시험관 내에서 인간 망막 모세포종 재건

인간 망막 모세포종 (RB)은 망막 원뿔 전구체 ^1,2,3에서 유래 한 희귀하고 치명적인 종양이며^, 어린 시절에 가장 흔한 유형의 안구 내 악성 종양입니다⁴. RB1 유전자의 동형접합체 불활성화는 RB⁵에서 개시되는 유전적 병변이다. 그러나, RB1 돌연변이를 갖는 마우스는 망막 종양²를 형성하지 못한다. 마우스 종양은 Rb1 돌연변이 및 다른 유전자 변형의 조합으로 생성 될 수 있지만, 여전히 인간 RB⁶의 특징이 부족합니다. 망막 오가노이드 분화의 발달 덕분에, 인간 RB¹의 특성을 나타내는 hESC 유래 RB를 얻을 수 있었다.

망막 오가노이드 분화를 위한 수많은 프로토콜이 지난 10년 동안 확립되었으며, 여기에는 2D⁷, 3D⁸, 2D 및 3D⁹의 조합이 포함됩니다. 인간 RB를 생성하기 위해 여기에서 사용되는 방법은 부착 문화와 부유 문화의 통합입니다⁹. RB1 돌연변이 된 hESC를 망막 오가노이드로 분화시킴으로써 RB의 형성은 약 45 일에 검출 된 다음 약 60 일에 빠르게 증식합니다. 90일째에, RBs의 단리 및 RB 세포주의 생성이 가능하다; 또한, RB는 120일째에 거의 모든 망막 오가노이드를 둘러싸고 있다.

hESC 유래 RB는 RB의 기원, 종양 발생 및 치료법을 탐구하기 위한 혁신적인 모델입니다. 이 프로토콜에서는 유전자 편집 hESC의 생성, RB의 분화 및 RB에 대한 특성화가 상세히 설명된다.

이 연구는 수도 의과 대학 베이징 통렌 병원의 기관 윤리위원회의 승인을 받았습니다. H9 hESC는 와이셀 연구소에서 입수합니다.

