Method Article

다중 매개 변수 광유체 플랫폼을 사용하여 칼슘 유입 및 HIV-1 감염의 단세포 특성화

DOI:

10.3791/62632

⸱

May 18th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Icahn Institute of Data Science and Genomic Technology, 3Black Family Stem Cell Institute, Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Icahn Institute of Data Science and Genomic Technology, 4Sema4, a Mount Sinai venture

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서, 우리는 나노 유체 장치에 있는 급성 사건 및 생산적인 HIV-1 감염을 위해 단 하나 세포가 감시되는 프로토콜을 제시합니다. 이미징 데이터는 바이러스 호스트 수용체 상호 작용 및 신호 경로 역학을 정의합니다. 이것은 나노 유체 고처리량 종방향 단세포 배양 및 이미징을 위한 첫번째 방법이다 운동및 분자 상호 작용을 연구하기 위하여.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HIV-1은 전 세계적으로 3,700만 명 이상에게 영향을 미치는 만성 감염을 일으킵니다. 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)와 함께 사는 사람들은 항 레트로 바이러스 치료에도 불구하고 만성 염증과 관련된 혼변성을 경험합니다. 그러나 이러한 염증 성 신호는 완전히 특징적이지 않았습니다. 세포 신호 이벤트 및 다운스트림 유전자 발현의 활성화에 대한 초기 진입 이벤트의 역할은 단일 세포 수준에서 포착되지 않았습니다. 여기서 저자는 동적 셀룰러 프로세스의 높은 처리량 분석을 허용하는 사용자 맞춤형 시간 과정을 통해 배양 및 이미지 세포를 배양하는 자동화 된 단일 셀 플랫폼에 살아있는 세포 형광 현미경 검사법의 원리를 적용하는 방법을 설명합니다. 이 분석법은 HIV-1 감염을 즉시 따르는 초기 사건의 단일 세포 살아있는 형광 현미경 검사법, 특히 바이러스에 노출과 형광 기자 바이러스를 사용하여 생산적인 감염의 발달을 수반하는 칼슘의 유입을 추적할 수 있습니다. MT-4 세포는 칼슘에 민감한 염료를 장착하고 나노유체 장치에 있는 격리된 펜에서 배양됩니다. 배양된 세포는 HIV-1 리포터 바이러스(HIV-1 NLCI)에 감염된다. 나노유체 장치 위에 위치한 형광 현미경은 급성 HIV-1 노출 후 8분 의 시간 과정을 통해 칼슘 유입을 측정합니다. HIV-1 생산성 감염은 4일 간격을 통해 동일한 세포에서 측정됩니다. 이 시간 과정의 이미징 데이터는 바이러스 호스트 수용체 상호 작용 및 신호 경로 역학을 정의하기 위해 분석됩니다. 저자는 단일 세포 정렬, 배양, 이미징 및 소프트웨어 자동화가 가능한 새로운 광유체 플랫폼을 사용하여 전통적인 이미징 방법에 대한 통합적이고 확장 가능한 대안을 제시합니다. 이 분석체는 매개 변수의 배열을 측정하는 동안 세포 유형, 고뇌스트 또는 길항제 효과를 포함한 다양한 조건하에서 이벤트의 운동학을 측정할 수 있습니다. 이것은 나노 유체 고처리량 종방향 단세포 배양 및 화상 진찰을 위한 첫번째 확립된 방법입니다: 이 기술은 세포 신호 운동및 동적 분자 상호 작용을 공부하기 위하여 광범위하게 적응될 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

만성 염증은 HIV와 관련된 초기 이환율및 사망률1,2,3의주요 원인입니다. HIV가 염증 신호를 활성화할 수 있는 여러 메커니즘이 있으며, 최근 증거는 칼슘 게이팅 아데노신 삼위산염(ATP) 수용체3,4,4,5,6,7,8,9,10인HIV 항목에서 P2X 수용체에 대한 역할을 시사한다. 퓨리너기체 수용체의 P2X 특수형(P2XR)은 이 염증의 중요한 촉진자가 될 수 있다. 그러나, HIV-P2XR 상호 작용의 분자 기계장치는 크게 알려지지 않으며 초기 및 늦은 HIV-1 바이러스 성 수명 주기 단계에 영향을 미칠 수 있습니다. HIV 관련 만성 염증을 유....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 이미징을 위한 세포 준비

