Method Article

마우스의 칼슘 과도 연구를 위해 대물 렌즈가 사전 고정된 베이스플레이팅과 미니스코프 사용

DOI:

10.3791/62611

⸱

June 5th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Veterinary Medicine, School of Veterinary Medicine, National Taiwan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

경화 중 치과용 시멘트의 수축은 베이스 플레이트를 대체합니다. 이 프로토콜은 베이스 플레이트를 시멘트로 만들 공간을 남기는 치과용 시멘트의 초기 기초를 만들어 문제를 최소화합니다. 몇 주 후, 베이스 플레이트는 새 시멘트를 거의 사용하지 않고 이 비계의 위치에 접합될 수 있으므로 수축을 줄일 수 있습니다.

Abstract

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신경 과학자들은 미니어처 현미경 (미니 스코프)을 사용하여 자유롭게 행동하는 동물의 신경 활동을 관찰합니다. 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스(UCLA) 미니스코프 팀은 연구원들이 미니스코프를 직접 만들 수 있는 개방형 리소스를 제공합니다. V3 UCLA 미니스코프는 현재 사용 중인 가장 인기 있는 오픈 소스 미니스코프 중 하나입니다. 표재성 피질에 이식 된 대물 렌즈 (1 렌즈 시스템)를 통해 유전자 변형 뉴런에서 방출되는 형광 과도 현상의 이미징을 허용하거나 심부 뇌에 이식 된 릴레이 렌즈와 중계 된 이미지를 관찰하기 위해 미니 스코프에 미리 고정 된 대물 렌즈의 조합을 통해 깊은 뇌 영역에서 이미징 할 수 있습니다 (2 렌즈 시스템). 최적의 조건(뉴런이 형광 지표를 발현하고 릴레이 렌즈가 적절하게 이식된 경우)에서도 시멘트 경화 시 베이스 플레이트와 두개골에 부착된 시멘트 사이의 치과용 시멘트의 부피 변화로 인해 대물 렌즈와 릴레이 렌즈 사이의 거리가 변경되어 정렬 불량이 발생하여 이미지 품질이 저하될 수 있습니다. 베이스 플레이트는 미니스코프를 두개골에 장착하고 대물 렌즈와 릴레이 렌즈 사이의 작동 거리를 고정하는 데 도움이 되는 플레이트입니다. 따라서 베이스 플레이트 주변의 치과용 시멘트 부피의 변화는 렌즈 사이의 거리를 변경합니다. 본 프로토콜은 치과용 시멘트의 부피 변화로 인한 오정렬 문제를 최소화하는 것을 목표로 한다. 이 프로토콜은 릴레이 렌즈 이식 중에 치과 용 시멘트의 초기 기초를 구축하여 정렬 불량을 줄입니다. 이식 후 회복 시간은 치과용 시멘트의 기초가 베이스 플레이트를 완전히 경화시키기에 충분하므로 가능한 한 적은 새 시멘트를 사용하여 베이스 플레이트를 이 비계에 접합할 수 있습니다. 이 기사에서는 미니스코프에 고정된 대물 렌즈로 신경 활동의 이미징을 가능하게 하기 위해 마우스의 베이스플레이팅 전략을 설명합니다.

Introduction

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형광 활동 리포터는 민감하고 큰 동적 범위 1,2,3을 갖기 때문에 신경 활동의 이미징에 이상적입니다. 따라서 형광 현미경을 사용하여 신경 세포 활동 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15를 직접 관찰하는 실험이 증가하고 있습니다.<....

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Protocol

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이 연구에서 수행 된 모든 절차는 국립 대만 대학 동물 관리 및 사용위원회 (승인 번호 : NTU-109-EL-00029 및 NTU-108-EL-00158)의 승인을 받았습니다.

1. 치과용 시멘트의 체적 변화 평가

참고: 치과용 시멘트의 부피 변화는 경화 과정에서 발생합니다. 이식 및 베이스 도금 전에 치과용 시멘트의 부피 변화를 테스트합니다. 연구원은 모든 브랜드의 치과용 시멘트를 테스트하고 부피 변화가 가장 적은 브랜드를 사용하여 베이스 플레이트를 시멘트로 만들 수 있습니다. 그림 3에 예가 나와 있습니다.

  1. 각 치과 용 시멘트 분말 0.5g의 무게를 달아 적절한 용액 (1mL)과 혼합하십시오.
    알림: 치과 용 시멘트 지침에서 권장되는 분말 / 액체 비율은 고체 형태를 얻기 위해 0.5g의 분말 대 0.25mL의 용액입니다. 이 테스트 프로토콜은 피펫 팁의 부피 변화를 측정하기 위해 혼합물을 액체 형태로 흡인할 수 있도록 비율을 0.5g/mL로 희석합니다.
  2. 0.1-10μL 피펫 팁을 사용하여 2.5μL의 치과용 시멘트 혼합물을 제....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

치과용 시멘트 부피 변화 평가
경화 과정에서 치과용 시멘트의 부피가 변하기 때문에 GRIN 렌즈의 작동 거리가 약 50-350μm인경우 이미징 품질에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다4,8. 따라서이 경우 Tempron과 Tokuso라는 두 개의 시판 치과 용 시멘트가 이식 및베이스 도금 절차 전에 테스트되었습니다 (그림 5). 비디오를 먼저 평가하여 시멘트가 수축되었는지 확인한 다음 완전히 건조되었을 때 시멘트의 부피를 비교했습니다. 치과용 시멘트의 초기 혼합물의 동일한 농도와 부피를 피펫 팁에 로딩하고 비디오테이프로 녹화하였다(보충 비디오 S1). 비디오 S1은 건조 과정에서 두 시멘트가 모두 수축되었음을 보여주었습니다. Tokuso는 Tempron보다 더 나은 성능을 보였습니다 (즉, 수축 후에도 Tem.......

