RNA-seq 데이터에서 대체 스플라이싱 및 폴리아데닐화 식별

요약

대체 스플라이싱(AS) 및 대체 폴리아데닐화(APA)는 전사체 이소형과 그 생성물의 다양성을 확장합니다. 여기에서는 실험 조건에 따라 다양한 AS 및 APA를 검출하고 시각화하기 위해 벌크 RNA-seq 및 3' 말단 시퀀싱 분석을 분석하는 생물정보학 프로토콜을 설명합니다.

초록

실험/생물학적 조건에서 차등 유전자 발현(DGE)을 측정하기 위한 RNA-Seq의 일반적인 분석뿐만 아니라 RNA-seq 데이터를 활용하여 엑손 수준에서 다른 복잡한 조절 메커니즘을 탐색할 수도 있습니다. 대체 스플라이싱 및 폴리아데닐화는 전사 후 수준에서 유전자 발현을 조절하기 위해 다양한 이소형을 생성하여 유전자의 기능적 다양성에 중요한 역할을 하며, 분석을 전체 유전자 수준으로 제한하면 이 중요한 조절 층을 놓칠 수 있습니다. 여기에서는 바이오컨덕터와 DEXSeq, Limma 패키지의 diffSplice 및 rMATS를 포함한 기타 패키지 및 기능을 사용하여 조건에 따른 차등 엑손 및 폴리아데닐화 부위 사용의 식별 및 시각화를 위한 자세한 단계별 분석을 시연합니다.

서론

RNA-seq는 일반적으로 차등 유전자 발현 및^{유전자 발견을} 추정하기 위해 수년에 걸쳐 널리 사용되어 왔습니다1. 또한 다양한 이소 형을 발현하는 유전자로 인해 다양한 엑손 수준 사용량을 추정하는 데 활용할 수 있으므로 전사 후 수준에서 유전자 조절을 더 잘 이해하는 데 기여할 수 있습니다. 대부분의 진핵생물 유전자는 mRNA 발현의 다양성을 증가시키기 위해 대안적 스플라이싱(AS)에 의해 상이한 이소형을 생성한다. AS 이벤트는 다른 패턴으로 나눌 수 있습니다 : ( "카세트") 엑손이 측면 인트론과 함께 전사체에서 완전히 제거되는 완전한 엑손 (SE)의 건너 뛰기; 대안 (공여체) 5' 스플라이스 부위 선택 (A5SS) 및 대안 3' (수용체) 스플라이스 부위 선택 (A3SS) 2개 이상의 스플라이스 부위가 엑손의 양쪽 말단에 존재할 때; 인트론이 성숙한 mRNA 전사체 내에 유지되는 경우 인트론(RI)의 유지 및 한 번에 두 개의 사용 가능한 엑손 중 하나만 보유할 수 있는 엑손 사용(MXE)의 상호 배제 ^2,3. 대안적 폴리아데닐화 (APA)는 또한 단일 전사체로부터 다수의 mRNA 이소형을 생성하기 위해 대안적인 폴리 (A) 부위를 사용....

프로토콜

1. 분석에 사용되는 도구 및 R 패키지 설치

1. Conda는 모든 플랫폼에서 종속성이 있는 패키지를 편리하게 설치할 수 있는 인기 있고 유연한 패키지 관리자입니다. 'Anaconda'(conda 패키지 관리자)를 사용하여 분석에 필요한 도구 / 패키지를 설치하는 데 사용할 수있는 'conda'를 설치하십시오.
2. https://www.anaconda.com/products/individual#Downloads 에서 시스템 요구 사항에 따라 'Anaconda'를 다운로드하고 그래픽 설치 프로그램의 지시에 따라 설치하십시오. Linux 명령줄에 다음을 입력하여 'conda' 를 사용하여 필요한 모든 패키지를 설치합니다.
   conda install -c daler sratoolkit
conda install -c conda-forge parallel
conda install -c bioconda star bowtie fastqc rmats rmats2sashimiplot samtools fasterq-dump cutadapt bedtools deeptools
3. 프로토콜에 사용 된 모든 R 패키지를 다운로드 하려면 R 콘....

결과

위의 단계별 워크플로우를 실행한 후 AS 및 APA 분석 출력과 대표 결과는 다음과 같이 생성된 테이블 및 데이터 플롯 형태입니다.

만큼:
AS 분석의 주요 출력(diffSplice에 대한 보충 표 1; DEXSeq)에 대한 표 2는 조건에 따른 차등 용법을 나타내는 엑손의 목록이고, 통계적 유의성에 의해 순위가 매겨진 하나 이상의 구성 엑손의 유의한 전체 스플라이싱 활성을 나타내는 유전자 목록이다. 보충 표 1, 탭 2는 유의한 엑손을 보여주며, 열은 엑손 대 휴식의 차등 FC, 엑손당 조정되지 않은 p-값 및 조정된 p-값(Benjamini-Hockberg 보정)을 보여줍니다. 조정 된 p- 값에 대한 임계 값은 정의 된 FDR을 갖는 엑손 세트를 제공 할 것이다. 보충 표 1, 탭 3은 전체 스플라이싱 활성의 유의성을 .......

토론

이 연구에서는 대량 RNA-Seq 및 3' 말단 시퀀싱 데이터에서 AS 및 APA를 검출하기 위한 엑손 기반 및 이벤트 기반 접근 방식을 평가했습니다. 엑손 기반 AS 접근법은 차등적으로 발현된 엑손의 목록과 전체 유전자 수준의 차등 스플라이싱 활성의 통계적 유의성에 따라 정렬된 유전자 수준 순위를 모두 생성합니다(표 1-2, 4-5). diffSplice 패키지의 경우, 차등 사용은 엑손 수준에서 가중 선형 모델을 피팅하여 동일한 유전자 내의 다른 엑손의 평균 로그 폴드 변화에 대한 엑손의 차등 로그 폴드 변화를 추정함으로써 결정됩니다 (엑손 FC 당이라고 함). 유전자 수준 통계적 유의성은 개별 엑손 수준 유의성 검사를 Simes 방법¹⁰에 의한 유전자 별 검사로 결합하여 계산됩니다. 유전자 수준의 차등 스플라이싱 활성에 의한 이러한 순위는 후속적으로 관련된 주요 경로(¹⁰)의 유전자 세트 농축 분석(GSEA).......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
계산 연구

와 관련이 없음