1. RB1 돌연변이 hESC의 생성

1. RB1의 녹아웃(KO)에 대한 CRISPR/Cas9 표적 벡터.
   1. 한 쌍의 sgRNA를 설계합니다. RB1의 절제를 위해, 이 유전자의 첫 번째 엑손을 표적으로 한다. 정방향 프라이머 서열은 CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGGG이고, 역방향 프라이머 서열은 AAACCCGAAAAACGGCCGCCACCGC이다.
      참고: 특정 RB1 돌연변이의 경우 복구된 템플릿도 필요합니다. 이 프로토콜에서는 RB1-KO 세포주가 예로 사용됩니다.
   2. 제조업체의 지침에 따라 37°C에서 30분 동안 pX330-U6-키메라 BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro( 재료 표 참조)를 사용하여 1μg의 pX330-U6-키메라 BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro를 30분 동안 분해합니다.
   3. 제조업체의 지침에 따라 정제 키트를 사용하여 소화된 플라스미드를 정제합니다.
      참고: 효소 반응은 정제 키트를 사용하여 아가로스 겔 없이 직접 세척할 수 있습니다( 재료 표 참조).
   4. 포스포릴 및 어닐링 올리고의 각 쌍을 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 (PNK)를 사용하여 반응시켜 1 μL의 올리고1 (100 μM), 1 μL의 올리고2 (100 μM), 1 μL의 10x T4 라이게이션 완충액, 6.5 μL의_ddH2O, 및 0.5 μL의 T4 PNK를 포함한다.
      참고: 1.1.1단계의 정방향 및 역방향 프라이머는 한 쌍의 올리고입니다. 올리고를 인산화 및 어닐링하여 하기 파라미터를 사용하여 열순환기에서 어닐링한다: 30분 동안 37°C; 5 분 동안 95 °C; 분당 5 °C에서 25 °C까지 램프 다운.
   5. 실온(RT)에서 뉴클레아제가 없는 물 199μL에 1μL의 올리고시약을 첨가하여 인산화 및 어닐링된 올리고를 200배 희석합니다.
   6. 결찰 반응을 설정하고 다음을 혼합하여 RT에서 10분 동안 배양합니다: 1.1.3단계에서 Bbs1 분해된 플라스미드 50ng, 1.1.5단계에서 올리고 듀플렉스 1μL, 2x 결찰 완충액 5μL, 리가아제 1μL, 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 최대 10μL를 채웁니다.
   7. 결찰 혼합물을 변형시키고 다음 단계를 위해 양성 콜로니를 시퀀싱합니다.
      알림: 시퀀싱을 위해 U6 정방향 또는 역방향 프라이머를 사용하십시오.
      1. 얼음에서 유능한 세포를 해동하십시오.
      2. 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 50μL의 적격 세포를 취합니다.
      3. 1.1.6단계의 결찰 혼합물 1μL를 적격 세포에 추가합니다.
      4. 튜브를 위아래로 세 번 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.
         알림: 소용돌이하지 마십시오.
      5. 혼합물을 얼음에 30 분 동안 두십시오.
      6. 혼합물을 42°C에서 90초 동안 열충격.
      7. 항생제가 없는 실온 루리아-베르타니(LB) 국물 950μL를 튜브에 추가합니다.
      8. 튜브를 셰이커에 넣고 37°C에서 300rpm으로 60분 동안 돌립니다.
      9. LB 플레이트(펩톤, 카제인에서 추출한 펩톤, 염화나트륨, 한천, 암피실린)를 미리 37°C로 따뜻하게 합니다.
      10. 50-100 μL의 세포와 결찰 혼합물을 RT의 플레이트에 퍼뜨립니다.
      11. 플레이트를 37°C에서 밤새 인큐베이션한다.
      12. 플레이트에서 12 개의 콜로니를 집어 들고 암피실린으로 LB 배지로 옮깁니다. 배지를 셰이커에 300rpm으로 60분 동안 놓습니다.
      13. 1μL의 박테리아 용액(1.1.7.12단계에서)을 PCR용 템플릿으로 사용하고 양성 콜로니를 선택합니다.
