근접-리깅-분석기 사용 이체 유체 전단 응력 조건 하에서 TGFβ/BMP/SMAD 신호의 시각화 및 정량화

요약

여기서, 병리학및 생리학적 유체 전단 응력 조건에 노출된 내피 세포에서 근접 계각 분석(PLA)을 사용하여 여러 SMAD 복합체를 동시에 시각화하고 분석하는 프로토콜을 수립합니다.

초록

성장인자 β 변형(TGFβ)/뼈 형태유전학 단백질(BMP) 시그널링은 혈관시스템의 발달 및 항상성 동안 엄격하게 조절되고 균형을 이루며, 따라서 이 신호 경로에서 의변조절은 폐동맥 고혈압, 유전출혈성 및 혈관경화와 같은 심한 혈관 병리를 초래한다. 혈관의 가장 안쪽 층인 내피 세포(EC)는 유체 전단 응력(SS)에 지속적으로 노출됩니다. 유체 SS의 비정상적인 패턴은 TGFβ/BMP 시그널링을 향상시키는 것으로 나타났으며, 이는 다른 자극과 함께, 괴로발생을 유도한다. 이와 관련하여, 아테로경향이, 낮은 라미나르 SS는 TGFβ/BMP 신호를 향상시키는 동시에 높은 라미나르 SS를 향상시키는 것으로 밝혀졌으며, 이 신호는 감소시킨다. 이러한 경로의 활성화를 효율적으로 분석하기 위해, 우리는 상용 공압 펌프 시스템과 근접 계합 분석 (PLA)를 사용하여 낮은 라미나르 SS 및 높은 라미나르 SS 조건하에서 전사 인자 복합체의 형성을 조사하기 위해 워크플로우를 설계했습니다.

활성 TGFβ/BMP 신호는 두 개의 규제 SMADs(R-SMAD)로 구성된 트리메릭 SMAD 복합체의 형성을 필요로 한다. SMAD2/3 및 SMAD1/5/8 TGFβ 및 BMP 시그널링에 대한 각각)을 공통 중재자 SMAD(공동 SMAD; SMAD4). 트리메릭 SMAD 복합체, 즉 R-SMAD/공동 SMAD 또는 R-SMAD/R-SMAD의 상이한 하위 단위를 대상으로 하는 PLA를 사용하여 활성 SMAD 전사 인자 복합체의 형성은 형광 현미경을 사용하여 정량적으로 그리고 공간적으로 측정될 수 있다.

6개의 작은 병렬 채널이 있는 플로우 슬라이드를 사용하면 연재하여 연결할 수 있으며, 전사 인자 복합 형성 및 필요한 컨트롤의 포함에 대한 조사를 가능하게 합니다.

여기에 설명된 워크플로우는 다른 유체 SS 조건에서 SMAD가 아닌 다른 전사 인자 복합체에 대한 SMAD의 근접성을 대상으로 하는 연구에 쉽게 적응할 수 있습니다. 여기에 제시된 워크플로우는 정량적으로나 공간적으로 모두 EC에서 유도된 TGFβ/BMP 신호를 연구하는 빠르고 효과적인 방법을 보여줍니다.

서론

변형 성장 인자 베타 (TGFβ) 슈퍼 패밀리의 단백질은 TGFβs, 뼈 형태 유전학 단백질 (BmPs), 및 Activins1,2를 포함한 다양한 구성원을 가진 흉골 사이토카인이다. 리간드 결합은 인산화로 이어지는 수용체 올리고머의 형성을 유도하고, 이에 의해, 세포조절SMAD(R-SMAD)의 활성화를 유도한다. 리간드의 하위 패밀리에 따라 다른 R-SMAD가 활성화됩니다^1,2. TGFβs 및 액티빈은 주로 SMAD2/3의 인산화를 유도하는 반면, BMP는 SMAD1/5/8 인산화를 유도합니다. 그러나, BmPs와 TGFβs/Activins는 또한 '측면 신호'^3,4,5,6,7,8로 불리는 프로세스에서 각각다른 하위 가족의 R-SMADs를 활성화하고 SMAD1/5 및 SMAD2/

프로토콜

1. 세포 배양 및 유체 전단 응력 노출

참고: 인간 배꼽 정맥 IC(HUVECs)는 SMADs의 SS 유도 상호 작용을 연구하는 예로 사용되었습니다. 아래에 설명된 프로토콜은 모든 SS 반응형 세포 유형에 적용될 수 있다.

1. PBS에서 0.1% 돼지 피부 젤라틴으로 6채널 슬라이드를 37°C에서 30분 동안 코팅합니다.
2. M199 풀 배지의 30 μL에서 mL당 2.5 x ¹⁰⁶ 셀의 밀도로 미리 코팅된 6채널 슬라이드의 시드 HUVECs.
   참고: 유량 슬라이드에서 셀을 시드하는 방법에 대한 자세한 내용은 참조^{24를 참조하십시오24}를 참조하십시오.
3. 가습 된 인큐베이터에서 세포가 37 °C에서 1 h를 부착하십시오.
4. 미리 따뜻해지는 M199 전체 매체의 60 μL을 각 저장소에 추가합니다.
5. 가습 인큐베이터에서 하루에 한 번 37 °C에서 부드러운 중간 교환으로 2 일 동안 배양하십시오.
   1. 저수지를 완전히 흡인시키고, 미리 따뜻워진 M199의 120 μL을 저수지 중 하나에 넣고 다른 쪽에서 흡인합니다.
   2. 미리 따뜻워진 M199 전체 중간 크기의 60 μL을 두 ....

