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사용된 배양 배지를 사용한 인간 착상 전 배아의 염색체 스크리닝: 샘플 수집 및 염색체 배합 분석

DOI:

10.3791/62619

September 7th, 2021

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis
Posted by JoVE Editors on 10/01/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis. The Protocol and Representaive Results sections were updated.

In the Protocol, step 3.8.2 was updated from:

After logging into the system, click Create Submission under the NICS tab. Then, select the sequencing platform, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).

to:

After logging into the system, click Create Submission under the NICS-A tab. Then, choose NGS for the platform, select corporation, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).

In the Representative Results, Figure 3 was updated from:

Data analysis software screenshots, report export, computational results, chromatography data analysis.
Figure 3. Data Analysis. (A) The page of Create Submission. There are different options for the user application. For sequencing platform, users can choose Illumina or Ion Torrent. For analysis criterion, there are two length detection resolution for selection, the whole chromosome and whole arm level. The users also can choose whether the mosaicism or gender information is reported. Finished the above parameter setting,click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. For Ion Torrent platform, choose files with an extension of bam. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; Conclusion: Indicates whether the NICS analysis is normal or abnormal, "N/A" indicates no conclusive result is available; Gender: If the user chooses to report the sex information, this column will appear in the summary table; Karyotype: Shows the analysis results; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; CNV plot (By Chromosome): View the CNV profiles of each chromosome. (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. Select Save File in the appearing dialog window and then click OK. The reports will be saved to the Download folder of the computer. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Data analysis software interface for embryo implantation potential; input form, result summary, export options.
Figure 3. Data Analysis. (A) There are different options for the user application. For sequencing platform corporation, users can choose Illumina, Ion Torrent or MGI. The users can choose whether the gender information is reported. Finished the above parameter setting, click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; AI Rating: The rating (A, B or C) for each NICS sample; AI_Rating Interpretation: Evaluation of embryo implantation potential; AI Grading: The score for each NICS sample; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. The reports will be saved to the Download folder of your computer. Please click here to view a larger version of this figure.

Summary

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본 연구는 배아 생검을 피하고 NGS를 사용하여 염색체 ploidy 식별을 가능하게 하는 폐배양 배지를 사용하는 인간 배아의 염색체 스크리닝 프로토콜을 보고합니다. 본 논문에서는 배양액 제조, 전장 유전체 증폭(WGA), 차세대 염기서열분석(NGS) 라이브러리 준비, 데이터 분석 등 자세한 절차를 제시한다.

Abstract

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임상 체외 수정(IVF)에서 PGT-A의 일반적인 방법은 영양배엽(TE)에서 몇 개의 세포를 생검해야 합니다. 이것이 태반을 형성하는 계통입니다. 그러나 이 방법은 전문 기술이 필요하고 침습적이며 TE의 염색체 수와 태아로 발달하는 내부 세포 질량(ICM)이 항상 동일하지 않기 때문에 위양성 및 음성이 발생합니다. TE 및 ICM에서 배양 배지로 방출된 DNA의 염기서열 분석이 필요한 기술인 NICS는 이러한 문제를 해결할 수 있는 방법을 제공할 수 있지만 이전에는 효능이 제한적인 것으로 나타났습니다. 본 연구는 배양 배지 샘플링 방법, 전체 게놈 증폭(WGA) 및 라이브러리 준비, 분석 소프트웨어에 의한 NGS 데이터 분석을 포함하는 NICS의 전체 프로토콜을 보고합니다. 배아 실험실마다 동결 보존 시간이 다르다는 점을 고려하여 발생학자는 IVF 실험실의 실제 조건에 따라 선택할 수 있는 배아 배양 배지를 수집하는 두 가지 방법을 가지고 있습니다.

Introduction

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보조 생식 기술(ART)은 불임 치료에 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 그러나 IVF와 같은 ART의 성공률은 제한적이며, 임신 손실률은 정상 인구에 비해 현저히 높다1. 이러한 문제의 주요 원인은 착상 전 인간 배아에 일반적으로 존재하는 염색체 이상이다2. PGT-A는 착상 전에 배아의 염색체 균형을 스크리닝하는 효과적인 방법입니다 3,4. 일부 연구에서는 PGT-A가 낙태율을 낮추고 임신율을 향상시킬 수 있음을 입증했습니다 5,6,7,8. 그러나 PGT-A에는 특정 교육과 경험이 필요한 복잡한 기술 전문 지식이 필요합니다. 침습적 배아 생검 절차는 또한 잠재적으로 배아에 손상을 줄 수 있다9. 연구에 따르면 할구 생검은 후속 발달을 방해할 수 있으며, 생검된 TE의 수가 착상율에 영향을 미칠 수 있다

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Protocol

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북경대학 제3병원 윤리위원회로부터 윤리 허가를 받았다.