      14. U6 프라이머에 의해 양성 콜로니를 서열화하고, 다음 단계에서 설계된 sgRNA 서열과 함께 콜로니를 사용한다.
   8. 미디 키트를 사용하여 플라스미드를 추출합니다(재료 표 참조).
      참고: 미니 키트를 사용하는 플라스미드의 품질과 양은 다음 핵 절제 실험에 충분하지 않습니다. 미디 또는 맥시 키트가 미니 키트보다 더 적합합니다.
2. HESC 배양 및 핵체.
   알림: 모든 시약을 RT로 예열합니다.
   1. 1 x 10 6 H9 세포를 10 μM Y-27632 (ROCK 억제제) 및 2 mL의 새로운 ncEpic-hiPSC/hESC 배양 배지로 사전 코팅된⁶ 웰 플레이트에 해동합니다.
      알림: 사용하기 전에 6웰 플레이트를 1% 성장 계수가 감소된 기저막 매트릭스로 30°C에서 최소 37분 동안 코팅하십시오.
   2. 다음날 상청액을 제거하고 1x Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 세포를 헹군 다음 2mL의 새로운 ncEpic-hiPSC/hESC 배양 배지를 추가합니다.
   3. 세포가 약 80% 컨플루언시로 성장할 때까지 다음 3-5일 동안 2mL의 새로운 ncEpic-hiPSC/hESC 배양 배지로 매일 배지를 교체합니다.
   4. 1회 또는 2회 계대하여 hESC의 상태를 조정한다.
      참고: hESC의 상태를 식별하는 가장 쉬운 방법은 형태입니다.
   5. 미분화 H9 세포를 80% 컨플루언시에 도달할 때까지 6웰 플레이트에서 배양합니다.
   6. 10μM의 Y-27632와 혼합된 2mL의 새로운 ncEpic-hiPSC/hESC 배양 배지로 뉴클레오펙션 2시간 전에 배지를 변경하고 1% 성장 인자 감소 기저막 매트릭스를 사용하여 12웰 플레이트의 한 웰을 프리코팅합니다.
   7. 배지를 흡인하고 예열된 DPBS 1mL로 헹굽니다.
   8. DPBS를 제거하고 1mL의 세포 해리 효소( 재료 표 참조)와 함께 37°C에서 3.5분 동안 배양합니다.
   9. 1mL의 새로운 ncEpic-hiPSC/hESC 배양 배지를 세포에 추가하고 피펫을 두 번 수행하여 H9 세포를 단일 세포 현탁액으로 만듭니다.
   10. 세포 계수를 위해 혼합물 100μL를 꺼내고 남은 혼합물을 내부에 다른 2mL의 ncEpic-hiPSC/hESC 배양액이 들어 있는 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
   11. 200 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 약 2 x 10⁶ 세포를 100 μL 반응 부피로 재현탁시킨다. 제조업체의 프로토콜에 따라 세포, 플라스미드, 핵 절제 및 반응 조건에 대한 부피를 최적화합니다. 이 프로토콜에 사용된 핵 형성 시스템에 대한 재료 표를 참조하십시오.
       알림: 일반적으로 핵형성 중에는 기포가 허용되지 않습니다.
   12. 형질감염 후 세포를 사전 코팅된 12웰 플레이트로 옮기고 1.5mL의 ncEpic-hiPSC/hESC 배지와 10μM의 Y-27632를 보충한 다음 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.
   13. 매일 매체를 교체하십시오. 48시간 후, 약 1주일 동안 세포 선택을 위해 2μg/mL의 퓨로마이신을 추가합니다.
       참고: 처음 3일 동안 수많은 세포가 죽습니다. 나머지 세포는 퓨로마이신 선택 후 다음 주에 증식하여 콜로니로 생성될 수 있습니다. 선택 주에 배지에 항상 2μg/mL의 퓨로마이신이 포함되어 있는지 확인하십시오.
   14. 현미경으로 수동으로 식민지를 선택하십시오.
       참고: 콜로니 형태는 hES 콜로니와 동일합니다. 배지에 10μL 흰색/일반 피펫 팁을 사용하여 콜로니를 조각(콜로니당 2-6개)으로 자르고 하나의 콜로니를 12웰 플레이트의 사전 코팅된 웰 하나에 옮깁니다.
   15. 먼저, RB1 돌연변이 및 오프 타겟 상황을 확인한 다음(표 1), RB1 녹아웃 H9 세포주를 특성화하기 위해 다능 성을 확인하였다.
       참고: PCR 및 생어 시퀀싱을 사용하여 RB1 돌연변이 및 표적 외 상황을 감지합니다. RT-PCR 및 면역 형광으로 다 능성 마커를 확인하십시오.

