여기서는 메가카요세포 분화의 특성화를 위한 면역페노티핑 전략을 제시하고, 이 전략이 형광 활성화 세포 선별기로 다른 단계에서 메가카요사이클을 분류하는 방법을 보여준다. 방법론은 인체 에 있는 문화에서 생성된 거대 karyocytes뿐만 아니라 인간 1차 조직에적용될 수 있다.
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방법 논문
인간 1차 출처에서 인간 MK의 면역페노티핑 및 세포 분류 또는 헤마토포이틱 전조자로부터 시험관내 분화
이 논문에서
요약
초록
메가카요세포(MK) 분화는 고도의 다중계(>64N) 및 매우 큰 셀(40-60 μm)을 초래하는 다수의 내미토성 주기를 포함한다. 세포 생물학 및 분자 수준에서 메가카요포에이시스에 대한 빠르게 증가하는 지식과는 달리, 유동 세포측정에 의한 메가카르요포에이스의 특성화는 계보 특이적 표면 마커를 이용한 성숙한 MK의 식별에 국한되는 반면, 이전의 MK 분화 단계는 아직 미개척되지 않은 상태로 남아 있다. 여기서는 MK 특이적 및 비특이적 표면 마커를 통합하는 패널이 있는 인간 1차 출처 또는 체외 배양에서 연속MK 분화 단계를 식별할 수 있는 면역페노티핑 전략을 제시합니다. 그 크기와 취약성에도 불구하고, MK는 위에서 언급한 패널을 사용하여 면역페노타입이 될 수 있으며, 압력 및 노즐 직경의 특정 조건하에서 형광 활성화 셀 분류에 의해 농축될 수 있다. 이 접근은 인간에 있는 거대 karyopoiesis 및 혈소판 생산의 복잡성을 더 잘 이해하기 위하여 목적으로, 다중 Omics 연구 결과를 촉진합니다. 메가카요포이스의 더 나은 특성화는 혈통 관련 병리학 및 악성종양의 진단 또는 예후에서 근본적인 자세를 취할 수 있습니다.
서론
메가카요세포(MKs)는 조혈줄기세포(HSC)로부터 개발되어 호르몬 혈전포이에틴(TPO)에 의해 주로 오케스트레이션되는 메가카요포이에이시스(megakaryopoiesis)라는 복잡한 과정을 거쳐 개발한다. 메가카요포이시스의 고전적인 견해는 HSC에서 부터 헌신적인 선조및 전구체 세포의 계층적 단계를 통해 세포 여행을 설명하며 궁극적으로 성숙한 MK로 이어집니다. 성숙 하는 동안, MKs 는 여러 차례의 내시경증을 경험하고, 혈소판 생산을 위한 충분한 멤브레인 표면을 제공하는 복잡한 세포내 경계 막 시스템(DMS)을 개발하고, 성숙한 혈소판1,2,3에의해 상속되는 다양한 과립에 포함된 과다를 효율적으로 생산하고 포장한다. 그 결과, 성숙한 MK는 고다형성 핵(심지어 >64N에 도달)을 특징으로 하는 큰 세포(40-60 μm)이다. 최근 연구에 따르면 HSC가 특정 물리 병리학적조건에 대한 응답으로 전통적인 혈통 약정 체크 포인트를 우회하는 MK로 분화하는 대체 경로를제안4,5,
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프로토콜
1964년 헬싱키 선언에 따라 전혈 및 골수 샘플을 채점하고 처리하였다. 전혈 샘플은 우리의 기관 의료 윤리위원회 (병원 Universitario 중앙 드 아스투리아스 -HUCA-)에 의해 승인 된 연구 내에서, 통보 된 동의 (ISPA)를 준 후 건강한 기증자로부터 얻어졌다. 골수 샘플은 병원 Clínico San Carlos (HCSC)의 혈액학부에서 관리되는 환자의 골수 흡인 폐기 물질로부터 수득되었습니다.
그림 1: 이 원고에 기록된 프로토콜의 회로도 표현입니다. 면역페노티핑을 사용하여 MK 분화가 진행될 수 있는 1차 인간 소스 또는 1차 배양이 표시됩니다. 이러한 면역페노티핑 전략은 1차 근원에서 상이한 계보 관련 병리학 또는 악성종양에서....
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결과
골수와 플로이디
도 4에서, 우리는 환자로부터 BM 샘플 (열망)에서 메가 카요포이스의 대표적인 면역 페노티핑 분석을 보여줍니다. CD71 및 CD31에 대한 셀룰러 분획을 플로팅할 때 CD31- CD71- (빨간색), CD31- CD71+ (파란색), CD31+ CD71- (오렌지), CD31+ CD71미드 (밝은 녹색), CD31+ CD71+ (어두운 녹색) 및 CD31 ++++++1)의 6개의 주요 인구를 게이트했습니다. 이러한 인구는 항상 동일한 위치에 존재하지 않습니다 (일정한 사이토미터 설정을 고려), 그것은 볼 수 있듯이, 그 고려되어야한다. 이것은 병리학적 상태와 .......
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토론
유동 세포측정에 의한 메가카요포에이시스 연구에 초점을 맞춘 대부분의 연구는 현재까지 계보 별 표면마커(즉,CD42A/CD42B, CD41/CD61)만을 사용하여 MK 서브세트의 식별에 국한된 반면, 이전의 MK 분화 단계는 제대로 조사되지 않았습니다. 본 기사에서는 인간 메가카요포이시스의 포괄적인 유동 세포측정 특성화를 해결하기 위한 면역페노티핑 전략을 보여줍니다. 전반적으로, 우리는 보다 상세한 방법으로 메가카요포이시스연구를 위한 동일한 유동 세포측정 항체 패널에서 MK 특이적 및 비특이적 표면 마커(표 1 및 2)를 결합하는 실용성을 강조하고자 한다. 우리의 새로운 접근은 혈액학 무질서에 있는 진단 및/또는 예후를 돕기 위하여 강력한 공구역할을 할 수 있었습니다. 우리는 제시 된 패널과 조합이 확정적이지 않다고 생각한다. 우리는 또한 하위 병리학에 의존하는 인간 1 차적인 근원 (주로 BM 견본에서)에 있는 표면 마커의 아주 역동적인 행동을 관찰했습니다. 더 많은 연구가 필요하고, 바라건대, 과학 적인 사회는.......
