번역 조절에서 RNA 단백질 상호 작용을 연구하는 광학 핀셋

요약

이 프로토콜은 광학 핀셋을 사용하여 RNA 단백질 상호 작용을 연구하기위한 완벽한 실험 워크플로우를 제공합니다. 공초점 현미경 검사법과 광학 핀셋의 조합을 포함하여 몇 가지 가능한 실험 설정이 설명되어 있습니다.

초록

RNA는 기능에 필수적인 다양한 구조 접을 채택하여 세포의 다양한 프로세스에 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, RNA의 구조 및 기능은 단백질, 대사산물 또는 기타 RNA와 같은 다양한 트랜스 작용 요인에 의해 변조될 수 있다. 프레임 변속 RNA 분자는, 예를 들면, 다른 개방독서 프레임으로 리보솜을 직접 번역하는 코딩 지구에 있는 규제 RNA이고, 그 에 의해 유전자 스위치로 작동합니다. 그(것)들은 또한 단백질 또는 그밖 트랜스 인자에 결합한 후에 다른 주름을 채택할 수 있습니다. 번역에서 RNA 결합 단백질의 역할을 해부하고 RNA 구조와 안정성을 조절하는 방법을 해부하기 위해 이러한 RNA 단백질 복합체의 상호 작용 및 기계적 특징을 동시에 연구하는 것이 중요합니다. 이 연구는 단일 분자 형광 결합 광학 핀셋을 사용하여 고해상도로 RNA 단백질 복합체의 형성 및 열역학 적 풍경을 탐구하는 방법을 보여줍니다. 예를 들어, ZS-CoV-2 프로그래밍된 리보소말 프레임 변속 요소와 아연 핑거 항바이러스 단백질의 짧은 이소폼을 결합한 상호작용이 정교화된다. 또한, 형광 라벨리보솜은 공초점 유닛을 사용하여 모니터링하여 궁극적으로 번역 신장의 연구를 가능하게 했습니다. 형광 결합 OT 분석은 다양한 RNA 단백질 복합체 또는 번역을 조절하는 트랜스 작용 인자를 탐구하기 위해 널리 적용 될 수 있으며 RNA 기반 유전자 조절의 연구를 용이하게 할 수 있습니다.

서론

MRNAs를 통해 DNA에서 단백질로 유전 정보의 전송은 세포 내의 거대 분자 상호 작용을 통해 모든 수준에서 정확하게 규제되는 복잡한 생화학 과정입니다. 번역 조절을 위해 RNA-단백질 상호 작용은 다양한 자극및 신호^1,2에 신속하게 반응하는 중요한 역할을 부여합니다. 일부 RNA 단백질 상호 작용은 mRNA 안정성에 영향을 미치고 따라서 RNA가 번역 활성시간을 변경합니다. 그밖 RNA 단백질 상호 작용은 정지 코돈 판독과 같은 재코딩 기계장치와 연관됩니다, 우회, 또는 프로그램된 리보소말 프레임 변속 (PRF)3,4,5,6,7. 최근에는 다수의 RNA 결합 단백질(RBP)이 자극성 mRNA 원소 및 번역 기계와 상호 작용하여 셀^7,8,9,10,11에서....

프로토콜

1. 샘플 준비

1. 핸들 서열로 작용하는 람다 DNA 단편을 포함하는 벡터내관심서열을 복제한다(도 2)^43,50.
2. 먼저 PCR을 통해 후속 체외 전사를 위한 DNA 템플릿을 생성한다(도 2B; 반응 1). 이 PCR 단계에서, T7 프로모터는 감각 DNA 분자^32,33,43,50의 끝에 추가됩니다. 표 1에 따라 PCR 반응을 설정합니다. 온도 사이클러에서 적절한 사이클로 50 μL 알리코에서 PCR을 실행합니다.
3. 두 개의 별도의 PCR 반응(표 1, 그림 2B; 반응 2 및 3)으로 핸들을 준비합니다. 먼저 PCR별로 5' 핸들을 생성합니다. 이어....

결과

이 섹션에서는, 초점은 주로 형광 광학 핀셋에 의한 RNA 단백질/리간드 상호작용의 측정에 주어집니다. 일반적인 RNA 광학 핀셋 실험 및 해당 대표 결과에 대한 설명을 보려면 ^see32. RNA/DNA 단백질 상호 작용 에 대한 자세한 논의를 위해 ^{1,26,59,60을 참조하십시오}.

원칙적으로, RNA에 대한 관심의 RBP 또는 다른 트랜스 작용 계수의 결합은 분자의 형성을 안정화, 불안정성 또는 변경할 수 있습니다. 아래, 각 효과에 대한 기계적 관찰의 묘사가 표시됩니다. 그러나, 주어진 RNA 단백질 복합체에 대해 관찰된 실제.......

토론

여기서는 다양한 리간드를 사용한 RNA 분자의 상호 작용과 동적 행동을 연구하기 위해 형광 결합 광학 핀셋의 사용을 입증합니다. 아래에서 현재 기술의 중요한 단계와 한계에 대해 설명합니다.

프로토콜의 중요한 단계
다른 많은 방법에 관해서는, 샘플의 품질은 신뢰할 수있는 데이터를 얻기 위해 중추적 인이다. 따라서 가능한 최고 품질의 샘플을 얻으려면 시료 준비를 위한 절차를 최적화하는 데 시간을 할애할 가치가 있습니다. 최적화 단계에는 적절한 프라이머 설계, 어닐링 온도, RNA 및 단백질 정화 단계가 포함됩니다.

