형광 상관 분광법을 사용하여 단백질 응집 감지

Summary

우리는 여기에서 형광 상관 분광학을 사용하여 세포 용해 및 살아있는 세포에 있는 단백질 올리고머 및 응집을 측정하는 절차를 소개합니다.

Abstract

단백질 집계는 근위축성 측삭 경화증(ALS), 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD), 헌팅턴병(HD) 등과 같은 신경퇴행성 질환의 특징이다. 용해성 또는 확산 단백질 올리고머 또는 골재를 검출하고 분석하기 위해 단일 분자 감도를 가진 단일 입자의 확산 속도와 밝기를 감지할 수 있는 형광 상관 분광법(FCS)이 사용되었습니다. 그러나, 단백질 응집 검출을 위한 적당한 절차 그리고 노하우는 널리 공유되지 않았습니다. 여기서, 우리는 세포 용해 및 살아있는 세포에서 응집되기 쉬운 단백질의 확산 특성에 대한 FCS 측정의 표준 절차를 보여줍니다 : ALS 관련 25 kDa 카복실 - 말단 단편타르 DNA /RNA 결합 단백질 43 kDa (TDP25) 및 초옥화물 디뮤타제 1 (SOD1). 대표적인 결과는 녹색 형광 단백질 (GFP)-태그TDP25의 골재의 일부가 뮤린 신경 모세포종 Neuro2a 세포 용액의 수용성 분획에 약간 포함되었다는 것을 보여줍니다. 더욱이, ALS 관련 돌연변이를 운반하는 GFP 태그SOD1은 살아있는 세포에서 느린 확산을 나타낸다. 이에 따라 FCS를 이용한 확산 특성을 통해 단백질 응집을 검출하는 절차를 소개합니다.

Introduction

근위축성 측삭 경화증(ALS), 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 등과 같은 신경퇴행성 질환을 수반하는 단백질^응집은 1세포와 장기에서 독성이 있는 것으로 알려져 있으며 세포및 장기에서 단백질 항상성(proteostasis)을 교란시킬 수 있으며, 그 후^노화2로이어질 수 있다. 단백질 응집의 정리는 치료 전략으로 예상된다; 그러나, 단백질 응집 형성을 방지 하 고 단백질 집계를 저하 하는 화학 물질 (예를 들어, 작은 분자 또는 약물) 아직 설립 되지 않은. 또한, 단백질 집계가 독성을 어떻게 발휘하는지는 여전히 애매합니다. 따라서 단백질 응집과 관련된 연구 프로젝트를 촉진하기 위해 단백질 응집을 감지하기 위해 높은 처리량 절차를 도입하는 것이 중요합니다. 단백질 응집 및 응집 특이적 형광염의 형성을 인식하는 항체를 이용한 단백질 응집 검출은 널리 사용되고 있다^3. 그러나, 특히 그러한 고전적인 절차를 사용하여 살아있는 세포에서 집계를 감지하는 것은 어렵다.

Förster 공명 에너지 전달 (FRET)은 단백질 응집 및 구조적 변화를 검출하는 절차입니다. 그러나, FRET는 단백질 역학(예를 들어, 살아있는 세포에서....

Protocol

1. 재료 및 시약

1. 세포 배양용 파이로게닉 프리 솔루션 및배지(표 1)를사용하십시오.
2. 초순수를 이용한 생화학실험을 위한 솔루션을 준비하고 DNase/RNase 무료로 사용하십시오.
3. 많은 검사 과정을 통해 세포 배양에 적합한 FBS를 선택합니다. 선택한 FBS 로트가 정기적으로 변경되므로 FBS의 카탈로그 및 로트 번호를 여기에 나타낼 수 없습니다.
4. 플라스미드 DNA
   1. eGFP 단조로운 표현식에 pmeGFP-N1^5를 준비; GFP-TDP25 식에 대한 pmeGFP-C1-TDP25^6; PMEGFP-N1-SOD1-G85R⁷ SOD1-G85R-GFP 발현; 및 pCAGGS^8을 캐리어로 합니다.
      참고: meGFP는 향상된 GFP(eGFP)의 A206K 돌연변이를 운반하는 단황 변이체입니다. TDP25는 TDP-43의 ALS 관련 C 단자 단편이다. SOD1-G85R은 SOD1의 ALS 관련 돌연변이이다.
5. 세포 균주
   1. 뮤린 신경 모세포종 Neuro2a 세포를 사용....

