리보솜 단백질 합성의 단일 분자 형광 에너지 전송 연구

요약

단일 분자 형광 에너지 전달은 리보소말 단백질 합성 시 tRNA 역학을 추적하는 방법입니다. 개별 리보솜을 추적함으로써, 불동성 집단 집단이 식별되어 메커니즘에 빛을 비추게 됩니다. 이 방법은 다른 많은 복잡한 생물 시스템에서 동적 기능 관계를 밝히기 위해 일반적으로 생물학적 형성 변화를 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 단일 분자 방법은 평균 효과로 인해 기존의 앙상블 방법에 의해 접근할 수 없는 비비율 제한 단계 및 낮은 인구밀도키 중간체를 관찰할 수 있다.

초록

리보솜은 mRNA 템플릿을 따라 공정하게 단백질을 조립하는 큰 리보뉴클레오단백질 복합체입니다. 리보솜의 직경은 A-, P-및 E-사이트에서 대형 tRNA 기판을 수용할 수 있는 약 20nm이다. 따라서 리보솜 역학은 자연스럽게 빠르게 단계적 해제됩니다. 단일 분자 방법은 각각의 리보솜을 개별적으로 감지하고 다중 구성 요소 시스템의 복잡한 메커니즘을 드러내는 데 필수적인 불동성 집단을 구별할 수 있습니다. 우리는 리보솜 단백질 L27과 tRNAs 사이 리보솜 역학을 조사하기 위하여 Nikon Ti2 반전 현미경을 기반으로 smFRET 방법의 세부 사항을 보고합니다. L27은 독특한 Cys 53 위치에 표시되어 L27이 부족하도록 설계된 리보솜으로 재구성됩니다. tRNA는 팔꿈치 부위에 표시되어 있습니다. tRNA가 전지 및 전후 전좌와 같은 신장 주기 동안 리보솜 내부의 다른 위치로 이동함에 따라 FRET 효율성과 역학은 여러 하위 집단을 제안한 차이를 나타낸다. 이러한 하위 채우기는 앙상블 방법으로 는 감지할 수 없습니다. TIRF 기반 smFRET 현미경은 수동 또는 전동 반전 현미경에 내장되어 있으며 집에서 만든 레이저 조명이 있습니다. 리보솜 샘플은 초원심분리에 의해 정제되어 집에서 만든 다중 채널 샘플 셀에 로드된 다음 에반에센트 레이저 필드를 통해 조명됩니다. 반사 레이저 스팟은 완벽한 초점의 피드백 제어를 달성하는 데 사용할 수 있습니다. 형광 신호는 전동 필터 포탑으로 분리되고 두 대의 디지털 CMOS 카메라에 의해 수집됩니다. 강도는 NIS-Elements 소프트웨어를 통해 검색됩니다.

서론

리보솜은 큰 (50S) 및 작은 (30S) 하위 단위의 ø 20 nm 큰 리보뉴클레오단백질 복합체이다. 그것은 공정하고 협조적으로 mRNA 템플릿을 따라 긴 펩티드를 조립합니다. 리보솜 30S는 단백질 합성을 시작하기 위해^{fMet-tRNA fMet} 및 mRNA에 결합하고, 50S는 70S 개시 복합체를 형성하기 위하여 그 때 결합합니다. tRNA는 A-사이트(아미노아실-tRNA 결합 부위)에서 리보솜에 아미노산을 가져오고, 길쭉한 펩티딜 체인은 P-site(peptidyl-tRNA 결합 부위)에서 유지된다. 전전 측부 복합체에서 펩티딜 사슬은 1개의 아미노산을 첨가한 A-사이트에서 tRNA로 전달된다. 한편, P-사이트 tRNA는 디딜레이트된다. 그런 다음 A-, P-tRNA는 P-, E-사이트로 이동하여 전자 사이트가 tRNA 출구 사이트를 나타내는 트랜스로케이션 후 복합체를 형성합니다. 이 상태에서, 펩디딜-tRNA는 P-사이트로 다시 이동한다. 신장 주기는 리보솜이 mRNA에 전·후 부적합,^한번에 1개의 코돈으로 이동하면서 사전 및 사후 적합성 사이에서 계속된다. 리보솜은 서브유닛 래칫^2,tRNA 혼성화 변동^3,GTPase 활성화