결과

우리는 이전에 다른 SMAD 단백질3의 상호 작용을 검출하기 위하여 ^{PLA를 사용하고} SMAD 인산화²⁸에 있는 전단 응력 유도한 변경을 분석했습니다.

여기서, 두 방법은 위에서 설명한 프로토콜과 결합되었다. HUVECs는 1 dyn/^cm2 및 30 dyn/^cm2 의 전단 응력에 복종하고 SMAD 전사 요인의 상호 작용을 위해 분석되었습니다. 높은 전단 응력(30dyn/^cm2)과 비교했을 때, 낮은 전단 응력(1dyn/^cm2)은 SMAD1-SMAD2/3 상호작용의 현저한 증가로 이어져 있으며, 소위 혼합-SMAD 복합체는 분석된 세포의 사이토솔 및 핵(그림 2A, 하부 패널)을 보여준다. PLA 이벤트는 두 샘플 모두에서 뚜렷한 반점으로 표시되며, 하나는 DAPI .......

토론

여기에 설명된 PLA 기반 프로토콜은 정량적 및 공간 해상도를 가진 전단 응력에 노출된 IC에서 두 가지 단백질(예를 들어, 그들의 직접적인 상호 작용)의 근접성을 결정하는 효율적인 방법을 제공합니다. 여러 병렬 채널을 가진 유량 슬라이드를 사용하여 동일한 기계적 조건하에서 세포에서 동시에 여러 가지 단백질 상호 작용을 검사 할 수 있습니다. 대조적으로, 사용자 정의 빌드 흐름 챔버 시스템은 종종 슬라이드와 펌프 당 필요한 컨트롤없이 하나의 PLA 실험을 허용 유리 커버 슬립 주위에 구축 된 단일 채널을 사용합니다. 이 프로토콜은 SMAD 상호 작용의 검출에 초점을 맞추고 있지만, 다른 단백질 상호 작용을 감지하도록 조정할 수 있습니다. 그러나, 결과의 분석은 2개의 단백질이 또한 복합체를 형성하지 않고 가까운 근접에 상주할 수 있기 때문에 주의 깊게 행해져야 합니다. 단백질의 상호 작용에 대한 명확한 진술이 바람직한 경우에, PLA 실험은 공동 면역 침전과 같은 추가 적인 방법으로 보완되어야 합니다. 또한, PLA는 샘플이 후.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
&마이크로;-슬라이드 VI 0.4	ibidi	80606	6채널 슬라이드
염화암모늄	Carl Roth	K298.1	담금질
소 혈청 알부민	Carl Roth	8076.4	차단
DAPI	시그마 Aldrich/ Merck	D9542	염색 DNA/핵
DPBS	PAN Biotech	P04-53500	PBS
듀올링크 In 현장 검출 시약: 녹색	Sigma Aldrich/ Merck	DUO92014	리가제, 결찰 완충액, 중합효소 및 증폭 완충액이 포함된 PLA 키트(녹색 라벨이 붙은 올리고뉴클레오티드 포함)
Duolink In Situ PLA 프로브 안티 마우스 MINUS	시그마 Aldrich/ Merck	DUO92004	MINUS 프로브
Duolink In Situ PLA 프로브 Anti-Rabbit PLUS	Sigma Aldrich/ Merck	DUO92002	PLUS 프로브
Duolink 현장 세척 버퍼, 형광	시그마 Aldrich/ Merck	DUO82049	PLA 세척 버퍼 A 및 B
내피 세포 성장 보충제	매체용 코닝		보충제(ECGS)
매체용	태아 종아리 혈청
FIJI			이미지 분석 소프트웨어
포름알데히드 용액 4% 완충	KLINIPATH/VWR	VWRK4186. BO1	PFA
전체 매체			M199 기초 매체 +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +  25 &마이크로; g/mL 간염 +    50 &마이크로; 돼지 껍질의 g/mL ECGS
젤라틴, A형	시그마 알드리치	G2500	흐름 채널 코팅을 위해 PBS에 0.1% 사용
GraphPad Prism v.7	GarphPad		통계 프로그램 플롯 및 통계 계산에 사용
돼지 장 점막의 헤파린 나트륨 염	Sigma Aldrich	H4784-250MG	Hep)
HUVECs
ibidi 장착 매체	ibidi	50001	액체 장착 매체
ibidi 펌프 시스템	ibidi	10902	공압 펌프
Leica TCS SP8	Leica		컨포칼 현미경
L-글루타민 200mM	PAN Biotech	P04-80100	매체 (L-Glu)
매체 용 보충제 199	Sigma Aldrich	M2154	기본 매체
마우스 안티 SMAD1 항체	Abcam	ab53745	PLA
마우스 안티 SMAD2 / 3 항체	BD Bioscience	610843	CST 9515
마우스 안티 SMAD4 항체	Sanata Cruz Biotechnology	에 적합하지	sc-7966
PLA 페니실린 10.000U / ml / 스트렙토 마이신 10mg / ml	PAN Biotech	P06-07100	보충제 (P / S)
관류 세트 WHITE	ibidi	10963	튜빙 1 dyn / cm2
관류 세트 노란색 및 녹색	ibidi	10964	튜빙 30 dyn / cm2 / sup><
토끼 SMAD1 / 5 항체	세포 신호 전달 기술	9516	PLA
토끼 항 SMAD2 / 3 XP 항체	세포 신호 전달 기술	8685	적합에 사용 PLA
토끼 항 SMAD4 항체	세포 신호 기술	9515	BD 610843 직렬 커넥터와 함께 PLA에 적합하지 않음
µ-슬라이드	ibidi	10830	직렬 연결 튜브
Triton X-100	Carl Roth	6683.1	투과화

보충제 보충제 매체(와 함께 PLA않음