형광 상관 분광법을 사용하여 단백질 응집 감지

Summary

우리는 여기에서 형광 상관 분광학을 사용하여 세포 용해 및 살아있는 세포에 있는 단백질 올리고머 및 응집을 측정하는 절차를 소개합니다.

Abstract

단백질 집계는 근위축성 측삭 경화증(ALS), 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD), 헌팅턴병(HD) 등과 같은 신경퇴행성 질환의 특징이다. 용해성 또는 확산 단백질 올리고머 또는 골재를 검출하고 분석하기 위해 단일 분자 감도를 가진 단일 입자의 확산 속도와 밝기를 감지할 수 있는 형광 상관 분광법(FCS)이 사용되었습니다. 그러나, 단백질 응집 검출을 위한 적당한 절차 그리고 노하우는 널리 공유되지 않았습니다. 여기서, 우리는 세포 용해 및 살아있는 세포에서 응집되기 쉬운 단백질의 확산 특성에 대한 FCS 측정의 표준 절차를 보여줍니다 : ALS 관련 25 kDa 카복실 - 말단 단편타르 DNA /RNA 결합 단백질 43 kDa (TDP25) 및 초옥화물 디뮤타제 1 (SOD1). 대표적인 결과는 녹색 형광 단백질 (GFP)-태그TDP25의 골재의 일부가 뮤린 신경 모세포종 Neuro2a 세포 용액의 수용성 분획에 약간 포함되었다는 것을 보여줍니다. 더욱이, ALS 관련 돌연변이를 운반하는 GFP 태그SOD1은 살아있는 세포에서 느린 확산을 나타낸다. 이에 따라 FCS를 이용한 확산 특성을 통해 단백질 응집을 검출하는 절차를 소개합니다.

Introduction

근위축성 측삭 경화증(ALS), 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 등과 같은 신경퇴행성 질환을 수반하는 단백질^응집은 1세포와 장기에서 독성이 있는 것으로 알려져 있으며 세포및 장기에서 단백질 항상성(proteostasis)을 교란시킬 수 있으며, 그 후^노화2로이어질 수 있다. 단백질 응집의 정리는 치료 전략으로 예상된다; 그러나, 단백질 응집 형성을 방지 하 고 단백질 집계를 저하 하는 화학 물질 (예를 들어, 작은 분자 또는 약물) 아직 설립 되지 않은. 또한, 단백질 집계가 독성을 어떻게 발휘하는지는 여전히 애매합니다. 따라서 단백질 응집과 관련된 연구 프로젝트를 촉진하기 위해 단백질 응집을 감지하기 위해 높은 처리량 절차를 도입하는 것이 중요합니다. 단백질 응집 및 응집 특이적 형광염의 형성을 인식하는 항체를 이용한 단백질 응집 검출은 널리 사용되고 있다^3. 그러나, 특히 그러한 고전적인 절차를 사용하여 살아있는 세포에서 집계를 감지하는 것은 어렵다.

Förster 공명 에너지 전달 (FRET)은 단백질 응집 및 구조적 변화를 검출하는 절차입니다. 그러나, FRET는 단백질 역학(예를 들어, 살아있는 세포에서 단백질의 확산 및 올리고머화)을 분석할 수 없다^3. 따라서, 여기서 는 단일 분자 민감도^4를가진 형광 분자의 확산 특성 및 밝기를 측정하는 형광 상관 분광법(FCS)을 사용하여 용액(예를 들어, 세포 용액) 및 살아있는 세포에서 단백질 응집을 검출하는 간단한 프로토콜을 소개한다. FCS는 레이저 스캔 공초점 현미경(LSM)을 이용하여 광자 계수 방법입니다. 광자 도착 시간의 매우 민감한 광자 검출기 및 자기 상관 기능(ACF)의 계산을 사용하여 검출 부피에서 형광 분자의 시간과 밝기를 통과합니다. 확산은 분자량의 증가로 느려집니다. 따라서, 분자 간 상호 작용은 FCS를 사용하여 추정될 수 있다. 더욱 강력하게, 형광 분자의 밝기의 증가는 분자의 호모 올리고머화를 나타냅니다. 따라서 FCS는 이러한 단백질 응집을 검출하는 강력한 도구입니다.

