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방법 논문

일차 및 불멸화 된 인간 각막 상피 세포에 대한 UV 방사선 및 화학 물질의 독성 결정

2.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/62675

⸱

2021년 7월 22일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Ocular Research & Education (CORE), School of Optometry & Vision Science, University of Waterloo, 2Centre for Eye and Vision Research (CEVR)

이 논문에서

요약

이 기사에서는 1차 및 불멸화 세포주에서 UV 방사선 및 화학 독소의 독성을 평가하는 데 사용되는 절차를 설명합니다.

초록

이 기사에서는 일차(pHCEC) 및 불멸화(iHCEC) 인간 각막 상피 세포 배양에서 자외선(UV) 방사선 및 안구 독소의 독성을 측정하는 방법을 설명합니다. 세포는 UV 방사선 및 독성 용량의 염화벤잘코늄(BAK), 과산화수소(H2O2) 및 황산나트륨(SDS)에 노출되었습니다. 대사 활성은 대사 분석을 이용하여 측정하였다. 염증성 사이토카인의 방출은 multi-plex interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-8 및 tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) assay를 이용하여 측정하였으며, 형광 염료를 이용하여 세포 생존율을 평가하였다.

세포 대사 활성 및 사이토카인 방출에 대한 UV의 손상 효과는 iHCEC에 대한 UV 노출 5분 및 pHCEC에 대한 UV 노출 20분에서 발생했습니다. iHCEC 및 pHCEC의 대사 활성의 유사한 퍼센트 감소는 BAK,H2O2, 또는 SDS에 노출된 후에 발생하였고, 사이토카인 방출의 가장 유의한 변화는 IL-6 및 IL-8에 대해 발생하였다. 형광으로 염색된 iHCEC 및 pHCEC BAK에 노출된 세포의 현미경은 0.005% BAK 노출에서 세포 사멸을 나타내었지만, 에티듐 염색의 정도는 pHCEC보다 iHCEC에서 더 컸습니다. 현미경을 사용하여 독성 효과를 평가하는 여러 방법, 대사 활성 평가 및 사이토카인 생산을 활용하여 UV 방사선 및 화학 독소의 독성을 1차 및 불멸화 세포주 모두에 대해 측정할 수 있습니다.

서론

체외 독성학 연구는 세포에 손상을 줄 수있는 화학 물질 및 기타 물질의 독성 영향을 예측하기 위해 수행됩니다. 각막에 대한 독성의 평가에서, 인간 각막 상피 세포 (HCECs)는 이들 효과를 평가하기 위한 모델에 사용되었다 1,2,3,4. 이러한 모델은 일반적으로 세포의 대사 활동, 세포 증식 및 염증성 사이토카인의 생성 및 방출과 같은 기타 세포 기능의 변화와 같은 생리학적 효과를 평가합니다. 이러한 독성학 연구를 위해 HCEC에 대한 화학 물질 및 UV 방사선의 손상 효과를 평가하기 위해 다양한 출처의 세포가 선택되었습니다 2,3. pHCEC 라인은 성인의 공여자 조직으로부터 이들 세포를 제공하는 회사로부터 입수가능하다. 일차 세포는 디스파아제로 처리하고 배양을 위해 각막을 부드럽게 긁어낼 수 있다5. 그런 다음 세포는 바이러스 및 오염에 대해 테스트한 다음 10% 디메틸 설폭사이드에 냉동 보존된 상태로 배송됩니다.

일차 세포주의 장점은 세포가 기증자의 세포와 유전적으로 동일하다는 것입니다. 이는 시험관내 모델이 생체 내 조직을 가능한 한 많이 모방해야 하기 때문에 이상적입니다. 일차 세포주의 단점은 세포 분열 또는 계대 수가 제한되어 있다는 것이다6. 사용 가능한 세포 수가 제한되어 단일 1차 배양으로 수행할 수 있는 실험 수가 제한되어 실험 비용이 증가합니다.

불멸화된 세포주는 또한 세포 배양 독성 모델에 사용되었습니다. 그러나 생체 내 조직에서 얻은 일차 세포주와 달리 불멸화 된 세포주는 유 전적으로 변형되었습니다. 불멸화 된 세포는 바이러스의 유전자를 일차 세포 6,7,8의 DNA에 통합함으로써 생성됩니다. 바이러스 유전자 결합에 성공한 세포는 불멸화된 세포주를 위해 선택됩니다. 불멸화의 장점은 무기한의 빠른 증식을 허용하여 동일한 세포주를 사용하여 여러 실험을 수행할 수 있는 무제한의 세포를 제공한다는 것입니다. 이를 통해 실험 간의 일관성을 유지하고 비용을 절감할 수 있습니다.