1. 준비

알림: 필요한 재료 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

  1. 시약
    1. 사용하기 전에 Tri-gas 인큐베이터에서 37°C, 5% CO 2 및 5% O2에서 20-30μL의 배우자 배지/수정 배지 및 분열/배반포 단계 배양 배지(미네랄 오일로 덮임) 및 히알루로니다아제(단단히 뚜껑이 있는 튜브에 있음)를 예열 및 평형(균형)합니다.
    2. 흄 후드의 작업 표면에서 히알루로니다아제를 37°C로 예열합니다.
    3. 제조업체의 지침에 따라 유리화 완충액과 시료 채취 시약을 준비합니다.
  2. 도구
    1. 유리 파스퇴르 피펫을 당겨 화염 광택 개방형 미세 팁을 생성하여 샘플 수집 및 이송 피펫(내경 ~200-250μm), 탈각/스트리퍼 피펫(내경 ≥150μm, ~130-140μm 및 ~120μm) 및 세척용 피펫(내경 ~150μm)을 준비합니다.
      참고: 샘플 채취/이송, 탈취 및 세척에 사용되는 피펫은 직접 구입할 수 있습니다. 고정 바늘과 주사 바늘도 직접 구입할 수 있습니....

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Results

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본 연구는 제안된 방법을 환자에게 적용하였다. NICS 분석을 적용하기 전에 IRB 승인 및 사전 동의를 받았습니다. 본 연구는 환자로부터 6개의 배반포를 채취하고 4일차에서 5일차에 걸쳐 6개의 배아 모두에 대해 NICS를 수행했습니다. 부모의 균형 전위로 인한 염색체 이상은 NICS 분석으로 5개의 염색체에서 발견되었습니다. 따라서 전송에 사용할 수 없습니다(그림 4A-E). 두 배아의 NICS 결과는 동일한 핵형 45를 보여주었고, XN 및 -18(×1)은 모두 18번 염색체 결실이었습니다(그림 4A, B). 핵형 46, XN, -1p(pter→p21.1, ×1)는 염색체 1 pter→p21.1 영역 결실의 짧은 팔일 뿐입니다(그림 4D).

NICS 결과는.......

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Discussion

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수정 및 문제 해결

NICS 결과가 부모의 유전 물질로 오염된 경우 모든 적운-코로나 방사능 세포를 제거하고 수정을 위해 ICSI를 수행해야 합니다. DNA를 저하시킬 수 있는 부적절한 배지 보관 또는 템플릿 준비 프로세스를 피할 수 있습니다. 작업 공간은 DNase 및 RNase 오염 제거 시약으로 철저히 정제되었습니다. 다른 배아로부터의 오염을 피하기 위해, 4일째부터 시작되는 교차 오염을 피하기 위해 하나의 배아를 항상 배지의 단일 방울에서 배양했습니다. 오염 현상은 최종 배양 드롭에서 배아의 배치를 지연시킬 때 최소화됩니다30,31,32,33. 모계 오염을 최소화하기 위해 Kuznyetsov

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Disclosures

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Yaxin Yao, Jieliang Ma, Jing Wang 및 Sijia Lu는 Yikon Genomics Co., Ltd.의 직원입니다.

