방법 논문

시험관 내에서 인간 망막 모세포종 재건

DOI:

10.3791/62629

⸱

2022년 10월 11일

 , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing Ophthalmology & Visual Science Key Laboratory

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 인간 배아 줄기 세포 (hESC)에 이중 대립 유전자 RB1 돌연변이를 도입하여 인간 망막 모세포종 (RB)을 생성하는 방법을 설명합니다. RB 세포주는 또한 접시에서 단리된 RB를 사용하여 성공적으로 배양될 수 있었다.

초록

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인간 RB는 소아암으로 치료를 시행하지 않으면 치명적입니다. RB는 설치류 모델에서 비교적 드문 원뿔 전구체에서 유래하기 때문에 인간과 설치류의 종간 차이와 관련하여 인간에서 파생 된 질병 모델은 인간 RB의 메커니즘을 밝히고 치료 대상을 찾는 데 더 유리합니다. 본원에서, 프로토콜은 각각 이대립유전자 RB1 점 돌연변이(RB1 Mut/Mut) 및 RB1 녹아웃 돌연변이(RB1-/-)를 갖는 2개의 유전자 편집된 hESC 계통의 생성을 기술한다. 망막 발달 과정에서 RB의 형성이 관찰됩니다. RB 세포주는 또한 RB 오가노이드로부터 분리함으로써 확립된다. 전체적으로 2D 및 3D 결합 분화 프로토콜을 사용하여 유전자 편집 hESC 라인을 망막 오가노이드로 분화함으로써 우리는 접시에서 인간 RB를 성공적으로 재구성하고 원뿔 전구체 기원을 확인했습니다. 망막 모세포종의 발생, 증식 및 성장을 관찰하고 새로운 치료제를 추가로 개발하는 데 유용한 질병 모델을 제공 할 것입니다.

서론

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인간 망막 모세포종 (RB)은 망막 원뿔 전구체 1,2,3에서 유래 한 희귀하고 치명적인 종양이며, 어린 시절에 가장 흔한 유형의 안구 내 악성 종양입니다4. RB1 유전자의 동형접합체 불활성화는 RB5에서 개시되는 유전적 병변이다. 그러나, RB1 돌연변이를 갖는 마우스는 망막 종양2를 형성하지 못한다. 마우스 종양은 Rb1 돌연변이 및 다른 유전자 변형의 조합으로 생성 될 수 있지만, 여전히 인간 RB6의 특징이 부족합니다. 망막 오가노이드 분화의 발달 덕분에, 인간 RB1의 특성을 나타내는 hESC 유래 RB를 얻을 수 있었다.

망막 오가노이드 분화를 위한 수많은 프로토콜이 지난 10년 동안 확립되었으며, 여기에는 2D7, 3D8....

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프로토콜

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이 연구는 수도 의과 대학 베이징 통렌 병원의 기관 윤리위원회의 승인을 받았습니다. H9 hESC는 와이셀 연구소에서 입수합니다.

1. RB1 돌연변이 hESC의 생성

  1. RB1의 녹아웃(KO)에 대한 CRISPR/Cas9 표적 벡터.
    1. 한 쌍의 sgRNA를 설계합니다. RB1의 절제를 위해, 이 유전자의 첫 번째 엑손을 표적으로 한다. 정방향 프라이머 서열은 CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGGG이고, 역방향 프라이머 서열은 AAACCCGAAAAACGGCCGCCACCGC이다.
      참고: 특정 RB1 돌연변이의 경우 복구된 템플릿도 필요합니다. 이 프로토콜에서는 RB1-KO 세포주가 예로 사용됩니다.
    2. 제조업체의 지침에 따라 37°C에서 30분 동안 pX330-U6-키메라 BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro( 재료 표 참조)를 사용하여 1μg의 pX330-U6-키메라 BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro를 30분 동안 분해합니다.
    3. 제조업체의 지침에 따라 정제 키트를 사용하여 소화된 플라스미드를 정제합니다.
      참고: 효소 반응은 정제 키트를 사용....

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결과

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RB 생성 절차는 부착 및 부유 배양을 결합한 그림 1에서 설명됩니다. hESC로부터 인간 RB1-KO를 수확하고, RB 오가노이드를 단리함으로써 RB 세포주를 수득할 수 있었다.