2. 인간 망막 모세포종의 생성

1. RB1-KO hESC의 유지 보수.
   1. 유전자 편집 H9 세포를 성장인자 감소 기저막 매트릭스가 코팅된 6웰 플레이트에서 2mL의 ncEpic-hiPSC/hESC 배양액으로 배양하고 배지를 매일 교체합니다.
   2. EDTA 완충액을 사용하여 37°C에서 3.5분 또는 RT에서 5분 동안 계대배양.
      참고: EDTA 완충액은 1x DPBS, 5mM EDTA 및 0.9mg/mL의 NaCl의 혼합물입니다.
2. 망막 세포 분화.
   알림: 차별화 전에 배지 I을 준비하십시오. 배지 I을 준비하려면 Dulbecco의 변형 독수리 배지 (DMEM) / 영양소 혼합물 F-12 (F12)-글루타민 (1x) 24.5mL, 뉴런 기초 배지 24.5mL, 100x 보충제 A 250μL, 50x 보충제 B 500μL, 0.1mM ß- 메르 캅토 에탄올 및 100x L- 글루타민 250μL를 혼합합니다. 사용하기 전에 모든 혼합물을 RT로 예열하십시오.
   1. RB1-KO hESC를 6-웰 플레이트의 한 웰에서 80% 합류점으로 성장시킨다.
   2. 배지를 제거하고 1mL의 1x DPBS로 세포를 헹굽니다.
   3. 1mL의 디스파제 완충액( 재료 표 참조)을 사용하여 37°C에서 5분 동안 세포 콜로니를 상승시킵니다.
      참고: 현미경으로 세포 콜로니를 확인하십시오. 일반적으로 식민지의 가장자리가 펼쳐지는 데 5 분이 걸립니다.
   4. 디스파제 완충액을 흡인하고 1mL의 1x DPBS로 세포를 한 번 부드럽게 헹굽니다.
   5. 1mL의 중간 I을 웰에 추가합니다.
   6. 콜로니를 조각(콜로니당 6-9개)으로 자르고 배지에 10μL의 흰색/일반 피펫 팁을 넣습니다.
      참고: 일반적으로 셀의 약 60%-70%가 웰에서 분리됩니다. 세포 스크레이퍼를 사용하여 배지에 남아 있는 세포를 긁어냅니다.
   7. 15mL 튜브에서 200 x g 로 5분 동안 원심분리하여 모든 세포를 수확합니다.
   8. 약 50 μL의 상청액을 배지에 남겨두고 세포를 분산시킨 다음, 세포를 250 μL의 성장 인자와 혼합하여 부드러운 교반에 의해 기저막 매트릭스를 감소시킨다.
      알림: 성장 인자 감소 된 기저막 매트릭스를 사용하기 전에 4 ° C 또는 얼음 위에 보관하십시오. 분취하여 -20 °C에서 보관하는 경우 사용하기 전에 밤새 또는 최소 1 시간 동안 4 ° C에 두십시오.
   9. 부유 세포가 있는 15mL 튜브를 37°C 인큐베이터에 20분 동안 보관합니다.
      참고: 세포와 성장 인자 감소 기저막 매트릭스가 응고된 겔을 형성하는지 확인하십시오.
   10. 1mL 튜브에 1mL의 배지 I을 추가한 다음 응고된 겔을 2-3회 가볍게 피펫하여 1mL 피펫으로 덩어리를 분산시킵니다.
   11. 9mL의 배지 I을 추가하고 세포 현탁액을 10cm 세포 배양 접시에 옮깁니다.
   12. 접시를 5%_CO2 가 있는 37°C 인큐베이터로 옮기고 하루를 0일로 설정한다.
   13. 1일째에 현미경을 사용하여 세포를 검사합니다.
       알림: 접시에서 수천 개의 속이 빈 낭종이 관찰 될 수 있습니다. 평균적으로 한 조각의 젤에서 3-4 개의 낭종이 관찰됩니다.
   14. 5 일째에 매체를 변경하십시오. 상청액을 15mL 튜브에 모으고 낭종이 바닥에 가라앉을 때까지 기다린 다음 배지를 제거하고 새로운 배지 I로 교체합니다.
       알림: 4일째에 배지가 노란색으로 변하면 4일째에 배지를 교체하고 그렇지 않으면 5일째에 배지를 교체하십시오. 원래 접시에 신선한 배지 I 10mL를 추가합니다. 수백 개의 낭종이 이미 배양 표면에 부착되어 있습니다. 그들을 거기에 보관하십시오.
