이 원고에서는, 우리는 전임상 사용을 위한 온연성 포진 심플렉스 바이러스의 성장, 정제 및 적정의 간단한 방법을 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
온코연성 포진 심플렉스 바이러스의 성장, 정화 및 적정
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
종양용성 포진 심플렉스 바이러스(oHSV)와 같은 종양용액 바이러스(OV)는 암 면역요법 분야에서 빠르게 성장하는 치료 전략이다. oHSV를 포함한 OV는 항종양 면역을 유도하면서 암세포(건강/정상 세포를 아끼는)를 선택적으로 복제하고 죽입니다. 이러한 독특한 특성 때문에, oHSV 기반 치료 전략은 점점 더 암의 치료에 사용되고있다, 전임상 및 임상적으로, FDA 승인 탈리모진 laherparevec을 포함 (T-Vec). 성장, 정제 및 적정은 실험 연구에 활용되기 전에 oHSV를 포함한 모든 TV에 필수적인 실험실 기술입니다. 이 백서는 베로 세포에서 oHSV를 증폭시키는 간단한 단계별 방법을 설명합니다. oHSV가 증식함에 따라 베로 세포에서 세포 병증 효과 (CPE)를 생성합니다. 감염된 세포의 90-100%가 CPE를 나타내면, 부드럽게 수확되고, 벤조나제와 염화마그네슘(MgCl2)으로처리되고, 여과하고, 자당그라데이션 방법을 사용하여 정제를 실시한다. 정제 후, 전염성 oHSV(플라크 형성 유닛 또는 PfUs로 지정)의 수는 베로 세포의 "플라크 분석"에 의해 결정된다. 본 명세서에 기재된 프로토콜은 세포 배양 및 생체 내 동물 실험에서 체외 연구를 위해 고-티터 oHSV 스톡을 준비하는 데 사용될 수 있다.
서론
종양 분석 바이러스 (EV)는 암 면역 요법의 신흥 독특한 형태입니다. OV는 항종양면역2를유도하면서 종양 세포(정상/건강한 세포를 아끼는)1에서 선택적으로 복제및 용해된다. 온코일리틱 포진 심플렉스 바이러스(oHSV)는 모든 TV 중에서 가장 광범위하게 연구된 바이러스 중 하나입니다. 탈리모진 래에르파렙벡(T-VEC)이 미국에서 고급 흑색종3의치료를 위한 FDA 승인을 받은 최초의 유일한 OV인 것으로, 클리닉에서 가장 멀리 있다. T-VEC 이외에, 다른 많은 유전자 조작 된 oHSV는 다른 암유형3,4,5,6,7,8에서전임상 및 임상적으로 테스트되고 있다. 현재 진행된 재조합 DNA 생명공학은 치료형 트랜스진3,5에대한 새로운 oHSV<....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1) oHSV 성장
참고: oHSV와 함께 일하기 전에 기관 생물 안전 위원회의 승인을 보장하십시오. 이 연구는 승인 된 IBC 프로토콜 번호 18007에서 수행되었다. BSL2 예방 조치를 유지하십시오: 바이러스와 접촉하는 모든 파이프, 팁, 튜브 및 기타 물질을 표백합니다. 손 전에 70 % 이소 프로필 알코올스프레이 장갑은 BSL2 세포 배양 후드를 떠난다. 바이러스로 작업 한 후 항상 철저하게 비누 물로 손을 씻으십시오.
- 일 -1, 종자 낮은 통로 베로 세포 20 T-150 cm2 플라스크의 밀도에서 7-8 × 106 세포/플라스크의 밀도가 일반 베로 세포 배지에서.
참고: 베로 배지는 덜벡코의 변형된 독수리 매체(DMEM)를 10%의 열불성 태아 종아리 혈청(IFCS)으로 보충하여 제조합니다. - 0일째(세포는 80-90% 컨실수)에 베로 세포에 oHSV 접종을 추가합니다.
