여기서 우리는 MALDI-TOF-TOF 탠덤 질량 분광법 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 사내에서 개발된 단백질을 신속히 서열화한 병원성 박테리아에 의해 생성되는 단백질의 신속한 식별을 위한 프로토콜을 제시합니다. 메타안정 단백질 이온 단편 때문에 아파르트산 효과 및 이러한 특이성은 단백질 식별을 위해 이용된다.
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방법 논문
MALDI-TOF-TOF-MS/MS 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 대장균에 있는 항균 면역 단백질의 식별
이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜은 bactericidal 효소의 면역 단백질을 식별합니다: 복리신 E3 및 박테리아는 항생제 유도를 사용하여 병원성 대장균 균주에 의해 생성되고, MALDI-TOF-TOF 탠덤 질량 분광및 하향식 프로테오믹 분석에 의해 확인된 것으로, 사내에서 개발된 소프트웨어와 함께. 배리신 E3(Im3)의 면역 단백질과 박테리오신(Im-Bac)의 면역 단백질은 산성, 글루타믹산 및 아스파라진 잔류물의 C-말단 측에서 폴리펩타이드 백본 분열(PBC)에 의해 생성된 눈에 띄는 b-및/또는 y형 단편 이온으로부터 확인되었다. 이 소프트웨어는 세균균의 전체 게놈 염기서열분석에서 파생된 실리코 단백질 서열에서 빠르게 스캔합니다. 또한 이 소프트웨어는 성숙한 단백질 서열이 잘린 경우 단백질 서열의 아미노산 잔류물을 반복적으로 제거합니다. 단일 단백질 서열은 각 면역 단백질에 대해 검출된 것과 일치하는 질량 및 단편 이온을 소유했습니다. 그런 다음 후보 순서를 수동으로 검사하여 감지된 모든 조각 이온을 할당할 수 있는지 확인했습니다. Im3의 N 단말 메티오닌은 번역 후 제거된 반면 임박은 완전한 시퀀스를 가졌다. 또한, 우리는 PBC에 의해 형성된 2개 또는 3개의 비보완 단편 이온만이 올바른 단백질 서열을 식별하는 데 필요하다는 것을 발견했습니다. 마지막으로, 프로모터(SOS box)는 세균균균의 플라스미드 게놈에서 항균 및 면역 유전자의 상류로 확인되었다.
서론
질량 분석법에 의한 소화되지 않은 단백질의 분석 및 식별을 하향식 프로테오믹 분석1,2,3,4라고합니다. 현재 는 전기분무 이온화(ESI)5 및 고해상도 질량 분석기6,정교한 해리 기술, 예를 들어 전자 전달 해리(ETD), 전자 포획 해리(ECD)7,자외선 광 해리(UV-PD)8등을 활용하는 확립된 기술이다.
다른 소프트 이온화 기술은 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화(MALDI)9,10,11은 하향식 분석에 덜 광범위하게 활용되고 있으며, 이는 주로 다른 질량 분석기와 비교하여 해상도가 제한된 비행 시간(TOF) 질량 분석기와 결합되기 때문이다. 이러한 한계에도 불구하고 MALD....
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프로토콜
1. 미생물 샘플 준비
- 루리아 국물(LB)의 접종 25mL은 멸균 1 μL 루프를 이용하여 글리세롤 스톡으로부터 대장균 O113:H21 균주 RM7788(또는 다른 세균균균)을 가진 50mL 원추형 튜브에서 접종하였다. 튜브 및 사전 배양을 37°C에서 4시간 동안 흔들림(200rpm)으로 캡합니다.
- 사전 배양된 국물의 알리쿼트 100 μL을 LB 한천 판에 퍼지고 미토마이신-C의 400 또는 800 ng/mL로 보충됩니다. 배양 식도는 37 °C의 인큐베이터에서 하룻밤 동안 정전기로 접시를 냅니다.
주의: STEC 균주는 병원성 미생물입니다. BSL-2 생물 안전 캐비닛에서 배양 을 넘어 모든 미생물 조작을 수행합니다. - 멸균 1 μL 루프를 사용하여 단일 가시 식민지에서 세균 세포를 수확하고 HPLC 급 물의 300 μL을 포함하는 2.0mL O 링 안감 나사 -캡 미세 원심 분리 튜브로 전송합니다. 튜브, 소용돌이, 원심분리기를 11,337 x g에서 2분 동안 캡하여 세포를 펠릿합니다.
2. 질량 분석
- 스테인레스 스틸 MALDI 대상에 샘플 상류체의 점 0.75 μL 알리쿼트 및 건조 할 수 있습니다. 건조된 시료 반점....