RNase 가 없는 조건을 유지하기 위해서는 실험 전반에 걸쳐 필터링된 팁과 솔루션을 사용하는 것이 중요합니다. 또한, 미세 유체 시스템은 사용하지 않을 때 표백제에 보관됩니다. 측정을 시작하기 전에 티오술파테 나트륨과 RNase 가 없는 물로 시스템을 적절하게 세척하여 시스템에서 표백제.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Bacterial Strains
E. coli HB101	lab collection	벡터	의 클로닝
Chemicals and enzymes
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	31424	Buffers
Biotin-16-dUTP	Roche	11093070910	Biotinylation
BSA	Sigma-Aldrich	A4737	Buffers
Catalase	Lumicks	N/A	산소 scavanger 시스템
Dithiothreitol (DTT)	Melford Labs	D11000	Buffers
DNAse I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	D4527	in vitro transcription
dNTPs	Th.Geyer	11786181	PCR
EDTA	시그마 -알드리치	E9884	완충액
포름 아미드	시그마 알드리치	11814320001	완충액
포도	시그마 -알드리치	G8270-1KG	산소 scavanger 시스템
포도당 - 산화 효소	Lumicks	N / A	산소 scavanger 시스템
HEPES	Carl Roth	HN78.3	버퍼
염화 마그네슘	Carl Roth	2189.1	완충
Phusion DNA 중합효소	NEB	M0530L	Gibson 어셈블리, 클로닝
염화칼륨	Merck	529552-1KG	완충액
PrimeSTAR GXL DNA 중합효소	Takara Bio Clontech	R050A	PCR
피로인화효소, 열안정제, 무기	NEB	M0296L	체외 전사
RNase 억제제	Molox	1000379515	Buffers
rNTPS	life technologies	R0481	in vitro transcription
sodium thiosulophate	Sigma-Aldrich	S6672-500G	Bleach deactivation
Sytox Green	Lumicks	N/A	컨포칼 측정
T4 DNA 중합효소	NEB	M0203S	비오틴화,
T5 엑소뉴클레아제	NEB	M0363S	Gibson 어셈블리, T7
RNA 중합효소	내	생산 N/A	체외 전사
Taq DNA 중합효소	NEB	M0267S	PCR
Taq 리가제	Biozym	L6060L	Gibson 어셈블리, 복제
TWEEN 20 BioXtra	Sigma-Aldrich	P7949	Buffers
Kits
모놀리식 단백질 라벨링 키트 RED-NHS 2세대(아민 반응성)	나노템	MO-L011	리보솜 라벨링에 사용
Purefrex 2.0	GeneFrontier	PF201-0.25-EX	리보솜 라벨링에 사용
올리고뉴클레오티드
5' 핸들 T7 포워드	Microsynth	맞춤 주문	5' - CTTAATACGACTCACTATAGGTC CTTTCTGTGGACGCC - 3', PCR 1
3' handle reverse	Microsynth	custom order	5' - 에서 OT in vitro transcription template을 생성하는 데 사용됩니다. GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', PCR 1
5' 핸들 포워드	Microsynth	사용자 정의 순서	5' - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3' , PCR 2에서 5' 핸들을 생성하는 데 사용
5' 핸들			' - CATAAATACCTCTCTTACTAATATA TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3', PCR 2에서 5' 핸들을 생성하는 데 사용
3' 핸들 포워드	Microsynth	사용자 정의 주문	5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC AG - 3', PCR 3에서 3' 핸들을 생성하는 데 사용
' 핸들 역방향 5' digoxigenin	Microsynth	사용자 정의 주문	5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', PCR 3
DNA vectors
pMZ_OT	사내에서 생산된	N/A	추가 설명 "Cardiovirus 2A 단백질의 구조 연구는 RNA 인식 및 번역 제어를 위한 분자 기초를 밝힙니다" 크리스 H. 힐, 소산 냅틴, 루카스 페카렉, 아누자 키베, 앤드류 E. 퍼스, 스티븐 C. 그레이엄, 네바 칼리스칸, 이안 브라이얼리 bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035
Software and Algorithms
Atom		https://atom.io/packages/ide-python N/A
Bluelake	Lumicks	N/A
Graphpad	https://www.graphpad.com/	N/A
InkScape 0.92.3	https://inkscape.org/	N/A
Matlab	https://www.mathworks.com/products/matlab.html	N/A
감자 https://github.com/lpekarek/POTATO.git		N/A
RNA 구조	https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html	N/A
스파이더	https://www.spyder-ide.org/	N/A
Other
Streptavidin 코팅 폴리스티렌 입자, 1.5-1.9 &마이크로; m, 5 ml, 1.0% w/v	Spherotech	SVP-15-5
안티-디곡시제닌 코팅 폴리스티렌 입자, 2.0-2.4 &마이크로; m, 2 ml, 0.1% w/v	Spherotech	DIGP-20-2
주사기	VWR	TERUMO SS+03L1
Devices
C-trap	Lumicks	N/A	컨포칼 현미경과 결합된 광학 핀셋

당 액 복제 사퍼 5 3에서 3' 핸들을 생성하는 데 사용됨