- 바이러스 접종 준비
- 바이러스 증폭을 위해 0.01의 복합감염(MOI)을 사용합니다(MOI는 바이러스의 복제 능력에 따라 0.01에서 0.1까지 다양할 수 있음). 20 플라스크에 대한 바이러스 (mL)의 양을 계산하기 위해 수식(1)을
- 바이러스 접종 준비
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
전체 프로토콜에 대한 간략한 개요는 oHSV의 성장, 정화 및 적정과 관련된 중요한 단계를 나타내는 그림 1에묘사됩니다. 베로 세포에서 CPE는 HSV 감염 후 4시간 감염19로일찍 검출될 수 있다. 도 2는 oHSV 감염 다음 세 가지 다른 시점에서 베로 세포에서 CPE를 시연한다. 시간이 지남에 따라 CPE 수준이 증가합니다. 이 프로토콜에서, 90-100% CPE는 일반적으로 저MOI oHSV 접종의 48 시간 내에서 관찰됩니다 (이는 정화를 위한 세포를 수확하는 가장 좋은 시간입니다). 그러나, 1.2 단계 및/또는 oHSV의 복제 잠재력에서 접종된 oHSV MOI에 따라 최대 4일이 걸릴 수 있습니다. 이 기간 이외에도 CPE를 가진 세포는 용액을 제거하여 상체에서 바이러스가 방출될 수 있습니다. 따라서, 높은 바이러스 성 티터를 얻기 위해, 그들은 그대로 때 CPE 영향.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
프로토콜은 낮은 통로 베로 세포에서 oHSV의 성장으로 시작합니다. 베로 세포 단층의 합류는 자란 세포가 베로세포(20)로oHSV 입력을 감소시킬 수 있는 단단한 섬유구조를 개발할 수 있기 때문에 바이러스 접종 시에 ~80%여야 한다. 일단 90-100% CPE가 관찰되면, 배양 상체가 제거되고, 세포가 수확되고, VB/수퍼나탄트에서 재장매되고(단계 1.4.6 참조), 스냅 냉동, 및 나중에 정화를 위해 -80°C에 저장된다. Blaho와 동료는 감염된 베로 세포의 수확 및 저장의 약간 다른 방법을 고용했습니다. 예를 들어, 세포 및 배양 매체를 포함하는 플라스크(1% 소 세럼 알부민 및 PBS칼륨으로 보충됨)는 처음에는 -80°C에서 최소 15분 동안 저장되며, 이어서 실온에서 플라스크의 느린 워밍업이 뒤따릅니다. 세포는 그 때 살균 우유와 혼합하고, 정수20까지-80 °C에 저장됩니다. 이 경우 멸균 우유는 안정제 역할을 하며, 바이러스 육.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
SDR은 암젠과 액티벡(ActiVec Inc.)로부터 로열티를 받았으며 EG 427의 과학 자문위원회에 소속되어 있는 조지타운 대학과 매사추세츠 종합 병원에서 소유하고 관리하는 온연성 포진 심플렉스 바이러스와 관련된 특허에 대한 공동 발명가입니다. 다른 저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
사하 연구소의 연구는 법무부 (W81XWH-20-1-0702)와 닷지 존스 재단 - 애빌렌의 자금에 의해 부분적으로 지원되었다. 새뮤얼 D. 랍킨과 멜리사 R.M 험프리는 NIH(R01 CA160762)의 지원을 부분적으로 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.7 mL 원심분리기 튜브 | , Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL 폴리프로필렌 원심분리기 튜브 | , Falcon | 352097 | |
| 5 mL 폴리프로필렌 튜브 | , Falcon | 352063 | |
| 50 mL 폴리프로필렌 원심분리기 튜브 | , Falcon | 352098 | |
| 6-웰 세포 배양 플레이트 | , Falcon | 353046 | |
| Benzonase 뉴클레아제 | Sigma | E8263-25KU | |
| 세포 스크레이퍼 | Fisher Scientific | 179693 | |
| 디메틸 설폭사이드 | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco' s 수정 이글 미디엄 | 코닝 | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco' s 인산염 완충 식염수 | Corning | MT-21-031-CV | |
| 소 태아 혈청 | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| 글루타르알데히드 | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| 글리세롤 | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| 고혈당 둘베코' s 인산염 완충 식염수 | 시그마 | D4031 | |
| 인간 면역 글로불린 | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| 염화마그네슘 | Fisher Chemical | M33-500 | |
| 매체 살균 필터, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| 매체 살균 필터, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| 중립 적색 용액 | 시그마 | N4638 | |
| 파라포름알데히드 | 피셔 과학 | 15710S | |
| 플레이트 로커 | Fisher | 88861043 | |
| 페리시아나이드 칼 | 시그마 | P8131 | |
| 페로시안화 칼 | 륨 시그마 | P9387 | |
| 염화나트륨 | 피셔 화학 S271-3 | ||
| Sorvall ST 16R 원심분리기 | ThermoFisher Scientific | ||
| Sorvall ST 21R 원심분리기 | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| 나사 캡이 있는 멸균 마이크로 원심분리기 튜브 | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| 설탕 | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| 주사기 필터, 0.45 | PVDF MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| 주사기 필터, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| 주사기 필터, 5 µ m PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 배양 플라스크 | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| 초음파 수조 | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
참고문헌
- Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -C. Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).
- Zhang, S., Rabkin, S. D. The discovery and developmen....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