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결과
도 3(상단 패널)는 400 ng/mL 미토마이신-C로 보충된 LBA에서 하룻밤 사이에 배양된 STEC O113:H21 균주 RM7788의 MS를 나타낸다. m/z 7276, 7337 및 7841의 피크는 이전에 감기 충격 단백질 C(CspC), 냉쇼크 단백질 E(CspE), 및 알 수 없는 기능의 플라스미드 매개단백질로확인되었다. m/z 9780 [M+H]+에서의 단백질 이온은 도 3(하단 패널)에 도시된 바와 같이 MS/MS-PSD에 의해 분석되었다. 전구체 이온은 시간 시간 이온 선택기 (TIS) 창±100 Da. 조각 이온은 m / z 및 유형 / 번호로 식별하여 격리되었다. m/z 2675.9(별과 함께 강조)의 단편 이온은 도 3(상단 패널)에 도시된 m/z 9655에서 메타안정 단백질 이온의 해리.......
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토론
프로토콜 고려 사항
현재 프로토콜의 주요 강점은 속도, 샘플 준비의 단순성 및 비교적 작동, 훈련 및 유지 보수가 쉬운 계측기의 사용입니다. 액체 크로마토그래피-ESI-HR-MS에 의한 상향식 및 하향식 프로테오믹 분석은 MALDI-TOF-TOF의 하향식에 대한 여러 면에서 유비쿼터스이며 훨씬 우수하지만 더 많은 시간, 노동 및 전문 지식이 필요합니다. 악기 복잡성은 종종 특정 악기 플랫폼이 대량 분석에서 공식적으로 훈련되지 않은 과학자들에 의해 채택 될 가능성이 있는지 여부에 영향을 미칠 수 있습니다. MALDI-TOF-TOF를 사용한 하향식 접근법은 임상 미생물학 실험실에서 박테리아의 분류학적 식별을 위해 현재 사용이 아닌 MALDI-TOF-MS의 분석을 확장하는 동시에 분석에 필요한 노동, 복잡성 또는 전문 지식을 크게 증가시키지 않기 위한 것입니다.
프로토콜은 기계적(또는 전기적) 셀 리시스 단계를 사용하지 않습니다. 분비 또는 세포외 .......
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공개 사항
저자는 이해상충이 없습니다.
감사의 글
단백질 바이오마커 시커 소프트웨어는 clifton.fagerquist@usda.gov 클리프턴 K. Fagerquist에 연락하여 자유롭게 사용할 수 있습니다(무료). 우리는 ARS에 의해이 연구의 지원을 인정 하고자, USDA, CRIS 교부금: 2030-42000-051-00-D.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 4000 시리즈 탐색기 소프트웨어 | AB Sciex | 버전 3.5.3 | |
| 4800 Plus MALDI TOF / TOF 분석기 | AB Sciex | ||
| Acetonitrile Optima LC / MS 등급 | Fisher Chemical | A996-1 | |
| BSL-2 생물학적 위험 캐비닛 | The Baker Company | SG403A-HE | |
| 사이토크롬 -C | 시그마 | C2867-10MG | |
| 데이터 탐색기 소프트웨어 | AB Sciex | 버전 4.9 | |
| 초점 단백질 환원-알킬화 키트 | G-Biosciences, | 786-231 | |
| GPMAW 소프트웨어 | Lighthouse 데이터 | 버전 10.0 | |
| 인큐베이터 | , VWR | 9120973 | |
| LB Agar | Invitrogen | 22700-025 | |
| Luria Broth | Invitrogen | 12795-027 | |
| 라이소자임 | Sigma | L4919-1G | |
| 마이크로 원심분리기 튜브, 2 mL, 나사 캡, O-링 | Fisher Scientific | 02-681-343 | |
| MiniSpin Plus 원심분리기 | Eppendorf | 22620207 | |
| Mitomycin-C (from streptomyces) | Sigma-Aldrich | M0440-5MG | |
| Myoglobin | Sigma | M5696-100MG | |
| Shaker MaxQ 420HP 모델 420 | Thermo Scientific | 모델 420 | |
| Sinapinic acid | Thermo Scientific | 1861580 | |
| Sterile 1 uL loops | Fisher Scientific | 22-363-595 | |
| Thioredoxin (E. coli, recombinant) | Sigma | T0910-1MG | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537-100G | |
| Water Optima LC/MS 등급 | 피셔 케미컬 | W6-4 |
참고문헌
- Fornelli, L., et al. Accurate sequence analysis of a monoclonal antibody by top-down and middle-down orbitrap mass spectrometry applying multiple ion activation techniques. Analytical Chemistry. 90 (14), 8421-8429 (2018).
- Fornelli, L., et al.
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재인쇄 및 허가