   15. 튜브의 낭종을 두 개의 10cm 접시에 분산시킵니다.
       알림: 접시에 최소 300개의 낭종이 있는지 확인하십시오. 낭종이 합류하지 않으면 낭종을 다른 접시로 분리하지 마십시오. 원래 10cm 접시에 다시 넣으십시오.
   16. 7 일째에 대부분의 낭종 (95 % 이상)이 접시에 붙어 퍼지고 부착 된 식민지를 형성합니다.
       참고: 빠르면 3일째에 부착된 콜로니를 관찰할 수 있습니다.
   17. 10 일째에 신선한 배지 I로 배지를 교체하십시오. 모든 낭종이 접시에 붙어 있는지 확인하십시오.
   18. 다음 단계 전에 DMEM 36mL, F12 12mL, 보충제 B 2%(v/v), 0.1mM MEM 비필수 아미노산 용액(NEAA)을 혼합하여 배지 II를 준비합니다.
   19. 세포가 13-17 일까지 퍼져 있는지 확인하십시오. 세포가 퍼져 있지만 이웃 콜로니와 상호 작용하지 않는 15 일째에 다음 단계를 수행하십시오.
   20. 1mL의 DPBS로 세포를 한 번 헹구고 1mL의 디스파제 용액을 37°C에서 5분 동안 추가합니다.
       참고: 5분 이내에 셀의 가장자리가 올라갑니다.
   21. 디스파제 완충액을 제거하고 1mL의 1x DPBS로 배양물을 부드럽게 헹굽니다.
   22. 각 10cm 접시에 배지 II 10mL를 추가하고 37°C, 5%_CO2 배양기에서 배양합니다.
   23. 부착 된 배양 물은 24 시간 후에 자발적으로 분리되어 망막 유기체로 조립됩니다.
       참고: 유기체를 형성하지 않는 수많은 세포는 다음 2일 이내에 사망합니다.
   24. 분리 3일 후, 세포 배양 접시에서 세포를 수집하고 오가노이드가 15mL 튜브에 침전되도록 합니다.
   25. 튜브에서 상청액을 제거하고 오가노이드를 다음 4일 동안 10mL의 배지 II가 있는 새로운 비부착성 접시(페트리 접시)로 옮깁니다.
   26. DMEM : F12를 3 : 1 비율 (v / v), 2 % 보충 B (v / v), 0.1 mM MEM 비 필수 아미노산 용액 (NEAA), 8 % 태아 소 혈청 (FBS) (v / v), 100 μM 타우린 및 2 mM 글루타민.
   27. 분리 일주일 후 매체를 중간 III으로 변경하십시오.
   28. 이 날부터 배지 III에서 오가노이드를 배양하고 일주일에 두 번 배지를 새로 고칩니다.
3. RB 세포주의 확립.
   알림: 모든 시약은 RT에서 예열됩니다.
   1. 90일째에 RB(80%-90%)는 망막 오가노이드를 포함합니다. 따라서, RB 세포주의 생성을 위해 90일간 RB 오가노이드를 선택한다.
   2. 로스웰 파크 기념 연구소(RPMI)-1640 배지를 10% FBS와 혼합하여 1640 배지를 준비합니다.
   3. RPMI-20 배지에서 현미경으로 현미경으로 미세 수술 칼로 RB를 조각 (RB 당 25-1640 개)으로 자릅니다.
   4. RPMI-1640 배지를 제거하고 조각을 0.25% 트립신/EDTA로 37°C에서 10분 동안 처리합니다.
   5. RPMI-1640 배지를 추가하여 반응을 종료하고 200 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
   6. 상청액을 제거하고 세포를 부착되지 않은 접시의 1640 배지에 재현탁시킨다.
   7. RB 세포주는 부유 배양물이다. 배지를 일주일에 두 번 교체하고 2주 이내에 RB 세포를 계대합니다.
      참고: 1차 RB 세포의 증식 속도는 매우 느립니다.