  1. 신선한 플루오-4 AM 로딩 솔루션 준비: 100x 농축 세제 용매의 25 μL을 추가한 다음 플루오-4 AM 1000x2.5 μL을 1.5mL 튜브에 추가합니다. 혼합 소용돌이.
  2. 배양 매체의 파이펫 2.5 mL을 로딩 솔루션으로 전환하여 혼합합니다. 빛으로부터 보호하십시오.
  3. 원심분리기 2 x 106 MT-4 셀500 x g에서 3 분 동안.
  4. 제조된 플루오-4 AM 로딩 용액의 2mL에서 미디어를 제거하고 펠릿을 다시 분리합니다. 빛으로부터 보호하십시오.
  5. 파이펫은 세포를 35mm 페트리 접시에 다시 매달아 넣습니다. 15-30 분 동안 37 °C에서 인큐베이션한 다음 실온에서 15-30 분 추가로 배양하십시오.
  6. 세포 현탁액을 원심분리기 튜브로 옮기다. 원심분리기 셀은 500 x g에서 3분 동안 로딩 용액으로 구성된 상퍼를 제거합니다.
  7. 배양 배지의 1mL로 배양 배지및 원심분리기의 파이프를 500 x g에서 3분 동안 세척하여 세포 펠릿을 다시 분리한다.
  8. 2 x 106 세포/mL(최소 50 μL)의 농도에서 배양 배지에서 배양 배지에서....

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Results

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도 1은 형광 현미경을 통해 획득한 칩 및 원시 이미징 데이터의 형식을 도시한다. mCherry 측정을 통해 감염되지 않은 및 감염된 세포의 식별 및 클러스터링은 도 2에도시된다. 이 클러스터는 HIV 감염 된 세포에 있는 초기 칼슘 유입을 보여주는 그림 3에있는 칼슘 유입 운동학을 위해 분석됩니다. 도 4는 칼슘 유입과 mCherry 형광(20)사이의 유의한 긍정적인 상관관계를 나타낸다.

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

단일 세포에서 칼슘 유입과 HIV-1 생산감염 사이의 관계를 연구하는 기술된 방법론은 다른 작용제 또는 관심있는 길항제에 대한 응답으로 세포내 칼슘 운동학을 연구하도록 적응할 수 있다. 이미징을 위한 세포 의 준비는 간단하고 최소한의 시간 집약적이며, 시약은 널리 사용되는 제조업체의 편리한 키트에서 사용할 수 있습니다. 플루오-4 기반 칼슘 측정은 문헌에 잘 설명되어 있으며, HIV-1은 이 플랫폼에서 공부하기 위해 다른 바이러스 또는 관심 화합물을 쉽게 대체할 수 있다. 상이한 세포 유형 및 배양 배지를 사용할 수 있다. 대안 또는 추가 형광 채널이 지원되며 여러 형광을 동시에 또는 순차적으로 이미지화할 수 있습니다.

또한, 절차는 세로 시간 과정에서 불소 표지 이벤트를 공부하기 위해 널리 적응 될 수있다. 유동 세포측정과 같은 표준 고처리량 방법은 시간 과정 동안 이산 이벤트에 대한 쌍을 이루는 연구를 허용하지 않습니다. 형광 현미경 검사를 통한 전통적인 단세포 화상 진찰은 .......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

R.P.S.는 세마4의 직원입니다. 다른 저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 벤자민 첸 박사와의 과학적 토론에 감사드립니다. 이 작품은 K08AI120806(THS), R01DA052255(THS 및 KB), R21AI152833(THS 및 KB)의 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
  Beacon 광유체 시스템버클리 조명
  태아 소 세럼Gibco
  FIJI오픈 소스 소프트웨어PMID: 22743772, 22930834
  Fluo-4 칼슘 이미징 키트Thermo Fisher  F10489
  Benjamin Chen의PMID: 28148796
  Hyclone Pennecillin 스트렙토마이신 솔루션GE Healthcare Life sciences  SV30010
  MT-4 세포NIH AIDS 시약  ARP-120
  OptoSelect 3500 칩버클리 라이트
  피펫 팁Denville Scientific  P3020-CPS
  프리즘 9.0.0그래프패드
  RPMI-1640 미디엄시그마-알드리치  R8758
혈청 피펫Fisher 브랜드  13-678-11E
조직 배양 후드다양한 모델
T75 플라스크코닝3073
HIV-1 NLCINL4-3 연구실

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aberg, J. A. Aging, inflammation, and HIV infection. Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).
  2. Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection. Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).
  3. S....

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