세포 증식을 제한하는 유전자의 변화 외에도 중요한 기능을 가진 유전자의 발현 변화도 발생할 수 있다9. 그러므로, 불멸화된 세포를 사용하는 것의 단점은 다양한 외부 자극에 대한 반응의 관점에서 더 이상 원래의 생체 내 세포를 나타내지 않을 수 있다는 것이다(10). 비교에는 일차 및 불멸화된 인간 각막 각막세포(human corneal keratocytes)11, 불멸화된 HCECs(HCECs)와 토끼 각막 상피 일차 세포(rabbit corneal epithelial primary cell)12에 대한 화학물질의 독성 영향을 관찰하는 것이 포함되었다. 일차 인간 각질세포와 불멸화된 각질세포에 대한 독소의 효과 간의 비교는 유의미한 차이를 나타내지 않았다11. 이 기사에 설명된 방법을 사용하여 pHCEC 및 iHCEC에 대한 UV 방사선 및 안구 독소의 독성을 평가하기 위한 이러한 분석의 효과를 결정할 것입니다.

시험관내 분석에서 통상적으로 사용되는 3개의 안구 독소를 선택하였다: BAK,H2O2, 및 SDS. BAK는 안과용 용액에 통상적으로 사용되는 양이온성 방부제(13,14)이고,H2O2는 콘택트렌즈(15)를 소독하는데 통상적으로 사용되며, SDS는 세제와 샴푸(14)에서 발견되는 음이온성 계면활성제이다. 안구 독소와 마찬가지로 자외선도 HCEC에 심각한 손상을 줄 수 있습니다3. 또한, 자외선에 과다 노출되면 찢어짐, 빛에 대한 민감성, 거친 느낌 등의 증상을 특징으로 하는 광각막염(photokeratitis)으로 알려진 안구 질환이 발생할 수 있다16.

사용할 수 있는 일차 세포 배양액은 무제한이며 다양한 불멸화 세포주가 개발되었습니다. 따라서 이러한 유형의 세포를 통합하는 모델 간의 유사점과 차이점을 결정하기 위해 1차 HCEC를 불멸화된 HCEC 계통과 비교하기 위한 조사가 수행되었습니다.

이 조사는 현미경을 사용하여 UV 및 독소에 대한 세포 생리학적 반응에 대한 pHCEC와 iHCEC 간의 가능한 차이를 평가했습니다. 두 세포주에 대한 세포 대사 활동 및 염증성 사이토카인 방출에 대한 UV 방사선 및 화학 물질의 영향도 평가되었습니다. 두 세포주 간의 차이를 결정하는 것의 중요성은 1) 세포에 대한 UV 방사선의 영향, 2) 세포에 대한 독소의 영향, 3) 향후 연구를 위해 대사, 세포 생존율 및 세포 사이토카인 방출에 대한 결과적인 변화를 평가하기 위해 이러한 세포주의 최적 사용을 이해하는 것입니다.

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프로토콜

1. pHCEC 및 iHCEC의 배양

  1. 다음 보충제를 사용하여 인간 안구 상피 배지(HOEM)에서 pHCEC 및 iHCEC를 성장시킵니다: 6mM L-글루타민, 0.002% 세포 배지 보충제 O(재료 표), 1.0μM 에피네프린, 0.4% 세포 배지 보충제 P(재료 표), 콜라겐-1 코팅 배양 플라스크에서 5μg/mL rh 인슐린, 5μg/mL 아포-트랜스페린 및 100ng/mL 히드로코르티손 헤미숙시네이트(75cm2 배양 플라스크에서 18mL).
  2. 세포가 ~80% 합류점으로 성장한 후 배지를 제거하여 플라스크의 배지를 2-3일마다 교체합니다. 페놀 레드가 없는 해리 용액을 추가하고 세포가 완전히 분리될 때까지 플라스크를 37°C에서 배양합니다. DMEM/F12로 해리 용액을 혈청으로 중화한 다음 500× g에서 세포를 원심분리합니다. 상청액을 배지를 제거하고 HOEM 배지에서 세포를 재현탁합니다.