여기서 프로토콜은 다양한 단계의 차별화에 대한 세부 정보를 제공합니다(그림 2). 속이 빈 구체는 처음 3일 동안 형성되어 배양 표면에 부착된 다음 확장됩니다(그림 2A-E). 15일째부터, 세포는 상승되고 현탁액에서 배양된다(도 2F). 분리 다음 날, 망막 유기체가 형성되고 밝은 테두리가 보입니다 (그림 2G, 검은 색 화살표). 또한, 유기체 외부의 세포는 다음 주에 죽을 가능성이 있습니.......

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토론

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인간 망막 모세포종 (RB)은 RB1 의 불 활성화와 Rb 단백질의 기능 장애로 인해 발생합니다. 이 프로토콜에서 RB1-KO hESC는 접시에서 RB를 생성하는 중추적인 단계입니다. RB1-/- hESC를 사용하더라도 망막 오가노이드 분화 방법으로 인해 RB 형성이 없을 가능성이 있습니다10. 이 프로토콜에서 순응 문화에서 부유 문화로의 이전은 차별화 과정에서 필수적입니다. 낭종의 밀도, 만능 줄기 세포의 유형 및 증식 속도는 모두 박리 시기에 영향을 미치는 변수입니다. 세포가 확장될 때 세포를 분리하는 것이 바람직하지만이웃 콜로니에 의해 상호작용하지 않는다9. 콜로니가 인접하면 인접한 망막 오가노이드로 이어지고 분화 효율이 감소합니다.

단계를 비판적으로 따르면 RB를 수확하는 데 문제가 없을 것입니다. 그러나, 이 방법은 R.......

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공개 사항

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저자는이 연구의 객관성에 영향을 미칠 수있는 제휴, 회원 자격, 자금 또는 금융 보유에 대해 알지 못합니다.

감사의 글

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모든 도움을 주신 502 팀에 감사드립니다. 이 연구는 Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014)과 National Key R & D Program of China (2017YFA0105300)의 지원을 부분적으로 받고 있습니다.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2-메르캅토에탄올Life Technologies21985-023
Anti-ARR3SigmaHPA063129항체
Anti-CRX (M02)AbnoveABN-H00001406-M02항체
Anti-Ki67Abcam  ab15580항체
Anti-Syk (D3Z1E)Cell Signaling Technology13198항체
BbsINEBR3539S제한 효소
Dispase (1U/mL)Stemcell Technologies7923
DMEM basicGibco10566-016
DMEM/F-12-GlutaMAXGibco10565-042
DMSOSigmaD2650
DPBSGibcoC141905005BT
EDTAThermo15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Human Embryonic Stem CellsBiological Industry04-002-1A
글루타민Gibco35050-061
Ham's F-12 영양 혼합물 (Hams F12)Gibco11765-054
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)SigmaM7145
Neurobasal MediumGibco21103-049
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit SLonzaV4XP-3032Nucleofection kit
Pen StrepGibco15140-122
PuromycinGene OperationISY1130- 0025MG
QIAquick PCR 정제 키트QIAGEN28104
ncEpic-hiPSC/hESC 배양 배지NuwacellRP01001ncEpic-hiPSC/hESC 배양 배지, 1.2.1
성장 인자 감소 기저막 매트릭스BD356231Matrigel, 1.2.1
세포 해리 효소Gibco12563-011TrypLE Express, 1.2.8
RNeasy Midi KitQIAGEN75144
RNeasy 미니 키트QIAGEN74104
보충제 ALife Technologies17502-048N-2 보충제(100X), 액체, 메둘 내 보충제
I 보충제 BLife Technologies17105-041B-27 보충제(50X), 액체, 메둘 내 보충제 I,II,III
T4 폴리뉴클레오티드 키나아제라이프 테크놀로지EK0032
타우린시그마T-8691-25G
Y-27632 2HClSelleckS1049
pX330-U6- 키메라 BB-CBh-hSpCas9-2A-PuroAddgene42230
Nucleofector 4DLonza
RPMISigmaR0883-500ML
: 스

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, H., et al. Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).
  2. Singh, H. P., et al.

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재인쇄 및 허가

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태그

RB13DKi67

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