RB 생성 절차는 부착 및 부유 배양을 결합한 그림 1에서 설명됩니다. hESC로부터 인간 RB1-KO를 수확하고, RB 오가노이드를 단리함으로써 RB 세포주를 수득할 수 있었다.

여기서 프로토콜은 다양한 단계의 차별화에 대한 세부 정보를 제공합니다(그림 2). 속이 빈 구체는 처음 3일 동안 형성되어 배양 표면에 부착된 다음 확장됩니다(그림 2A-E). 15일째부터, 세포는 상승되고 현탁액에서 배양된다(도 2F). 분리 다음 날, 망막 유기체가 형성되고 밝은 테두리가 보입니다 (그림 2G, 검은 색 화살표). 또한, 유기체 외부의 세포는 다음 주에 죽을 가능성이 있습니다 (그림 2G, 주황색 화살표). 27일째에 시신경 소포 구조가 분명하고 오가노이드의 약 90%가 이 구조를 나타냅니다(그림 2H). 이 구조가없는 유기체는 폐기 될 수 있습니다. RB의 첫 번째 검출은 45 일에 발생하고 50 일에 만져집니다 (그림 2I). 90일까지 성장하면 시신경 소포 구조가 주로 RB에 의해 접힙니다(그림 2J). 한편, RB는 추가 배양을 위해 RB 세포주로서 분리될 수 있었다(도 2K). 80% 이상의 망막 오가노이드는 105일째에 RB에 의해 완전히 포위될 것입니다(그림 2L). 그들은 RB 오가노이드의 종양 발생을 나타내는 H9 유래 망막 오가노이드와 비교하여 Ki67(증식 마커) 및 SYK(종양유전자 마커)의 발현을 높게 보여줍니다(그림 2M,N). 또한 RB 오가노이드에서 ARR3(원뿔 전구체 메이커) 및 CRX(광수용체 전구체 마커)의 높은 발현은 이들이 원뿔 전구체 세포에서 유래했음을 보여줍니다(그림 2O,P).

RB 생성 절차는 주로 RB 형성 전에 형태 변화와 함께 3 단계를 거칩니다. 여기에서 연구는 해당 단계에서 열등하고 우수한 결과를 제공합니다(그림 3). 분화 및 미분화 hESC (그림 3A, B)는 형태와 구별하기 쉽고 미분화 hESC는 RB 형성을 위해 선택됩니다. 5일째에는 단색 구(그림 3C)가 아닌 속이 빈 구(그림 3D)가 생성되어야 합니다. RB는 시신경 소포 구조를 나타내는 망막 오가노이드에서 파생됩니다(그림 3F). 하부 오가노이드에서 생성되는 RB는 없습니다(그림 3E).

그림 1: RB 오가노이드 분화의 개략도. 제0일-제15일, 세포는 배지 I에서 2D 배양되고, 제15일 이후에는 세포가 현탁 배양된다. RB는 약 45 일에 형성됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: RB 생성 및 특성화. (A-C) 초기 단계의 절차에서, hESC는 상승하여 낭종을 형성한다. (B)의 검은색 화살표는 디스파아제 처리 후 hESC의 압연 가장자리를 보여줍니다. (D,E) 낭종은 판 (D)에 부착 된 다음 팽창합니다 (E). (f) 부착성 세포는 상승하여 망막 오가노이드를 형성한다. 검은 색 화살표는 dispase 처리 후 압연 된 가장자리를 나타냅니다. (G,H) RB가 없는 초기 망막 오가노이드. (I, J) 망막 오가노이드가 50일째(I) 및 90일째(J)에 RB를 갖고, 녹색 원은 RB 부분을 증거한다. (K) 90일 망막 오가노이드로부터 단리된 RB 세포주. (L) 105일째의 RB 오가노이드. (월-피) 종양유전자 마커(M,N) 및 광수용체 마커(O,P)에 대한 면역형광 이미지. AL에서 스케일 바 = 200 μm; M-P에서 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 음성 결과와 양성 결과의 비교. 0일차(A,B), 5일차(C,D) 및 30일차(E,F)의 미분에 대한 열등한 이미지와 우수한 영상입니다. 스케일 바 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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