프로토콜

1. FRET 검출을 위한 라벨이 부착된 리보솜 및 tRNA 의 준비

1. 표준^{프로토콜(20,21)에}따라 대장균 균주 IW312로부터 L27없이 리보솜을 분리한다. 대장균 균주 MRE600으로부터 일반 리보솜을 추출한다.
2. C-단말 그의 태그와 L27의 rpmA 유전자를 pET-21b (+) 플라스미드로 복제하여 BL21(DE3)pLysS^{세포(15)로}변형및 발현된다. 미리 포장된 세파로즈 컬럼을 통해 단백질을 정화합니다.
3. L27 라벨링
   1. 실온(RT)에서 2-10배 초과 TCEP(Tris-2-carboxyethyl-phosphine)를 100 μL로 20-100 μM의 정제 L27을 30분 동안 배양한다. 버퍼는 용액을 낮잠-5 컬럼을 사용하여 PBS 버퍼(10m Na₂HPO_4,1.8mM KH₂PO_4,2.7 mM KCl; 0.137 M NaCl)로 교환한다. DMSO에 10배 초과 Cy5-maleimide 모노 반응성 염료를 첨가하고 2시간 동안 어둠 속에서 RT에서 배양합니다.<....

결과

smFRET는 tRNA 트래픽의 중간 위치에 리보솜을 표시하여 TRNA 전좌를 A-에서 P 사이트로 구별하였다(도1)^15. L27 라벨링 잔류물에서 A-또는 P-사이트 tRNA에 대한 거리는 각각 52 또는 61Å이며, FRET 효율은 0.47 및 0.65에 해당한다. 이미지 수집 후, 기증자 및 수락자 채널의 형광 강도가 검색되어 시간 경과로플롯되었습니다(그림 1). FRET 효율은 수식I_수락제에의해 계산되었다 /(나는_수락+I_기증자). 수제 프로그램은 기증자 /수락자의 단단계 표백을 감지하고 노이즈에서 FRET의 계산을 피하기 위해 표백 점 전에 데이터를 장착했습니다. 기증자 표백 후, 두 흔적모두 기준선에 접근했는데, 이는 접수기(도2.......

토론

SmFRET는 배경 신호에 민감합니다. 먼저, 시료 챔버를 0.05% 트웬으로 코팅한 다음 리보솜 용액과 동시에 첨가하여 표면에 리보솜의 비특이적 결합을 차단할 필요가 있다. 수용자 Cy5 방출에서 형광을 보기 위해 산소 제거제 칵테일 (데옥시, 포도당 및 트로록스 용액)이 필수적입니다. 이 솔루션없이, 표백은 유용한 정보를 얻기 위해 수용자 채널에서 너무 빠릅니다. 리보솜 실험을 위한 또 다른 중요한 단계는, 특히, 유리 표면에 PEG 코팅입니다. 리보솜 활동은 표면 환경에 민감합니다. 따라서, 긴 칫솔질 폴리머는 불리한 표면 효과를 보호하는 데 필수적입니다.

샘플 단계가 초점과 너무 멀리 떨어져 있으면 자동 초점 시스템이 작동하지 않습니다. 이 경우 자동 초점을 끄고 반사된 레이저 스팟을 관찰하면서 목표 위치를 수동으로 조정합니다. 이것은 레이저 반점이 보이기 때문에 홈 내장 총 내부 반사 조명의 한 가지 장점이다. 목표가 초점에 가까워지면 사고 및 반사 된 레이저 반점이 나.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아미노실란	Laysanbio	MPEG-SIL-5000
비오틴-PEG	Laysanbio	비오틴-PEG-SVA-5000
BL21(DE3)pLysS 세포	Novagen	71403
카탈라제	밀리포어 시그마	C3515
CS150FNX 마이크로 초원심분리기	Nuaire
Cy3/C5-maleimide	ApexBio	A8138/A8140
ECLIPSE Ti2 도립 현미경	Nikon
EdgeGARD 층류 후드	베이커
포도당 산화효소	밀리포어 시그마	G2133
Histrap HP 컬럼(사전 포장된 세파로스 컬럼)	Cytiva	17524701
현미경 커버 슬립	VWR	48393-230
현미경 유리 슬라이드	VWR	470235-792
ORCA-Flash4.0 V3 카메라	Hamamatsu
PEG (5,000)	Laysanbio	MPEG-SVA-5000
pET-21b (+) 플라스미드	Novagen	69741
Sonicator	VWR	CPX-952-518R
TCEP	Apexbio	B6055
Trolox	밀리포어 시그마	238813