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Discussion

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본 보고서는 2 렌즈 UCLA 미니 스코프 시스템을 사용하는 연구자를위한 상세한 실험 프로토콜을 설명합니다. 당사 프로토콜에서 설계된 도구는 생체 내 칼슘 이미징을 시도하려는 모든 실험실에 비교적 저렴합니다. 바이러스 주입, 렌즈 이식, 더미 베이스 도금 및 베이스 플레이팅과 같은 일부 프로토콜은 칼슘 이미징의 성공률을 향상시키기 위해 미니스코프 시스템의 다른 버전에도 사용할 수 있습니다. 바이러스 주입과 관련된 일반적인 문제 및 미니스코프 버전에 관계없이 수정해야 하는 렌즈 이식 외에도 UCLA 베이스 플레이트의 구조로 인해 위치 이동이 발생하여 대물 렌즈와 릴레이 렌즈 간의 작동 거리가 일치하지 않을 수 있습니다(그림 1C). 두 렌즈의 위치 이동을 최소화하기 위해 수정된 실험 프로토콜이 개발되었습니다(그림 2, 그림 4, 그림 5

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이것은 업계에서 지원하는 연구가 아닙니다. 저자는 재정적 이해 상충이 없다고보고합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 대만 과학 기술부 (108-2320-B-002 -074, 109-2320-B-002-023-MY2)의 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.7mm 드릴 비트 #19008-07Fine Science Tools; 수술을 위한
0.1– 10 &뮤; l 피펫 팁104-Q; QSP피셔 사이언티픽; 치과용 시멘트 테스트를 위한
20 G IV cathater#SR-OX2032CATerumo Corporation; 일본 도쿄수술
27G 바늘AGANI, AN*2713RTerumo Corporation; 수술을 위한
AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE#104487-AAV9;1.5*10^13Addgene 바이러스 준비; MA, 바이러스주사
아트로핀 황산염; Hsinchu, 수술/더미 베이스플레이트/베이스플레이트
베이스플레이트 V3http://miniscope.org더미 베이스플레이트/베이스플레이트용BLU
TACK#30840350Bostik; 첼시, 매사추세츠, 미국재사용 가능한 접착 점토; 수술 / 더미베이스 도금 / 베이스 플레이트
Bone Rongeur Friedman13cmDiener; Tuttlingen,
독일 부프레노르핀 인디비오르(BuprenorphineINDIVIOR)를 베이스도금한 공로; 수술을 위한
CarprofenRimadylZoetis; Exton, PA진통제
CeftazidimeTaiwan Biotech; 대만감염 방지
UCLA Miniscope용 데이터 수집 PCB베이스 도금
. 치과 용 시멘트 테스트를 위한
도쿄 치과 시멘트 세트Tokuso CurefastTokuyama Dental Corp.; 치과 시멘트 / 수술 / 더미베이스 도금 /베이스 플레이트 테스트를 위한
및 쥐 어댑터가있는 이중 실험실 표준#51673Stoelting Co; 미국 일리노이주수술/더미 베이스도금/베이스플레이트
Duratear 연고Alcon; 수술/더미 베이스도금/베이스플레이트
이부프로펜; 대만진통제
IsofluranePanion & BF 생명공학 INC.; 수술/더미 베이스도금/베이스플레이트
InscopixnVista 시스템Inscopix를 위한 대만 타오위안; 팔로 알토, 캘리포니아V3 UCLA 미니 스코프
케타민화이자와 비교; NY, NY안락
수술용생리식염수
마이크로 불독 클램프#12.102.04Dimedo; Tuttlingen, 렌즈이식
Microliter Microsyringes, 2.0 µ를 위한 독일; L, 25 게이지#88400해밀턴; Bonaduz, 바이러스사출
성형 실리콘 고무ZA22 ThixoZhermack에 대한 스위스; Badia Polesine, 이탈리아더미 베이스플레이트
GRIN(Objective Gradient index) 렌즈#64519Edmund Optics; 미국 뉴저지베이스플레이팅/베이스플레이트
파라필름#PM996Bemis; Neenah, 더미베이스 도금
휴대용 흡입#DF-750Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan수술용
릴레이 GRIN 렌즈#1050-002177Inscopix; 팔로 알토, 캘리포니아, 미국더미베이스 도금 / 베이스 도금
스테인레스 스틸 앵커 나사직경 1.00mm, 총 길이 3.00mm수술용
스테레오 현미경#SL720Sage Vison; 수술/ 더미 베이스 플레이트/베이스 플레이트
입체 장치에#51673스톨팅; 수술/더미 베이스플레이트/베이스플레이트를 위한
UV 경화 접착제#3321록타이트; 디&움; 셀도르프, 치과 시멘트 V3
UCLA Miniscopehttps://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components수술 / 더미베이스 도금 / 베이스 도금
XylazineX1126Sigma-Aldrich를 위해 구입했습니다.세인트루이스, 안
AstraZeneca를 위한 미주리; 에스&움; 더트&AUML; lje, 수술을 위한
미국싱가포르일본 도쿄 Astart에 대한 미국영국 치과 시멘트 세트 Tempron GC Corp를 위해 https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq 에 구입했습니다일본일본 도쿄마우스 YungShin을 위한 스위스 제네바사 더미 대한 대만 신베이시미국 일리노이, 테스트를 위해 락사 Xylocaine 펌프 스프레이 10% 스웨덴

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging neuronal activity with genetically encoded calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 647-656 (2012).
  2. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  3. Dana, H., et a....

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