Results

우리는 살아있는 세포에서 세포 용액 및 SOD1-G85R-GFP에서 GFP-TDP25의 FCS 측정을 수행했습니다. 두 경우 모두, 양수 진폭과 부드러운 ACF를 획득할 수 있었습니다. 우리는 Neuro2a 세포에서 발현된 GFP-TDP25의 일부가 표시된 조건⁶하에서 수용성 분획에서 회복되었다는 것을 보여주었습니다. 세포 용액의 수용성 분획에서, 매우 밝은 형광 분자는 FCS를 사용하여 광자 수 속도 기록에서 검출되었다(도2A,상단, 화살표). 이러한 "스파이크(burst)라고도 함)"은 GFP 단량체 및 단분산 화학 형광염 용액에서 관찰되지 않았으며, 이는 스파이크가 올리고황 단백질^9을나타낸다는 것을 시사한다. 삼중 상태에서 2성분 3D 확산을 가정하는 모델을 이용한 곡선 피팅 분석은 빠른 확산 분자(DT_Fast = 186 μs)가 ~90%이고 나머지 10%는 2.3m.......

Discussion

측정 전에 시스템 교정에 관해서는, 샘플을 측정하는 데 사용되는 것과 동일한 유리 제품이 사용되어야한다 (예를 들어, 8 웰은 셀 용해및 살아있는 세포를위한 35mm 유리 베이스 디쉬에 대한 유리 챔버를 커버)를 사용해야합니다. 유리에 Rh6G의 흡착 때문에, 그것의 효과적인 농도 때때로 감소할 수 있습니다. 그렇다면 1 μM과 같은 고농축 Rh6G 용액은 핀홀 조정에만 사용해야 합니다. 검출기(예: 1000kHz 이상)를 보호하기 위해 매우 높은 광자 수 비율을 피해야 합니다. 또한, 농축 된 솔루션은 자기 상관 기능 (100 kHz 미만 유지)의 획득에 적합하지 않습니다. 핀홀 위치의 보정이 중요합니다. 광학 시스템을 자주 사용하는 경우 핀홀의 극적으로 탈구하는 경우는 드뭅니다. 따라서, 처음에 "Fine"을 사용하는 것은 종종 적절한 위치를 찾는 데 문제가 되지 않습니다. "Fine"을 사용하여 카운트 속도의 피크 위치가 없는 경우 "굵은"을 사용하여 "Fine"을 사용하여 위치 찾기 전에 모션 범위의 한쪽 끝에서 다른 쪽.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% (w/v) 트립신-1 mmol/L EDTA · 페놀 레드(트립신-EDTA)를 함유한 4Na 용액Fujifilm	Wako Pure Chemical Corp.	201-16945
100mm 플라스틱 접시	CORNING	430167
35mm 유리 베이스 접시	IWAKI	3910-035	라이브 셀 측정용
35mm 플라스틱 접시	Thermo Fisher Scientific	150460
알루미늄 플레이트	Bio-Bik	AB-TC1
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27	칼 자이스		대물렌즈
셀 스크레이퍼	스미토모 베이클라이트 주식회사	MS-93100
셀룰로오스 아세테이트 필터 멤브레인(0.22mm)	어드밴텍 Toyo	25CS020AS
커버 유리 챔버 8-웰	IWAKI	5232-008	용액 측정용
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	기저 배지
소 태아 혈청(FBS)	바이오세라		로트 확인 필요
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
LSM510 META + ConfoCor3	Carl Zeiss		FCS 시스템
쥐 신경모세포종 Neuro2a 세포	ATCC	CCL-131	세포주
Opti-MEM I	Thermo Fisher Scientific	31985070
pCAGGS	RIKEN	RDB08938	형질주입 담체용 플라스미드 DNA
페니실린-스트렙토마이신 용액 (× 100 )	후지 필름 Wako 순수 화학 주식 회사	168-23191
pmeGFP-C1-TDP25			PLASMID DNA for TDP25 for monomeric eGFP
pmeGFP-N1			Plasmid DNA for eGFP monomer expression
pmeGFP-N1-SOD1-G85R			Plasmid DNA for ALS linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8304