Protocol

1. 재료 및 시약

1. 세포 배양용 파이로게닉 프리 솔루션 및배지(표 1)를사용하십시오.
2. 초순수를 이용한 생화학실험을 위한 솔루션을 준비하고 DNase/RNase 무료로 사용하십시오.
3. 많은 검사 과정을 통해 세포 배양에 적합한 FBS를 선택합니다. 선택한 FBS 로트가 정기적으로 변경되므로 FBS의 카탈로그 및 로트 번호를 여기에 나타낼 수 없습니다.
4. 플라스미드 DNA
   1. eGFP 단조로운 표현식에 pmeGFP-N1^5를 준비; GFP-TDP25 식에 대한 pmeGFP-C1-TDP25^6; PMEGFP-N1-SOD1-G85R⁷ SOD1-G85R-GFP 발현; 및 pCAGGS^8을 캐리어로 합니다.
      참고: meGFP는 향상된 GFP(eGFP)의 A206K 돌연변이를 운반하는 단황 변이체입니다. TDP25는 TDP-43의 ALS 관련 C 단자 단편이다. SOD1-G85R은 SOD1의 ALS 관련 돌연변이이다.
5. 세포 균주
   1. 뮤린 신경 모세포종 Neuro2a 세포를 사용.
      참고: Neuro2a 세포는 높은 회전 효율과 높게 발현하는 외인성 단백질을 가지고 있습니다. TDP25 발현의 경우 Neuro2a 또는 HEK293 세포와 같은 발현 효율이 높은 세포 균주가 요구된다. HeLa 세포에서, TDP25는 효율적으로 발현될 수 없었습니다.

2. 세포 배양 및 형질

1. 100mm 플라스틱 접시를 준비하여 Neuro2a 세포가 정상 성장 배지에서 반컨소 부유하게 성장합니다.
   참고: 반인성에 도달할 때까지 이전 시드 후 약 48-72시간 동안 37°C에서 배양할 필요가 있다.
2. 매체를 제거합니다.
3. 세포 배양 접시에 트립신-EDTA 용액 0.5mL를 넣고 37°C에서 1분 동안 배양합니다.
4. 일반 성장 배지의 9.5mL를 접시에 넣고 분리된 세포를 중단합니다.
5. Trypan blue를 사용하여 죽은 세포를 염색하고 셀 카운터를 사용하거나 수동으로 셀 수를 계산합니다. 그런 다음 배양 배지에서 세포를 희석시 (1.0 × 10⁵/mL).
6. 셀 리시스를 위한 35mm 플라스틱 접시에 셀 서스펜션 2mL또는 라이브 셀 측정을 위한 유리 베이스 디쉬를 추가합니다.
7. 1 일 동안 37 °C에서 접시를 배양하십시오.
8. 다음 준비를 시작 15 분 전에 형질 전환의 하루 전에.
9. 1.5mL 튜브 2개를 준비하고 각 튜브에 옵티-MEM I 100 μL을 추가합니다.
10. 첫 번째 튜브에서 플라스미드 DNA(솔루션 A)의 1.0 μg를 섞는다. 두 번째 튜브에서 리포펙타민 2000(솔루션 B)의 2.5 μL을 혼합한다.
    참고: 경질 효율을 유지하기 위해 총 DNA 양을 동일하게 유지합니다. 살아있는 세포에서 FCS 측정을 위한 발현 수준을 감소시키기 위하여는, 단백질 발현을 위한 플라스미드 DNA의 분수량(예를 들어, pmeGFP-N1-SOD1-G85R및 0.8 μg의 pCAGGS 혼합물). 더욱이, 리포펙타민의 부피 2000및 플라스미드 DNA의 양 사이에서 동일한 비율을 유지합니다.
11. 용액 A와 B를 튜브에 추가하여 부드럽게 혼합한 다음 실온(솔루션 C)에서 1분 동안 배양합니다.
12. 배양 매체에 솔루션 C를 추가합니다. 및 37°C에서 24시간 동안 세포를 배양한다.