Acknowledgements

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저자들은 NGS 데이터 분석에 도움을 준 Shiping Bo와 Shujie Ma에게 감사의 뜻을 전합니다. 자금 지원: 이 연구는 국가 핵심 연구 개발 프로그램(보조금 번호 2018YFC1003100)의 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL EP 튜브, 0.2 mL PCR 튜브AxygenMCT-150-C, PCR-02-CDNase/RNase free, Low Binding PCR 튜브 및 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브를 권장합니다.
10 & 마이크로; L, 200 &마이크로; L, 1000 &마이크로; L DNase /RNase Free TipsAxygenT-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-S다른 브랜드로 대체 가능/샘플 이송용
100% 에탄올Sinopharm 화학적10009218다른 브랜드로 대체 가능/DNA 라이브러리 정제용
바코드 Primer1-48Yikon GenomicsReagent in NICSinst library preparation kit라이브러리 증폭용
BD Falcon Organ Culture Dish, 멸균BD Bioscience363037다른 브랜드로 대체 가능/배아 배양
BD 팔콘 조직 배양 접시 (쉬운 그립) , 멸균BD Bioscience353001다른 브랜드로 대체 가능/배아 배양
BD 팔콘 조직 배양 접시, 멸균BD Bioscience353002다른 브랜드로 대체 가능/배아 배양
Cell Lysis BufferYikon NICS의 유전체학양 배지 전처리 용번째 라이브러리 준비 키트
세포 용해 효소Yikon 유전체학시약 NICS의 Inst 라이브러리 준비 키트배양 배지 전처리
ChromGo 소프트웨어Yikon Genomics데이터 분석
CMPure MagbeadsYikon Genomics시약 NICS의 Yikon 유전체학 시약라이브러리정제 용
Cryotop 개방형 시스템  KITAZATO BioPharma81110이것은 다른 브랜드로 대체될 수 있습니다/배아 유리화용
증류수Yikon Genomics시약 in NICSInst 라이브러리 준비 키트DNA
ES 용해 (유리화 키트)  KITAZATO BioPharma시약 inVitrification kit다른 브랜드로 대체 가능/배아 유리화의 경우
HOLDNIGORIGIOMPH-MED-35다른 브랜드로 대체 가능
브랜드/ICSI
Hyaluronidase solution, 80 U/mLSAGEART4007-A다른 브랜드로 대체 가능/Digest 난모세포-코로나-적운 복합체
ICSIORIGIOMPH-35-35이것은 다른 브랜드/ICSI
Illumina MiSeq®로 대체될 수 있습니다; 시스템IlluminaSY-410-1001라이브러리 염기서열 분석
인큐베이터LabotectectInkubator C16다른 브랜드로 대체 가능 / 배아 배양
라이브러리 버퍼Yikon Genomics시약 NICS의 Inst 라이브러리 준비 키트라이브러리 증폭
라이브러리 효소 믹스Yikon Genomics시약 NICS의 Yikon 유전체학 시약NicS의 첫 번째 라이브러리 준비 키트라이브러리 amplificaton
마그네틱 스탠드DynaMagTM-212321D라이브러리 정제
현미경OLYMPUS1X71이것은 다른 브랜드로 대체 할 수 있습니다 / 배아 관찰 용
미니 원심 분리기ESSENSCIENELF6분리
용 MT 효소 믹스Yikon Genomics시약 NICSInst 라이브러리 준비 키트배양 배지 전처리 용
NICSInst 라이브러리 준비 키트Yikon GenomicsKT1000800324전체 게놈 증폭 및 라이브러리 구축
NICSInst Sample Prep StationYikon Genomics  ME1001003Amplificate DNA
Nunc IVF 4-WellDish Thermo Scientific144444이것은 다른 브랜드로 대체될 수 있습니다/배아 세척 및 배양
Pasteur PipetteOirgio  MXL3-IND-135다른 브랜드로 대체 가능/배아 tansfer
파스퇴르 피펫의ORIGIOPP-9-1000다른 브랜드로 대체 가능/IVF 실험실의
경우 Pre-Lib BufferYikon GenomicsReagent in NICSInst library preparation kitPre-library preparation
pre-Lib enzymeYikon GenomicsReagent in NICSInst library preparation kit사전 라이브러리 준비
Qubit® 3.0 FluorometerThermo ScientificQ33216라이브러리 정량화용
Quinn's Advantage Blastocyst MediumSAGEART-1029배아 배반포 단계 배양용
Quinn's Advantage Cleavage MediumSAGEART-1026다른 브랜드/배아 분열 단계 배양용
Quinn's Advantage Fertilization으로 대체 가능 MediumSAGEART-1020다른 브랜드로 대체 가능/난모세포 및 정자 수정을 위해
Quinn's Advantage m-HTF Medium with HEPESSAGEART-1023다른 브랜드로 대체 가능/배아 클러트루어의 경우
Quinn's Advantage SPS Serum protein Substitute KitSAGEART-3010다른 브랜드로 대체 가능/난모세포
를 탈락시키기 위해Quinn's Advantage 조직 배양 미네랄 오일SAGEART-4008P다른 브랜드로 대체 가능/배양 배지를 커버하기 위해
STRIPPER TIPSORIGIOMXL3-IND-135다른 브랜드로 대체 가능/과립층 세포 탈환용
유리화 Cryotop Open systermKIZTAZATO81111다른 브랜드로 대체 가능/배아 유리화
유리화 키트용  KITAZATO BioPharmaVT101이것은 다른 브랜드로 대체될 수 있습니다/배아 유리화의 경우
VortexerQilinbeierDNYS8샘플 믹스
VS (유리화 키트)  KITAZATO BioPharma시약 inVitrification kit다른 브랜드로 교체 가능/배아 유리화의 경우
ZILOS-tk 레이저 시스템Hamilton ThorneCLASS 1 레이저로 대체 가능/인공 배반구 붕괴의 경우
시약배첫 경우

References

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barlow, P. Early pregnancy loss and obstetrical risk after in-vitro fertilization and embryo replacement. Human Reproduction. 3 (5), 671-675 (1988).
  2. Munne, S. Chromosome abnormalities and their relationshi....

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Chromosome ScreeningPreimplantation EmbryosSpent Culture MediumChromosomal Ploidy AnalysisNon Invasive Chromosome ScreeningWhole Genome AmplificationLibrary PreparationNext Generation SequencingEmbryo Culture MediumAneuploidy Detection

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