GCaMP3 리포터와 심장 특정 칼슘 플럭스를 측정하여 심장 재프로그래밍의 체외 평가

Zhaokai Li; Liu Liu; Zhong Wang

doi:10.3791/62643

방법 논문

GCaMP3 리포터와 심장 특정 칼슘 플럭스를 측정하여 심장 재프로그래밍의 체외 평가

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DOI:

10.3791/62643

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2022년 2월 22일

Zhaokai Li^*¹^,² , Liu Liu^*¹ , Zhong Wang¹

¹Department of Cardiac Surgery, Cardiovascular Center, The University of Michigan, Ann Arbor, ²Department of Cardiovascular Medicine, Xiangya Hospital, Central South University

^* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

우리는 여기에 설명, Tg의 설립 및 응용 프로그램 (Myh6-cre)1Jmk / J /Gt (ROSA)^{26Sortm38 (CAG-GCaMP3)(CAG-GCaMP3)}(αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 아래라고함) 심장 재프로그래밍 평가를 위한 마우스 리포터 라인. 마우스 균주로부터 분리된 신생아 심장 섬유아세포(NCFs)는 유도된 심근세포(iCM)로 변환되어 칼슘(^Ca2+) 플럭스를 통해 iCM의 재프로그래밍 효율과 기능성 성숙을 편리하고 효율적으로 평가할 수 있습니다.

초록

심장 재프로그래밍은 손상된 심장을 복구하는 잠재적으로 유망한 치료법이되었습니다. Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT)를 포함하여 다중 전사 요인을 도입함으로써 섬유아세포는 유도된 심근세포(iCM)로 다시 프로그래밍될 수 있습니다. 이러한 iCM은 극한의 심장에서 시투에서 생성될 때 주변 심근과 전기및 기계적으로 통합되어 흉터 크기가 감소하고 심장 기능이 개선됩니다. IMC의 리프로그래밍 효율성, 순도 및 품질이 상대적으로 낮기 때문에 iMC의 특성화는 여전히 어려운 과제입니다. 현재 사용되는 방법은 유동 세포측정, 면역 세포화학 및 qPCR을 포함하여 주로 심장 특이적 유전자 및 단백질 발현에 초점을 맞추고 있지만 iCM의 기능성 성숙에는 초점을 맞추지 않습니다. 작용 잠재력에 의해 촉발, 심근 세포에 전압 게이트 칼슘 채널의 개방은 세포로 칼슘의 급속한 유입으로 이어질. 따라서 칼슘 유입 속도를 정량화하는 것은 심근세포 기능을 평가하는 유망한 방법입니다. 여기서, 프로토콜은 칼슘(^Ca2+) 플럭스로 iCM 기능을 평가하는 방법을 소개한다. αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-GCaMP3 마우스 스트레인은 Gt(ROSA)^{26Sortm38(CAG-GCaMP3)의 Hze}/J(Rosa26A-M-Stop-M3-M)와 Tg(Myh6-cre)1Jmk/J(아래 Myh6-Cre라고 함)를 교차하여 설립되었습니다. P0-P2 신생아 마우스의 신생아 심장 섬유아세포(NCFs)는 시험관 내에서 분리되고 배양되었고, MGT의 다각성 건설은 NCFs에 도입되어 ICM에 대한 리프로그래밍을 주도하였다. 성공적으로 다시 프로그래밍된 iMC만이 GCaMP3 리포터를 발현하기 때문에 iCM의 기능성숙은 형광 현미경 으로 ^Ca2+ 플럭스로 시각적으로 평가될 수 있습니다. NCF-iC는 비프로그래밍된 NCF와 비교하여 CM과 유사한 상당한 칼슘 과도 플럭스와 자발적인 수축을 보였습니다. 이 프로토콜은 마우스 변형 소작용 확립, 분리 및 신생아 마우스 심장의 선택, NCF 절연, 심장 재프로그래밍을 위한 레트로바이러스 생성, iCM 유도, 기자 라인을 이용한 iCM ^Ca2+ 플럭스의 평가, 관련 통계 분석 및 데이터 프레젠테이션을 자세히 설명합니다. 여기에 설명된 방법은 심장 재프로그래밍 연구를 위한 iCM의 기능성숙을 평가하는 귀중한 플랫폼을 제공할 것으로 기대된다.

서론

심근 경색 (MI)은 전 세계적으로 심각한 질병입니다. 심장 혈관 질병 (CVDs)는 전 세계적으로 사망의 주요 원인이며 20191,2에서 약 ^1,860 만 명의 사망자를 차지합니다. CVD의 총 사망률은 지난 반세기 동안 감소했습니다. 그러나, 이러한 경향은 CVDs의 더 효과적인 처리를 요구하는 몇몇 미개발 국가에서 둔화되거나 반전되었습니다¹. CVD의 치명적인 표현의 한개, MI는 미국에 있는 CVDs에 기인한 모든 죽음의 대략 반을 차지합니다². 허혈 동안 관상 동맥의 차단과 영양소와 산소의 공급이 제한되어 심근은 심한 대사 변화를 겪고 심근 세포 (CM)의 수축기 기능을 손상시키고 CM 사망³로 이어집니다. 심장 혈관 연구에 있는 수많은 접근은 심장 상해를 복구하고 부상당한 심장⁴의 기능을 복구하기 위하여 탐구되었습니다. 직접적인 심장 리프로그래밍은 손상된 심장을 복구하고 기능을 복원하는 하나의 유망한 전략으로 부상했습니다^5,6