2. 컨포칼 현미경을 이용한 세포 크기 측정

  1. pHCEC와 iHCEC를 1mL의 HOEM과 함께 1 × 105 농도의 유리 바닥 커버슬립이 있는 콜라겐 코팅된 페트리 접시에 시드합니다. pHCECs 및 iHCECs를, 한 세트의 배양물을 24시간 동안 및 다른 세트의 배양물을 5%CO2의 37°C 인큐베이터에서 48시간 동안 성장시킨다.
  2. 배양 기간 후, 세포를 37°C에서 20분 동안 칼세인(4 μM), 에티듐 호모다이머-1(8 μM) 및 아넥신 V(500 μL 완충액-Alexa Fluor 647 접합체에 5 μL)를 포함하는 500 μL의 아넥신 염색 완충액으로 염색합니다. 세포를 염색한 후 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 칼세인-AM의 경우 488/515nm, 에티듐 호모다이머-1의 경우 543/600nm, 아넥신 V의 경우 633/665nm의 여기/방출 파장을 캡처하기 위해 현미경을 조정합니다.
  3. 이미지를 얻고 Z 스택을 사용하여 3차원에서 셀 크기를 평가합니다.
    1. 2차원(2D) 및 3차원(3D) 이미지를 획득하려면 아포크로맷 40x/1.2 물 대물렌즈로 이미징할 영역을 찾습니다. 아르곤 (488) (첫 번째 스캔), HeNe1 (543) (두 번째 스캔 및 HeNe2 (633) (세 번째 스캔) 레이저를 사용하여 빔 스플리터, HFT 488/543/633, NFT 635 Vis 및 NFT 545 LP560, LP505를 사용하여 세 개의 개별 채널에서 스캔합니다.
    2. 다중 트랙 순차 스캔을 사용하여 누화를 줄입니다.
      참고 : LP505는 칼세인 염료의 방출을 포착하기 위해 488 레이저와 함께 채널 2에 사용됩니다. LP560은 에티듐 호모다이머 1의 방출을 포착하기 위해 543 레이저와 함께 채널 3에서 사용됩니다. NFT 635는 633 레이저와 함께 사용되어 아넥신 V의 방출을 포착합니다. HFT의 목적은 여기광과 발광광을 분리하는 것입니다. NFT는 지정된 파장< 빛을 별도의 채널로 반사하고 지정된 파장> 두 번째 채널로 빛이 통과하도록 하여 빛을 분할합니다. LP 필터는 지정된 파장보다 짧은 파장을 차단하고 긴 파장을 통과시킵니다.
    3. 3D로 이미지화하려면 공초점 렌즈를 Z 스택으로 설정하고 최소 20프레임을 스캔합니다.

3. 자외선에 대한 세포 노출

  1. 24-웰 콜라겐-1 코팅된 배양 플레이트의 각 웰에 5 × 104/mL의 HOEM에서 세포를 시딩하고 37°C에서 5%CO2 로 3시간 동안 배양합니다. 배양 기간 후, 웰 내의 배지의 부피를 300 μL로 감소시킨다. 다음으로, 세포를 UV 방사선(UVA 및 UVB 튜브가 동시에 인큐베이터에서 켜져 있기 때문에 6.48W/m2 의 UVA 및 1.82W/m2 의 UVB)에 별도의 실험에서 5분 및 20분 동안 37°C 인큐베이터에 노출시킵니다.
  2. UV 방사선 후, 200 μL의 신선한 HOEM을 각 웰에 첨가하고, 5%CO2와 함께 37°C에서 20시간 동안 인큐베이션한다.
  3. 배양 후, 각 웰에 세포 상청액을 모으고 멸균 된 2 mL 폴리 프로필렌 튜브로 옮긴다. -80 °C에서 동결. UV 노출 후 pHCEC 및 iHCEC에서 방출되는 사이토카인 수준을 측정하려면 다중 사이토카인 분석을 사용하고 키트의 지침에 따라 IL-6, IL-8, IL-1β 및 TNF-α의 4가지 사이토카인을 정량화합니다.
  4. 웰의 세포에 대사 분석 시약을 추가합니다.
  5. DMEM/F12에서 10% 대사 분석 시약을 준비합니다. 각 웰의 배양 배지를 10% 대사 분석 용액 1mL로 교체하고 37°C에서 4시간 동안 5%CO2 와 함께 인큐베이션합니다.
  6. 530/590 nm 여기/방출 파장에서 형광 플레이트 리더를 사용하여 각 용액의 형광을 측정합니다.

