섬유아세포, 선별 애플리케이션을 위한 인간 공학형 결합 조직

섬유성 질환의 연구에 있는 중요한 장애물은 섬유아세포및 그들의 병리학 적인 유도체의 행동에 통찰력을 제공하는 대표적인 인간 3D 조직 모형의 부족입니다. 섬유질 공정을 연구하기 위해, 표준 2D 배양 시스템은 분리된 섬유아세포가 비준수 2D 기판^에서 배양할 때 α 부드러운 근육 액틴(SMA)으로 빠르게 변형되기 때문에 최적이 다합니다^1,2,3. 따라서, 표준 2D 배양에서 섬유아세포는 규칙적인 "건강한" 조직 표현형을 반영하지 않는다^3,4,5,6. 유연한 기판에 배양비(10kPa) 및 섬유성(35kPa) ^{조직 환경을 시뮬레이션}하기 위해 도입되었지만, 병리생리학에 있어서 매우 중요한 제3차원이 부족하다. 조직 공학은 정의되고 실험적으로 튜닝할 수 있는 세포외 매트릭스(ECM)-컨텍스트에서 섬유아세포 배양을 허용함으로써 이러한 한계를 극복할 수 있는 기회를 제공하며, 예를 들어 세포성, ECM 조성 및 ECM 농도의 변경에 의해 조직 생체 역학을 결정할 수 있다.

섬유아세포를 사용하여 다양한 3D 모델이 생성되었습니다. 부동 디스크와 마이크로스피어는 첫 번째 디스크 중 하나였으며 콜라겐이 시간에 따라 리모델링되고 압축된다는 것을 보여줍니다. 섬유아세포는 콜라겐 피브릴에 견인력을 발휘하며, 성장 인자 베타 1(TGF-β1)을 변형시키는 것과 같은 프로 섬유성 제제의 첨가에 의해 촉진될 수 있는 과정입니다.^{8,9,10,11,12,13,14,15,16}. 그러나 자유롭게 부동 배양은 제어된 외부 로딩을 허용하지 않으므로 지속적으로 축소 또는 압축 모델을 구성합니다. 시트와 같은 엔지니어링 조직은 조직의 생체 역학 적 특성, 즉 유니, bi, 다차축 또는 순환 균주 테스트를 통해 동종 적 특성을 연구 할 수있는 가능성을 열었습니다.^17,18,19,20. 이러한 모델은 세포 골격 무결성 및 actomyosin 세포 골격 수축과 긍정적으로 상관 관계를 발견 된 조직 강성에 세포 수의 영향을 입증하기 위해, 예를 들어, 사용되었습니다^18,19. 그러나 힘 변환기 및 앵커 포인트의 클램프 포인트 주변의 비 균일한 조직 변형에 의해 강제-균주 변환이 복잡하다는 점에 유의해야 합니다. 이 고유의 제한은 개 뼈 또는 고리 모양의 조직에 의해 우회 될 수 있습니다, 앵커 지점에서 일부 조직 집행을 제공^21,22,23. 링 모양의 조직은 세포 콜라겐 하이드로겔을 링 모양의 금형에 분배하여 제조할 수 있습니다. 하이드로겔이 컴팩트함에 따라, 조직은 금형의 압축할 수 없는 내부 막대 주위에 형성되며, 이는 추가 조직 수축을 위한 저항을 제공합니다.^24,25,26,27. 초기 및 전형적으로 최대 다짐 후, 조직은 정의된 조직 길이에서 원형 ECT를 더 억제하기 위해 조절 가능한 스페이서로 옮겨질 수도 있습니다.^{3,24,25,26,27,28,29,30}. 생물물리학적 특성은 단방향 또는 동적 변형 하에서 적절한 부하 세포를 가진 표준 수평 또는 수직 변형 응력 장치에서 평가될 수 있습니다.³. 조직은 크게 균일 한 원형 구조를 가지고 있으며 바 / 후크 (앵커리지 포인트 및 / 또는 힘 변환기)에 보유 할 수 있기 때문에, 이들은 여전히 로딩 바 주위에 압축 영역을 둘러싸고 있지만, 이 형식은 클램핑에 비해 더 균일 한 변형을 허용³. 더욱이, 고정된 조직은 양극성 세포 모양을 유도하고, 세포는 이소성 견인을 촉진하는 힘 선을 따라 신장에 의해 조직력에 적응합니다^{31,32,33,34,35,36}. 우리는 이전에 기능적인 긴장 긴장 실험에 있는 단 하나 뻣뻣한 극의 주위에 쥐와 인간 적인 심장 섬유아세포 (CF)에서 고리 모양 ECT를 적용하고 바이러스성 으로 변환된 섬유아세포를 사용하여 기능 연구의 이득 그리고 손실을 수행했습니다^24,25,26 약리학 연구³⁷. 추가, 우리는 ECT 모형에 있는 CF 매개한 섬유증에 있는 성다름을 확인할 수 있었습니다²⁷.