3. 셀 리시스 및 중간 교환

1. 일상적인 현미경을 사용하여 GFP 발현을 확인하십시오.
2. 접시에 매체를 제거합니다.
3. 25°C에서 PBS 2mL를 추가하여 매체를 씻어낸다. PBS를 제거합니다.
4. 분쇄된 얼음 위에 알루미늄 접시위에 접시를 놓습니다.
   참고: 우리는 일요일 도구 상점에서 1mm 두께의 알루미늄 플레이트 를 사용하거나 실험실 장비로 시판할 수 있습니다.
5. 4°C에서 200 μL의 리시스 버퍼를 추가합니다. 버퍼가 접시 바닥에 고르게 분포되도록 접시를 약간 흔들어 줍니다.
6. 셀 스크레이퍼를 사용하여 접시를 긁어 내고 새로운 1.5mL 튜브에서 용해되지 않은 세포 파편으로 용해된 용해를 복구합니다.
7. 4°C에서 5분간 20,400 x g의 용액원심분리기.
8. 새로운 1.5mL 튜브에서 상체를 복구하고 4 °C 또는 얼음에 보관하십시오.
   참고: lysate를 동결하지 마십시오.
9. 라이브 셀 측정의 경우 측정 전에 매체를 교체하십시오. 위상 대비 현미경을 사용하여 세포 부착물을 확인하십시오. 형광 현미경을 사용하여 발현을 확인합니다.

4. 형광 상관 분광법 (FCS) 교정

1. 시스템을 시작하고 운영 소프트웨어를 실행합니다. 아르곤⁺ 레이저 (458/477/488/514 nm)를 켭니다. 시스템을 최소 30분 이상 안정화합니다.
2. 광학 경로 설정: 메인 빔 스플리터: HFT488; 디크로이크 미러: NFT600; 형광 장벽 필터 : 밴드 패스 필터 505-540 (BP505-540); 검출기: 눈사태 포토다이오드 (APD).
3. 값을 직접 입력하여 핀홀 크기를 설정합니다(66 μm; 1 개의 통풍이 좋은 단위).
4. 로다민 6G(Rh6G) 용액을 무대의 커버 글래스 챔버에 넣습니다.
5. 목표에 침수 초순수물을 추가합니다. 침지 오일을 사용하지 마십시오.
6. 현미경 단계에 챔버를 설정합니다. 스테이지를 적절한 위치로 이동합니다.
7. 유리 표면에서 산란된 빛을 측정하여 유리 표면 상부에 초점을 맞춥니다. 목표 렌즈를 아래쪽으로 내려간 후 초점 노브를 시계 방향으로 돌려 조정합니다.
   참고: 일본과 독일의 것과 는 정반대이기 때문에 초점 손잡이의 회전 방향을 확인하십시오.
8. 상부 유리 표면 위의 초점 점 200 μm을 올려 용액의 내부를 관찰합니다.
9. 카운트 비율을 클릭하고 광자 수 비율을 모니터링합니다.
10. 수지 속도 값이 10kHz 이상되도록 점차적으로 aOTF(AOTF) 값(예: 여기 레이저 전송)을 증가시다.
11. 핀홀 조정을 클릭하고 핀홀 조정 마법사를 엽니다. x 축과 y축 모두에서 가장 높은(피크) 광자 수가 있는 핀홀 위치를 찾습니다.
12. 분자당 카운트(CPM) 값이 가장 높은지 있도록 목표 렌즈의 보정 링을 돌립니다.
    참고: 여기에 지정된 챔버의 커버 글래스의 두께는 0.12-0.17 mm이므로 보정 링은 최소 또는 몇 회전에 있으며 CPM이 최대입니다.
13. CPM 값이 2-3kHz가 되도록 AOTF 값을 점진적으로 줄입니다.
14. 90s에 대한 Rh6G의 자기 상관 기능 (ACF)을 획득합니다.
15. 측정이 완료되면 맞춤을 클릭하여 곡선 피팅 분석을 수행합니다.
16. 삼중 상태의 1성분 3차원(3D) 확산을 위한 모델을 선택합니다.
    참고: Rh6G는 단일 분산 및 삼중 상태의 단일 구성 요소 확산입니다.
17. 빨간색 선을 이동하여 피팅 시작 시간을 설정합니다. 모두 적합을 클릭하고 적합 편차를 확인합니다. 커브 피팅을 수행한 후 확산 시간(DT)과 구조 파라미터(SP)가 각각 20-30 μs 및 4-8 범위의 범위인지 확인합니다.
18. 구조 매개 변수 값을 기억하십시오. 동일한 광학 조건하에서 동일한 날에 측정된 모든 ACF의 곡선 피팅 분석에 SP 값을 사용하고 현미경 스테이지에 설정된 동일한 유형의 유리 베이스 디쉬 또는 챔버 커버 글래스를 사용합니다.

