혈액 수집을 위한 일회용 지원BD Vacutainer364815
Eclipse 혈액 수집 바늘 21g x 1.25인치BD Vacutainer368607
EntellanSigma Aldrich107961
Falcon Conical Tubes, 15 mLSigma AldrichCLS430791-500EA
Falcon Conical Tubes, 50 mLStemCell Technologies100-0090
Fetal Bovine SerumGibco A4766801
Formaldehyde 3.7%Merck252549
유리 슬라이드  25,4x76,2mmPerfecta0200
HistopaqueSigma Aldrich10771
Human IL-6 ELISA KitRDDY206
Human M-CSF Recombinant ProteinPeproTech300-25
Human TNF-a ELISA KitRDDY210
Leukotriene B4 ELISA KitCayman
메탄올MerckMX0482
페닐리신-스렙토마이신-글루타민 (100x)ThermoFisher10378-016
인산염 완충 식염수 pH 7.2 (10x)Gibco70013032
플라즈마 튜브, 158 USP 단위의 헤파린 나트륨(스프레이 코팅)BD Vacutainer367874
Quick H& E 염색 키트(Hematoxylin 및 Eosin)abcamab245880
RPMI 1640 MediumGibco11875093
Schneider's Insect MediumSigma AldrichS0146
조직 배양 24웰 플레이트TPPZ707791-126EA
Trypan BlueGibco15250061
520111

참고문헌

  1. Desjeux, P. Leishmaniasis: current situation and new perspectives. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 27 (5), 305-318 (2004).
  2. Burza, S., Croft, S. L., Boelaert, M. Leishmaniasis. The Lancet. 392 (10151), 951-970 (2018).
  3. Arenas, R., Tor....

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