상용 벤더( 자료 표 참조)에서 극저온 보존 CF로 획득한 1차 인간 CF로 본보기인 인간 ECT 생성을 위한 다음 프로토콜은 링 형 조직의 장점을 병렬 고콘텐츠 테스트를 위해 설계된 48웰 플랫폼을 위한 거시적 조직을 쉽게 생성하는 방법과 결합합니다.

중요한 것은, ECT 모형은 그밖 섬유아세포, 예를 들면, 피부 섬유아세포^38,39의 조사에서 문서화된 사용과 함께 특정 섬유아세포 모형에 제한되지 않습니다. 더욱이, 환자의 생검에서 섬유아세포는 동등하게 잘 작동하고, 섬유아세포의 선택은 궁극적으로 해결될 과학적 질문에 달려 있습니다.

본 프로토콜에 기재된 ECT의 생성에 사용되는 플랫폼은 시판되는 48웰 3D 세포/조직 배양 플레이트(도 1A)이다. 48웰 플레이트의 도움으로 정의된 형상 및 기계적 부하하에서 ECT 형성 및 기능을 제조, 배양 및 모니터링하는 방법이 설명되어 있습니다. 형성된 ECT는 통합된 플렉시블 폴에 의해 유지되며, 기계적 하중은 서로 다른 경도(Shore A 값 36-89)를 사용하여 최종 목적에 따라 미세 조정될 수 있으며, 굽힘 강성에 영향을 가합니다. 해안A 값이 46인 폴을 추천합니다. 또한 이 프로토콜은 이전에 설명된 사용자 지정 원형 몰드와 호환되며, 여기서 ECT는 단일 뻣뻣한 ^rod37 주위에 유지된다. 이 금형의 치수는 그림 1B에 부여됩니다.

그림 1: 주조 금형의 회로도 표현. (A) 두 개의 유연한 기둥이 있는 주조 금형의 기술 도면 및 치수. 금형은 금형의 본체에서 이중 옹열극을 고정하는 짧은 벽에 의해 구분된 내부 둘레로 구성됩니다. 유연한 기둥은 서로 자유로운 수평 거리를 가지며 베이스에 연결되어 있습니다. 금형은 180 μL 주조 부피를 허용합니다. 각 금형의 우물은 배양 매체의 최소 600 μL의 부피 용량을 허용합니다. 다른 재료 조성물은 특정 강성을 가진 극을 생성하는 데 사용할 수 있습니다 (예를 들어, TM5MED-TM9MED). (B) 하나의 딱딱한 막대가 있는 링 모양의 금형의 기술 도면 및 치수. 이것은 ECT 주조 프로토콜³⁷과 함께 사용할 수있는 뚜렷한 형상 및 기계적 환경을 가진 대체 금형입니다. 링 모양의 금형 조립 방법은 게시된 더 큰 형식^28,41에서 적용되었습니다. 간단히 말해서, 이 방법은 (1) 폴리테트라플루오로틸렌(PTFE) 성형 스페이서(직경 8mm)를 폴리디메틸실록산(PDMS, 실리콘)으로 유리 접시(직경 60mm)로 부은, (2) PDMS 폴 홀더(1.5mm 직경)를 중앙에 고정하는 등(3mm)의 직경을 유지한다. 중공 공간 결과물은 180μL의 주조 부피를 허용합니다. 각 유리 접시는 여러 각각 금형 (예시 적으로 5 금형으로 표시)을 결합 할 수 있으며 배양 매체의 최대 5 mL에 대한 용량을 가지고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

