인간 단세포와 같은 THP-1 백혈병 세포선을 사용하여 M2와 같은 표현형으로 대식세포 분화 및 편광

요약

M2 와 같은 종양 관련 대식세포 (TAM)는 암에서 종양 진행 및 가난한 예후와 관련이 있습니다. 이 프로토콜은 THP-1 단핵세포와 같은 세포를 14일 이내에 M2와 같은 대식세포로 재현가능하게 분화하고 편광하는 상세한 가이드의 역할을 합니다. 이 모델은 종양 미세 환경 내에서 TAM의 항염증 효과를 조사하는 기초가 된다.

초록

종양 관련 대식세포(TAM)는 외부 자극에 따라 발현 및 사이토카인 프로파일을 전환할 수 있다. 이 놀라운 가소성은 TAM이 종양 미세 환경 내의 지속적인 변화에 적응할 수 있게 합니다. 대식세포는 주로 프로 염증 (M1 같이) 또는 항 염증 (M2 같이) 속성을 가질 수 있으며 이 두 가지 주요 상태 간에 지속적으로 전환 할 수 있습니다. 종양 환경 내의 M2 와 같은 대식세포는 여러 유형의 암에서 암 진행 및 불량 예후와 관련이 있습니다. THP-1 세포의 분화 및 편광을 유도하기 위한 많은 다른 방법은 세포 간 세포 간 메커니즘및 종양의 미세 환경 내의 TAM의 효과를 조사하기 위해 사용됩니다. 현재, THP-1 세포주사용으로 M2유사 대식세포 편광에 대한 확립된 모델은 없으며, 특정 체외 자극으로 인한 대식세포의 발현 및 사이토카인 프로파일의 결과는 연구마다 차이가 있다. 이 프로토콜은 THP-1 단세포와 같은 세포를 M0 대식세포로 분화하고 14일 이내에 세포를 M2와 같은 표현형으로 더 편광하는 상세한 지침의 역할을 합니다. 우리는 빛 현미경 을 사용하여 THP-1 단화 와 같은 세포, 분화 된 대식세포 및 편광 M2 와 같은 대식세포의 형태학적 변화를 보여줍니다. 이 모델은 TAM의 항염증 효과와 종양 미세 환경의 다른 세포 집단과의 상호 작용을 조사하는 세포주 모델의 기초입니다.

서론

종양 관련 대식세포(TAM) 및 만성 염증, 암 발병 및 종양 발달에서의 그들의 역할은 최근 연구^1,2에서중요한 표적이다. 발달 종양의 조직 미세 환경에 모집되는 말초 혈액 단핵구는 대식세포로 분화되고 대식세포^3의2개의 주요 특수형으로 편광될 수 있다. 고전적으로 활성화된 대식세포는 주로 프로염증성 M1유사 표현형을 나타내며 대안적으로 활성화된 M2와 같은 아형은 주로 항염증 특성^4를나타낸다. 대식세포는 세포 대사에 따라 이 두 가지 주요 표현형 사이에 동적으로 전환할 수 있으며, 중간 아류형은 염증 및 항염증 특성^5를모두 갖는다. TAM은 두 표현형의 이기종 집단을 나타낸다. 암의 다른 모형에 있는 종양 촉진 기능 및 가난한 예후는, 그러나, 특히 M2 같이 대식세포^6,7,8와연관됩니다.

대식세포의 기능적 프로파일과 종양 미세 환경 내의 다른 세....

프로토콜

참고: 이 프로토콜에 설명된 단계에 대한 개요는 그림 1에표시됩니다. 인간 단세포종 백혈병 세포주 THP-1을 구입했다. THP-1 세포주 인증을 위해 짧은 탠덤 반복 분석이 수행되었다. 멸균 조건에서 모든 단계를 수행합니다. THP-1 단낭세포선은 현탁액에서 자라며 세포 배양 표면에 부착하지 않습니다. 준수는 예를 들어, 기계적 응력 또는 PMA를 통한 특정 처리를 통해 대식세포와 같은 세포로 단핵구를 분화시킴으로써 유도될 수있다.