4. 화학 독소에 대한 세포 노출

  1. 종자 세포를 24-웰 콜라겐-1 코팅된 배양 플레이트의 각 웰에서 5 × 104/mL의 HOEM에서 3시간 동안 5%CO2와 함께 37°C에서 배양합니다. 배양 기간 후, 배지를 제거하고, 세포를 1 mL의 화학 독소 (BAK 0.001%, H2O2 0.01%, 및 인산염 완충 식염수 (PBS) 중 SDS 0.0025%)에 5 및 15분 동안 노출시킨다.
  2. 화학 독소에 노출된 후 웰에서 독소를 제거하고 1mL의 PBS로 헹구고 1mL의 HOEM을 각 웰에 추가합니다. 20시간 배양 후, 배지를 10% 대사 분석 용액 1mL로 교체하고 37°C에서 5%CO2 로 4시간 동안 배양하여 대사 분석을 수행합니다. 530/590 nm 여기/방출 파장에서 형광 멀티웰 플레이트 리더를 사용하여 형광을 측정합니다.
  3. 20시간 인큐베이션한 후 웰에서 세포 상청액을 별도의 멸균 2 mL 폴리프로필렌 튜브로 옮기고 -80°C에서 동결시킵니다. 화학 물질에 노출된 후 pHCEC 및 iHCEC에서 방출되는 사이토카인을 정량화합니다. UV 처리된 세포에서 사이토카인을 평가하는 데 사용되는 것과 동일한 멀티플렉스 플랫폼을 사용합니다. 키트의 지침에 따라 다중 사이토카인 분석을 사용하여 IL-6, IL-8, IL-1β 및 TNF-α의 4가지 사이토카인을 정량화합니다.

5. 다양한 농도의 BAK에 노출된 세포 검사

  1. 시드 세포를 24-웰 콜라겐-1 코팅된 배양 플레이트의 각 웰에서 1 × 10 5/mL의 HOEM에서 24시간 동안5%CO2 와 함께 37°C에서 배양합니다. 배양 기간 후, 배지를 제거하고, 세포를 1 mL의 화학 독소(BAK 0.001%, BAK 0.005%, 및 BAK 0.01% in PBS)에 5분 동안 노출시킨다.
  2. 노출 후 화학 독소를 제거하고 1mL의 PBS로 웰을 헹구고 각 웰에 1mL의 HOEM을 추가합니다. 20시간 배양 후 칼세인(4μM), 에티듐 호모다이머-1(8μM) 및 아넥신 V(500μL 완충액-Alexa Fluor 647 접합체에 5μL)가 포함된 500μL의 아넥신 염색 완충액으로 세포를 37°C에서 20분 동안 염색합니다. 현미경을 조정하여 각각 630/675nm, 495/515nm 및 528/617nm의 여기/방출 파장에서 annexin V, calcein AM 및 ethidium-1 염색의 강도를 측정합니다. 형광 현미경을 사용하여 세포 이미지

6. 데이터 분석

  1. 분산 분석(ANOVA), Welch ANOVA 또는 Kruskal-Wallis 검정을 수행하기 전에 정규성 검정과 등분산 검정을 수행합니다. 테스트한 각 그룹을 비교하기 위해 적절한 사후 테스트를 사용합니다. p < 0.05로 설정합니다.

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결과

셀 크기
1차 및 불멸화된 HCEC는 세포 생존력의 세 가지 다른 단계를 반영하는 세 가지 형광 염료로 시각화되었습니다. 살아있는 세포는 녹색(calcein-AM), 죽은 세포는 빨간색(ethidium homodimer-1), 세포사멸 세포는 노란색(형광 신호의 더 나은 시각화를 위해 annexin V-computer-adjusted color)입니다. 살아있는 세포는 세포 세포질에 에스테라아제를 포함하고 칼세인-AM을 칼세인으로 전환합니다. 죽은 세포에는 에티듐 호모다이머-1을 투과할 수 있는 세포막이 있습니다. 세포사멸 세포는 포스파티딜세린이 외막으로 전위됨에 따라 세포막에서 염색됩니다.