모든 단계는 봉쇄 수준 1 의 실험실에 설치된 클래스 II 생물 안전 후드에서 수행해야합니다. 바이러스 매개 유전자 전달과 같이 수행되는 현지 규정 및 조작 유형에 따라, 봉쇄 수준은 생물안전 수준 2 또는 3으로 증가되어야 한다. 모든 배양은 공기 중 5% _CO2 의 가습된 대기를 가진 세포 배양 인큐베이터에서 37°C로 유지된다. 볼륨(1단계 및 2단계)은 T75 세포 배양 플라스크에 대해 제공됩니다. 표준 세포 배양 권고에 따라 볼륨을 상이한 배양 형식으로 조정합니다.

1. 단층 배양을 위한 해동 및 사전 도금 1차 심장 섬유아세포(CF) (5-12일)

참고: 대안으로, HFF-1 세포는 공급자에 의해 권고된 표준 하위 배양 프로토콜에 따라 사용될 수 있습니다.

1. 제조 업체의 지침에 따라 섬유 아 세포 성장 매체 (FGM)를 준비 합니다. 선택적으로, 100 U/mL 페니실린 및 100 mg/mL 연쇄상 구균과 같은 항생제를 추가하십시오. 사용하기 전에 모든 구성 요소를 완벽하게 혼합할 수 있습니다. 최대 14일 동안 4°C에 보관하십시오.
2. 20-25 °C에 따뜻한 FGM.
3. 냉동 보존 CF (이상적으로 1 x ¹⁰⁶ 내지 2 x ¹⁰⁶/mL 세포를 극저온 당 함유) 약 2 분 동안 37 °C에서 수조에서 소량의 얼음만 바이알에 남을 때까지 해동하십시오.
4. 2mL 세로지학적 파이펫을 사용하여, 세포 현탁액을 10mL의 FGM을 포함하는 적절한 멸균 원심분리기 튜브로 드롭방향으로 전달한다. 최적의 세포 검색을 위해 1mL의 FGM으로 극저온을 헹구고 원심분리기 튜브로 옮김하십시오. 이 단계에서 세포가 매우 민감하기 때문에 전단 응력에 의한 세포 손상을 최소화하기 위해 보어 팁이있는 혈청 파이프를 사용하여 다시 중단하십시오.
   참고: 냉동 보존 매체에 높은 비율의 DMSO가 포함되어 있는 경우 FGM에서 세포 회수 후 DMSO 함량이 1% 미만이되도록 합니다. 대안적으로, 중간 교환을 위해 20-25°C에서 5분 동안 300 x g 에서 재중단된 세포를 원심분리한다. 그런 다음, 주체를 주의 깊게 흡인시키고, 튜브를 소용돌이하여 펠릿 세포를 빼내고, 시드를 위해 원하는 FGM 부피로 재보종한다.
5. 종자 0.5 x ¹⁰⁶ 세포FGM의 12 mL에서 T75 세포 배양 플라스크로. 다른 labware를 사용하는 경우 셀 수를 조정하여 6.7 x ¹⁰³/^cm2의 파종 밀도를 유지합니다.
6. 5 일 동안 또는 세포가 80 %의 합류에 도달 할 때까지 매일 FGM을 교체하십시오.
   참고: 확장 후 세포 수율은 주로 세포 크기와 증식속도에 따라 달라지며, 이는 세포 기증자 간에 다를 수 있습니다. 전형적으로, 이 표준 배양 절차는 배양 5일 후에 T75 세포 배양 플라스크에서 4 x ¹⁰⁶ 에서 5 x ¹⁰⁶ CF의 검색을 허용합니다.