5. 세포 리자테의 FCS 측정

1. 셀 리세이트 준비(위 참조).
2. 덮개 유리 챔버에 lysate를 놓습니다. 건조를 피하기 위해 뚜껑을 놓고 조명 을 가꾸기 위해 스테이지 뚜껑을 닫습니다.
3. 획득 조건, 레이저 전력, 측정 시간 및 반복을 설정합니다.
4. 카운트 레이트를 클릭하고 레이저의 AOTF 값을 조정하여 CPM 값이 1kHz 이상이 되도록 합니다.
5. 1분 동안 평가판 측정을 수행합니다. 계산된 ACF가 양수 진폭과 매끄러운 붕괴를 보여 주었는지 확인합니다.
6. 5 분 동안 주요 측정을 수행합니다.
   참고: 측정 시간이 증가하더라도 ACF의 형상이 변경되지 않을 때까지 총 측정 시간이 점차 증가합니다.
7. 곡선 피팅 분석을 수행하려면 맞춤을 클릭합니다.
8. 삼중 상태의 2성분 3D 확산모델을 선택합니다. SP 값을 입력하고 모든 맞춤을 클릭하기 전에 설정을 "무료"가 아닌 "고정"으로 변경해야 합니다.
9. 장착된 테이블을 탭 구분 텍스트 파일로 내보냅니다.
10. 필요한 경우 ACF 및 카운트 속도 레코드를 탭 구분 텍스트 파일로 내보냅니다.

6. 라이브 셀에서 FCS 측정

1. 측정 하기 전에 신선한 매체로 매체를 교체 합니다.
2. 열 단계 인큐베이터를 사용합니다. 현미경 단계에 세포 배양 접시를 설정합니다.
3. 공초점 마이크로페를 사용하여 초점과 위치를 확인합니다. 측정 셀을 선택합니다. 셀 위치를 확대하고 조정합니다. 느린 스캐닝 속도 모드를 사용하여 GFP 표현 세포의 형광 이미지를 획득합니다.
4. "FCS" 섹션의 위치를 사용하여 FCS 측정 위치를 선택합니다.
5. 십자선(그림1)을사용하여 하나 이상의 FCS 측정 점을 선택합니다.
6. ACF를 1분 동안 측정합니다.
   참고: 형광 단백질은 용액에 비해 느린 이동으로 인해 살아있는 세포에서 표백되는 경향이 있기 때문에 측정 시간은 최소해야 합니다. 장기간 측정하면 형광 단백질의 광표백으로 이어질 수 있기 때문에 일반적으로 용액 측정으로 세포에서 ACF를 원활하게 얻는 것은 어렵습니다.
7. 핏을 클릭하여 트리플렛 상태로 2성분 3D 확산을 위한 모델을 사용하여 곡선 피팅 분석을 수행합니다.
   참고: 라이브 셀 측정의 경우, 라이브 셀내 다양한 모바일 부품의 존재로 인해 1성분 3D 확산 모델로 치스퀘어 값을 감소시키기 어렵기 때문에 삼중 상태의 2성분 3D 확산모델이 더 좋을 것이다. 그러나 3성분 3D 확산을 위한 모델을 사용하더라도, 확산 성분은 일반적으로 2성분에 대한 모델을 사용하는 것에 비해 분리되지 않는다.