1. THP-1 단세포와 같은 세포의 배양 및 유지 보수

1. 타이머를 150s로 설정합니다. 액체 질소로부터 THP-1세포주(재료표)를함유한 냉동 유리알을 제거하고 깨끗한 수조(37°C)에서 즉시 해동한다. 바이알을 수조에 넣으면마자 타이머를 시작합니다. 해동 공정으로 인해 쌓이는 압력을 방출하기 위해 캡을 풀지만 튜브 개구부가 물에 닿지 않도록 하여 오염을 방지합니다. 세포를 해동하기위한 최적의 기간은 120-150 s 사이입니다. 약 4mm 크기의 얼음 칩이 유리병 내에 남아있을 때까지 셀 서스펜션을 계속 해동; 그런 다음 즉시 다음 단계로 진행하십시오.
2. 세포 현탁액의 액체 상을....

결과

M2와 같은 대식세포는 특징이 었으며, M2 편광은 차별화 마커(CD) CD14, CD11b, CD80(M1 형 마커) 및 CD206(M2 와 같은 마커)의 클러스터를 위한 유동 세포측정을 사용하여 검증되었다. 흐름 세포분석 염색은 제조업체의 지시에 따라 수행되었다. 대식세포는 PBS/5% FBS로 세척하고 특이하지 않은 결합을 피하기 위해 Fcγ 수용체 블록으로 배양되었습니다. 세포는 FITC-컨쥬게이드 마우스 항인간 CD14 및 CD80 항체, PE-컨쥬게이드 마우스 항인간 CD11b 항체, 그리고 PE-탠덤 컨쥬게이드 마우스 항인간 CD206 항체 및 이소타입 일치IgG(재료의 표)로염색하였다. 4색 유동 세포측정 해석 및 형광 수량이 수행되었다. 세포의 게이팅은 전방 산란 및 측면 산란에 따른 세포 파편을 제외하고 수행되었다.

단세포 및 대식세포 마커 CD14 및 CD11b는 각각 세포의 70.9%와 74.7%로

토론

14일 이내에 THP-1 단세포와 같은 세포를 분화하고 편광하는 이 프로토콜은 단계 사이에 적절한 휴식 기간을 가진 세포의 긴 치료 배양으로 인해 뚜렷한 M2 와 같은 표현형으로 대식세포를 얻는 방법을 제공한다.