2. 인간 CF의 효소 분산 (10-20 분)

참고: 이 단계는 하위 배양 단층 세포와 ECT의 준비 모두에 대한 인간 CF의 단일 세포 현탁액을 설정하는 것을 목표로합니다. 이 프로토콜은 3-4 구절에서 인간 CF 단층 배양에 최적화되었습니다. 최적의 표준화를 위해 ECT 준비 전에 적어도 한 번은 단층의 하위 배양 CF를 권장합니다. 이 프로토콜은 다른 기증자 및 공급업체에서 유래한 섬유아세포에 최적화되어야 합니다. 대체 분리 프로토콜은 재조합 세린 프로테아제 기반 해리 시약, 예를 들어, 프로테오리틱 및 콜라주용 효소를 함유하는 분과 교체하는 것을 포함할 수 있다.

1. 따뜻한 FGM, PBS (^{Ca2 +}/^Mg2+-무료), 및 세포 해리 시약20-25°C.
2. 배양된 세포로부터 배지를 흡인한다.
3. PBS와 흡인의 6mL로 셀을 씻으세요.
4. 세포 해리 시약의 6mL을 세포에 넣고 세포가 눈에 띄게 분리될 때까지 20-25°C에서 3분 동안 배양한다.
   참고: CF 소스에 따라 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. 또는, 세포가 실온에서 분리되지 않으면 효소의 활성을 개선하기 위해 37 °C에서 배양하십시오. 최적의 세포 생존가능성을 보장하기 위해 현미경으로 세포 분리를 모니터링합니다.
5. 세포 해리 시약내의 빠진 세포에 FGM의 6-12 mL을 추가하여 효소 활성을 중화한다. 10mL 세로지컬 파이펫을 사용하여 4-8회 위아래로 부드럽게 파이펫을 사용하여 단일 셀 서스펜션을 보장하고 세포를 신선한 50mL 수집 튜브로 이송합니다. 제조업체의 지침에 따라 현미경 및 혈전계 또는 자동화 된 세포 카운터의 도움으로 수율을 확인하십시오.
6. 20-25°C에서 5분 동안 300 x g 의 세포 현탁액을 원심분리합니다.
   참고: 원하는 양의 ECT 생성에 충분한 세포의 수율에 도달하기 위해, 세포는 추가 확장을 위해 최대 1:6 희석으로 하위 배양될 수 있다. 세포가 80 %의 합류에 도달 할 때까지 성장하게 (약 5-6 일), 매체는 격일로 변경. 그런 다음 효소 분산을 반복하고 2.7 단계를 진행합니다. ECT 준비를 계속할 수 있습니다.
7. 슈퍼 네티퍼를 흡인하고 펠릿을 빼내기 위해 튜브를 쓸어 넘깁니다. fGM에서 세포를 20-25°C에서 재중단하여 ≥ 15 x ¹⁰⁶/mL의 세포 현탁액을 얻습니다(단계 3.3.에 필요한 것보다 약 40% 더 많은 세포). 이것은 다음 단계에서 긴장으로 인한 세포 손실을 설명합니다.
8. 40 μm 메쉬 셀 스트레이너를 통해 셀 서스펜션을 변형시보세요.
   주의: 세포 응집제는 ECT의 최적 형성에 해롭습니다. ECT를 직접 캐스팅하기 위한 인간 CF 프로토콜의 효소 분산을 사용하는 경우, 세포 현탁액을 긴장하면 동질 조직 형성을 방해하는 주요 세포 덩어리가 없는지 확인합니다. 이질성은 신뢰할 수 있는 스트레스 변형 분석을 손상시킬 것입니다.
9. 세포 수를 재검표하고 eCT 준비를 진행하기 위해 ≥80%의 생존력을 가진 현탁액에서 신뢰할 수 있는 세포 수를 보장하기 위해 세포 생존가능성을 평가한다.
   1. 자동화된 셀 카운터를 사용하여 전류 제외에 의해 셀 수와 생존 가능성을 평가합니다.
   2. 대안적으로, 트라이판 블루(발암물질, 위험 범주 2- 예방 조치) 염료 배제 시험을 사용하여 현미경및 헤모세포계를 사용하여 살아있는 직접 식별 및 열거(염료를 배제하는 그대로 세포막) 및 죽은(염료내 단백질의 결합을 허용하는 손상된 세포막)을 사용한다.
10. 20-25°C에서 셀 서스펜션으로 수집 튜브를 예약하고 3단계로 즉시 진행합니다.