두 가지 유형의 HCEC에 대한 세포 크기 비교는 그림 1과 같이 24시간 및 48시간 성장 후 컨포칼 현미경을 사용하여 이루어졌습니다. iHCEC(그림 1A

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토론

두 가지 유형의 HCEC 사용의 잠재적 차이를 평가했습니다. 세포를 동일한 농도의 세포로 동일한 배지(HOEM)에 배치한 다음 단기간 및 장기간의 UV 방사선과 3개의 안구 독소에 노출시켰습니다. UV 방사선 및 화학 물질의 선량은 생리학적 효과에 따라 선택되었으며, 이는 비교할 수 있는 중간 반응을 생성하기에 세포에 충분히 손상을 입혔습니다. UV 방사선에 대해 5 및 20 분의 노출 시간 및 BAK (0.001 %), SDS (0.0025 %), 및H2O2(0.01 %)의 선택된 용량에 대해 5 및 15 분의 노출 시간은 세포와 처리되지 않은 대조군 사이에 유의하게 상이한 반응을 나타내는 이상적인 노출 시간 및 농도였다.

HOEM은 HCEC 배양에 최적화된 무혈청 배지입니다. HOEM은 일차 세포와 불멸화 세포의 성장을 지원합니다. 본 조사에 사용된 불멸화 세포주는 SV408을 사용하여 불멸화하...

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공개 사항

저자인 Lyndon W. Jones는 지난 3년 동안 CORE를 통해 Alcon, Allergan, Allied Innovations, Aurinia Pharma, BHVI, CooperVision, GL Chemtec, i-Med Pharma, J&J Vision, Lubris, Menicon, Nature's Way, Novartis, Ophtecs, Ote Pharma, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass SightSage 및 Visioneering으로부터 연구 지원 또는 강의 명예를 받았습니다. Lyndon Jones는 Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis 및 Ophtecs의 컨설턴트 및/또는 자문 위원회에서 활동하고 있습니다. 다른 저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

저자는 이 작업에 대한 자금을 받지 못했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
75 cm2 벤티드 플라스크코닝354485이것은 BioCoat 브랜드, 콜라겐 코팅
96웰 플레이트costar3370
alamarBlueFisher Scientificdal 1025
Annexin 염색 완충 용액Invitrogen, Burlington, ON, Canada
Annexin VInvitrogen, Burlington, ON,
Axiovert 100 현미경 510 시스템Carl Zeiss Inc., 독일
Corning 48 웰 플레이트Corning354505이것은 BioCoat 브랜드, 콜라겐 코팅
Cytation 5BioTekCYT5MPV280 - 700 nm에서 형광을 읽을 수 있습니다 (분석의 경우 540/590)
Fetal Bovine SerumHyconeSH30396.03
유리 바닥 커버슬립MatTek Corporation, Ashland, MA, USA
Human Corneal Epithelial CellsUniversity of OttawaN/ADr. M. Griffith(Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada)의 SV40 불멸화 인간 각막 상피 세포는 Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA를 특성화했습니다. 세포주에서 구성된 기능적 인간 각막 등가물. 과학. 1999년; 286:2169-72.
다음과 같은 보충 교재를 갖춘 인간 안구 상피 매체 (HOEM) :Millipore, Billerica, MA, USASCMC0016 mM L-글루타민, 0.002 % EpiFactor O (기사의 세포 매체 보충 O)로 보충 된 Epigro 기본 매체, 1.0 μ M 에피네프린, 0.4% EpiFactor P (기사의 세포 배지 보충제 P), 5 μ g/mL rh 인슐린, 5 μ 콜라겐-1 코팅 배양 플라스크에 담긴 g/mL Apo-트랜스페린 및 100ng/mL 하이드로코르티손 헤미숙시네이트(BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).
Live Dead calcien and ethidium homodimerInvitrogen, Burlington, ON, Canada
MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrumentRockville, MD, USA
MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assayRockville, MD, USA
Penicillin StreptomycinGibco15140-122100x 농도이므로 각 99mL의 배지에 1mL를 첨가
Primary Corneal Epithelial CellsMillipore, Billerica, MA,USA SCCE016
SpectraMax 형광 멀티웰 플레이트 리더Molecular Devices, 미국
TrypLE Express (cell dissoci solution)Fisher Scientific12605036
Zeiss 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경이 있는 캐나다 입니다 하십시오.캘리포니아주 서니베일

참고문헌

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