특정 단계는 이 프로토콜에 매우 중요합니다. THP-1 단핵구의 두 배 시간은 약 26h입니다. 세포는 9 x 10 5/mL의 세포 밀도로 분할될 수 있으며 모든 분할 동안 3 x 10^5/mL의밀도로 시드되어야 합니다. 분할은 모든 사용된 (오래된) 세포 매체를 제거하지 않고 수행 될 수있다 - 신선한 배지의 단지 50 %로 세포를 재공급하는 것은 실제로 조건부 세포 배지의 성장 인자가 세포 증식을 향상시킬 수 있기 때문에 더 빠른 세포 성장으로 이어질 수 있습니다. 그러나 모든 세포 매체를 교환하지는 아니하여 배양 오염의 위험이 증가하므로 갓 배양 된 세포의 첫 번째 구절 중에만 수행해야합니다. 세포를 세는 것은 올바른 밀도에서 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.4% trypan blue	VWR, Radnor, USA	152-5061
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브	USA Scientific, Ocala, USA	1615-5510
10 mL 혈청학적 피펫	VWR, Radnor, USA&	nbsp; 89130-898
1000 &뮤; L TipOne 피펫 팁	USA Scientific, Ocala, USA	1111-2821
15 mL  원심분리기 튜브	VWR, Radnor, USA	89039-664
20 μ L TipOne 피펫 팁	USA Scientific, Ocala, USA	1120-1810
200 μ L TipOne 피펫 팁	USA Scientific, Ocala, USA	1120-8810
25 mL 혈청학 피펫	VWR, Radnor, USA	89130-900
5 mL 혈청학적 피펫	VWR, Radnor, USA	89130-896
50 mL 원심분리기 튜브	VWR, Radnor, USA	89039-662
Accutase 용액 500 mL	Sigma, St. Louis, USA	A6964
항생제 항진균 용액 (100x), 안정화	된 Sigma, St. Louis, USA	A5955-100 mL	10,000 단위 페니실린, 10 mg 스트렙토 마이신 및 25 μm; mg amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, 세포 배양에 적합
바인더 CO2 인큐베이터	VWR, Radnor, USA	C170-ULE3
CytoOne T-75cm 플라스크(필터 캡 포함	USA Scientific, Ocala, USA	CC7682-4875
Dulbecco' s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma, St. Louis, USA	D8537-500 mL	염화칼슘과 염화마그네슘이 없는 PBS는 대식세포 편광을 변화시킬 수 있으므로 사용해야 합니다
Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated)	Eppendorf, Enfield, USA	-
에틸 알코올 (70%)	-	-
FACSCalibur flow cytometer	BD Biosciences, San Diego, USA	-	유세포 분석기는 CellQuest 소프트웨어(BD Biosciences)
Falcon 24-well plate	VWR, Radnor, USA	353504
Fetal Bovine Serum (FBS)	ATCC, Manassas, USA	30-2020
FITC Mouse Anti-Human CD14	BD Biosciences, San Diego, USA	555397	유세포 분석, 골수성 세포 마커(100회 테스트)
FITC Mouse Anti-Human CD80	BD Pharmingen, San Diego, USA	557226	유세포 분석, M1 마커(100회 테스트)
FITC 마우스 IgG1 κ Isotype Control	BD Pharmingen, San Diego, USA	555748	유세포 분석, CD80에 대한 isotype control (100 tests)
FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control	BD Biosciences, San Diego, USA	553456	유세포 분석, CD14에 대한 isotype control (100 tests)
Human BD Fc block	BD Biosciences, San Diego, USA	564220	유세포 분석, Fc block (0.25 mg)
Human interleukin 13 (IL-13)	R& D, 미국 미니애폴리스	IL-771-10 μ g
인간 인터루킨 4 (IL-4)	R& D, 미국 미니애폴리스	SRP3093-20 μ g
Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213)	Labconco, Kansas City, USA-L
-글루타민 용액, 200 mM	ATCC, Manassas, USA	30-2214
대장균의 지질다당류(LPS) 0111:B4	Sigma, St. Louis, USA	L2630-100 mg
Mini Cell	Scrapers Biotium, Fremont, USA	22003
Neubauer 혈구계	Fisher Scientific, Waltham, USA	02-671-5
Nikon Eclipse inverted microscope TS100	Nikon, Melville, USA-Nuclease-free
water	Invitrogen, Carlsbad, USA	AM9937
Olympus Light Microscope RH-2	Microscope Central, Feasterville, USA	40888
P10 variable pipet- Gilson	VWR, Radnor, USA	76180-014
P1000 가변 피펫-Gilson	VWR, Radnor, USA	76177-990
P200 가변 피펫- Gilson	VWR, Radnor, USA	76177-988
PE Mouse Anti-Human CD11b	BD Biosciences, San Diego, USA	555388	유세포 분석, 골수성 세포 마커(100회 테스트)
PE 마우스 IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences, San Diego, USA	555749	유세포 분석, CD11b에 대한 isotype control (100 테스트)
PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206	BD Pharmingen, San Diego, USA	551136	유세포 분석, M2 마커 (100 테스트)
PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD Pharmingen, San Diego, USA	555750	유세포 분석, CD206에 대한 isotype control (100 테스트)
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, St. Louis, USA	P8139
Powerpette Plus 피펫 VWR	, Radnor, USA	75856-448
Precision Water bath (model 183)	Precision Scientific, Chicago, USA	66551
RPMI-1640 Medium	ATCC, Manassas, USA	30-2001
THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC, Manassas, USA	TIB-202

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