3. ECT 준비 (1 시간)

참고: ECT 생성에 대한 회로도 개요는 도 2에 설명되어 있습니다.

그림 2: ECT 생성에 대한 회로도 개요입니다. 섬유아세포는 ECT 생성에 사용하기 전에 2D 배양으로 확장됩니다. 5-10일 후, 세포는 효소적으로 분산되고 세포 현탁액은 소 콜라겐 유형 1을 포함하는 완충 혼합물로 재구성된다. 세포 콜라겐 하이드로겔 혼합물은 정의된 길이와 부하에서 ECT 서스펜션을 가능하게 하기 위해 두 개의 유연한 기둥이 있는 주조 금형으로 설계된 3D 엔지니어링 조직 배양을 위한 48웰 플레이트에서 개별 우물로 피펫처리됩니다. ECT는 일반적으로 측정 하기 전에 1 ~ 20 일 동안 배양. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. DMEM 분말을 _ddH2O( 재료표에 지정된 제형용 134 mg/mL)로 용해하여 1시간 동안 37°C의 일정한 회전하에 DMEM 스톡 용액을 준비한다. 여과에 의해 살균. 재고는 최대 12개월 동안 4°C 또는 -20°C에서 최대 14일 동안 안정적입니다.
2. 10배 DMEM 스톡 솔루션을 희석하고 멸균 _ddH2O에 20% (v/v) FCS를 추가하여 2배 DMEM을 신선하게 준비합니다. 피펫팅 볼륨에 대한 표 1 을 참조하십시오. 재고는 4 °C에서 최대 14 일 동안 안정적입니다.
   참고: 3.1단계를 수행합니다. 및 3.2. ECT의 준비를 위해 세포의 효소 분산(step 2.)을 시작하기 전에.

표 1: 2배 DMEM 구성.

주의: 세포 콜라겐 하이드로겔 혼합물 및 원심분리관의 모든 성분은 사용하기 전에 얼음 위에 보관해야 합니다. 이것은 주조 금형 전체에 세포 콜라겐 하이드로겔 혼합물을 분배하기 전에 콜라겐 자체 조립이 발생하는 것을 방지하는 데 도움이 될 것입니다.