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공개 사항
시청각 재료 생산은 BD 바이오 사이언스에 의해 지원되었다.
감사의 글
마르코스 페레즈 바스테레헤아, 로레나 로드리게스 로렌조, 베고냐 가르시아 멘데스(HUCA) 및 팔로마 세레조, 알무데나 파에로, 마리아 데 라 포베다 콜로모(HCSC)에 기술 지원을 부탁드립니다. 이 작품은 의학 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다 (로슈 SP200221001) A.B., RYC 펠로우십 (RYC-2013-12587; 장관 드 Economía y 경쟁, 스페인) 및 I + D 2017 교부금 (SAF2017-85489-P; 장관 드 시엔시아, 이노바시온 y 유니버시다데스, 스페인 과 폰도스 페더) L.G., 세베로 오초아 그랜트 (PA-20-PF-BP19-014; Consejería de Ciencia, Innovación y Universidades 델 Principado de Asturias, 스페인.M) 및 교내 박사 후 보조금 2018 (Fundación para la Investigación y la Innovación Biosanitaria de Asturias - FINBA, 오비에도, 스페인) A.A.H. 우리는 자신의 지식 (및 시간), 특히 멀티 컬러 태그 항체 패널 믹스와 단일 색상 비드 제어 준비에 대한 그의 현명한 조언을 공유 레이니어 반 데르 린덴 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| MK 분류에 필요한 | 130 마이크론 | 643943 | 노즐 BD |
| 5810R 원심분리기 | Eppendorf | Cell 분리 및 세척 | |
| A-4-62 Swing Bucket Rotor | Eppendorf | Cell 분리 및 세척 | |
| Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge | ELITech Group | Automatized cytology devise, 여기서 슬라이드는 Mat-Gr& 음; nwald Giemsa | |
| CO2 인큐베이터 Galaxy 170 S | Eppendorf | Cell Incubation | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | 시토스핀 | |
| FACSAria IIu 분류기 | BD | 레이저 488-nm 및 633-nm | |
| FACSCanto II 유세포 분석기 | BD | 레이저 488-nm, 633-nm 및 405-nm | |
| Olympus 현미경 BX 41 | 올림푸스 | 현미경 | |
| BX 61 | 올림푸스 | 현미경 사진 | |
| Zoe 형광 세포 이미저 | BioRad | 현미경 사진 | |
| Sigma-Aldrich | L4646 | 또는 유사한 | |
| 얻기 위해 | |||
| Technologies | #07801 | 또는 유사한 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | 시그마-알드리치 | P4333 | 또는 유사한 |
| 재조합 인간 에리트로포이에틴(EPO) | R& D Systems | 287-TC-500 | 또는 유사 |
| 재조합 인간 줄기 세포 인자(SCF) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC2115 | 또는 유사 |
| 재조합 인간 트롬보포이에틴(TPO) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC9514 | 또는 TPO 수용체 작용제 |
| StemSpan SFEM | Stem Cell Technologies | #09650 | |
| 유세포 분석 | |||
| 소 혈청 알부민 | Merck | A7906-100G | 또는 이와 유사한 |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | 인간 세포에 대한 항체는 일반적으로 마우스에서 추출합니다. |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | 또는 유사 |
| BD FACS Accudrop Beads | BD | 345249 | |
| CD31 AF-647 | BD | 561654 | Mouse anti-human |
| CD31 FITC | Immunostep | 31F-100T | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | Mouse anti-human |
| CD41 PE | BD | 555467 | Mouse anti-human |
| CD41 PerCP-Cy5.5 | BD | 333148 | 마우스 anti-human |
| CD42A APC | Immunostep | 42AA-100T | 우리는 불특이적 결합을 관찰했습니다 ... 평가해야 할 사항 |
| : CD42A PE | BD | 마우스 anti-human | |
| CD42B PerCP | Biolegend | 303910 | 마우스 anti-human |
| CD49B PE | BD | 마우스 anti-human | |
| CD61 FITC | BD | 555753 | Mouse anti-human |
| CD71 APC-Cy7 | Biolegend | 334109 | Mouse anti-human |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | Fc blocking - control |
| KIT PE-Cy7 | Biolegend | 313212 | Mouse anti-human |
| Lineage Cocktail 2 FITC | BD | 643397 | Mouse anti-human |
| RNAse | Merck | R6513 | or similar |
| Triton X-500 | Merck | 93443-500ML | 또는 이와 유사한 |
| CellTrics 필터 분류 | |||
| 100 마이크로미터 | Sysmex | 04-004-2328 | 세포 여과기 |
| 참고: 우리는 일반 시약/화학물질 (PBS, EDTA 등) 또는 일회용품 (튜브 등) 또는 이전에 발표된 및 표준 프로토콜에 명시된 시약을 지정하지 않습니다. - 달리 명시되지 않는 한. |
참고문헌
- Italiano, J. E. Unraveling Mechanisms That Control Platelet Production. Semin Thrombosis And Haemostasis. 39 (1), 15-24 (2013).
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The Incredible Journey: From Megakaryocyte Development To Platelet Formation. Journal ....
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