Results

우리는 살아있는 세포에서 세포 용액 및 SOD1-G85R-GFP에서 GFP-TDP25의 FCS 측정을 수행했습니다. 두 경우 모두, 양수 진폭과 부드러운 ACF를 획득할 수 있었습니다. 우리는 Neuro2a 세포에서 발현된 GFP-TDP25의 일부가 표시된 조건⁶하에서 수용성 분획에서 회복되었다는 것을 보여주었습니다. 세포 용액의 수용성 분획에서, 매우 밝은 형광 분자는 FCS를 사용하여 광자 수 속도 기록에서 검출되었다(도2A,상단, 화살표). 이러한 "스파이크(burst)라고도 함)"은 GFP 단량체 및 단분산 화학 형광염 용액에서 관찰되지 않았으며, 이는 스파이크가 올리고황 단백질^9을나타낸다는 것을 시사한다. 삼중 상태에서 2성분 3D 확산을 가정하는 모델을 이용한 곡선 피팅 분석은 빠른 확산 분자(DT_Fast = 186 μs)가 ~90%이고 나머지 10%는 2.3m...

Discussion

측정 전에 시스템 교정에 관해서는, 샘플을 측정하는 데 사용되는 것과 동일한 유리 제품이 사용되어야한다 (예를 들어, 8 웰은 셀 용해및 살아있는 세포를위한 35mm 유리 베이스 디쉬에 대한 유리 챔버를 커버)를 사용해야합니다. 유리에 Rh6G의 흡착 때문에, 그것의 효과적인 농도 때때로 감소할 수 있습니다. 그렇다면 1 μM과 같은 고농축 Rh6G 용액은 핀홀 조정에만 사용해야 합니다. 검출기(예: 1000kHz 이상)를 보호하기 위해 매우 높은 광자 수 비율을 피해야 합니다. 또한, 농축 된 솔루션은 자기 상관 기능 (100 kHz 미만 유지)의 획득에 적합하지 않습니다. 핀홀 위치의 보정이 중요합니다. 광학 시스템을 자주 사용하는 경우 핀홀의 극적으로 탈구하는 경우는 드뭅니다. 따라서, 처음에 "Fine"을 사용하는 것은 종종 적절한 위치를 찾는 데 문제가 되지 않습니다. "Fine"을 사용하여 카운트 속도의 피크 위치가 없는 경우 "굵은"을 사용하여 "Fine"을 사용하여 위치 찾기 전에 모션 범위의 한쪽 끝에서 다른 쪽...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% (w/v) 트립신-1 mmol/L EDTA · 페놀 레드(트립신-EDTA)를 함유한 4Na 용액Fujifilm	Wako Pure Chemical Corp.	201-16945
100mm 플라스틱 접시	CORNING	430167
35mm 유리 베이스 접시	IWAKI	3910-035	라이브 셀 측정용
35mm 플라스틱 접시	Thermo Fisher Scientific	150460
알루미늄 플레이트	Bio-Bik	AB-TC1
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27	칼 자이스		대물렌즈
셀 스크레이퍼	스미토모 베이클라이트 주식회사	MS-93100
셀룰로오스 아세테이트 필터 멤브레인(0.22mm)	어드밴텍 Toyo	25CS020AS
커버 유리 챔버 8-웰	IWAKI	5232-008	용액 측정용
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	기저 배지
소 태아 혈청(FBS)	바이오세라		로트 확인 필요
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
LSM510 META + ConfoCor3	Carl Zeiss		FCS 시스템
쥐 신경모세포종 Neuro2a 세포	ATCC	CCL-131	세포주
Opti-MEM I	Thermo Fisher Scientific	31985070
pCAGGS	RIKEN	RDB08938	형질주입 담체용 플라스미드 DNA
페니실린-스트렙토마이신 용액 (× 100 )	후지 필름 Wako 순수 화학 주식 회사	168-23191
pmeGFP-C1-TDP25			PLASMID DNA for TDP25 for monomeric eGFP
pmeGFP-N1			Plasmid DNA for eGFP monomer expression
pmeGFP-N1-SOD1-G85R			Plasmid DNA for ALS linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8304