3. 표 2에 기초하여, 2.10단계로부터 세포 현탁액에 20-25°C에서 FGM을 추가하여 세포 현탁액을 8.88 x ¹⁰⁶ 셀/mL의 밀도로 조절한다. 그런 다음 셀 서스펜션이 있는 수집 튜브를 얼음으로 이동합니다.
4. ECT 하이드로겔 혼합물을 준비하려면 얼음 위에 50mL 원심분리기 튜브를 미리 식히고 표 2 에 나열된 다른 구성 요소를 다음 순서로 추가하여 기포 형성을 피한다.
   참고: 준비해야 할 최대 ECT 수는 2.9단계에서 결정된 총 세포 수에 따라 달라집니다. ECT 당 콜라겐의 0.3 mg을 사용 하 여, 6-7 mg/mL를 포함 하는 주식 솔루션에서 얻은. 콜라겐 스톡 솔루션의 농도는 최적의 ECT 콜라겐 함량을 얻는 데 필요한 부피를 결정합니다. 다른 ECT 하이드로겔 성분의 부피는 그에 따라 적응되어야 한다. 6.49 mg/mL의 콜라겐 스톡 솔루션에 따라 조정된 볼륨에 대한 표 2 를 참조하십시오. 표 2 에 설명된 볼륨은 이 프로토콜에서 모범적인 지침으로 사용됩니다.
   1. 넓은 보어 팁이 있는 혈청피펫을 사용하여 산 용해성 콜라겐 타입 1 하이드로겔을 피펫.
   2. 2x DMEM을 추가하여 튜브를 부드럽게 혼합하여 콜라겐 용액의 소금 함량을 조정합니다.
   3. 튜브를 소용돌이치면서 부드럽게 혼합하면서 0.2 M NaOH를 추가하여 pH를 중화시합니다. 페놀 레드 인디케이터는 노란색에서 빨간색으로 바뀝니다.
      참고: 최적의 pH 중화를 위해 각 개별 콜라겐 배치에 대해 NaOH 볼륨을 적정화해야 합니다. 중화는 완충유형 및 제제, 절대 콜라겐 농도 등의 요인에 따라 달라지며 콜라겐 매트릭스 조립 및 세포 생존에 영향을 미친다^23,40. DMEM의 첨가에 의해 이온 함량이 증가하고 pH가 중화되면 콜라겐의 자체 조립이 이어지므로 중단되어서는 안됩니다. 따라서 휴식 없이 다음을 신속히 수행합니다.
   4. 튜브를 부드럽게 혼합하면서 셀 서스펜션(3.3단계에서)을 드롭와이즈로 추가합니다.

표 2: ECT 하이드로겔 의 준비 (파이펫 팅 오류에 대한 10 % 잉여 회계 포함).

5. 거품 형성을 피하고 전단 응력최소화를 위해 넓은 보어 팁이 있는 세로지학적 파이펫을 사용하여 한 번만 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 전체 서스펜션을 혼합합니다. 튜브를 10번 부드럽게 소용돌이치면 완전한 혼합물을 보장하고 주조 과정 전반에 걸쳐 얼음에 ECT 하이드로겔 혼합물을 함유한 50mL 원심분리기 튜브를 유지합니다.
6. ECT 하이드로겔 혼합물로 1mL 파이펫 팁을 미리 적시하고 콜라겐 매트릭스 조립의 무결성에 영향을 미칠 수 있는 과도한 전단 력을 피하고 전체 플레이트가 15-20분 안에 수행되도록 48웰 주조 플레이트의 각 금형에 180 μL을 균등하게 분배합니다.
   참고: 권장 주조 부피는 180 μL이지만 200 ^μL38로 확장할 수 있습니다. 따라서, 바람직한 경우 , 표 2 의 부피가 세포와 콜라겐 사이의 농도와 비율을 동일하게 유지하는 방식으로 200 μL에 적응될 수 있다.
   1. 금형 내에서 전체 루프가 형성되었는지 확인합니다(그림 3A). ECT 하이드로겔 혼합물이 지속적으로 적용되면 완전한 ECT 링 형성이 방지됩니다(도 3B).
   2. 균일하고 기능적인 조직 형성을 보장하기 위해 내부 우물(도 3C)과 파이펫팅(도 3D) 중 기포 형성을 피하십시오.

그림 3: 주조, 하이드로겔 형성 및 ECT 응축을 다중 웰 형식으로 합니다. 상단 패널은 주조 직후 ECT의 모양을 예시합니다. 중간 패널은 37 °C에서 20 분 동안 잠복 후 ECT의 모양을 예시합니다. 하단 패널은 제조 후 ECT 24 h의 압축 상태를 예시하며 극에서 제거됩니다. (A) 적절한 ECT 형성을 방지하는 파이펫 팅 오류의 첫 번째 24 시간 (B-D) 동안 두 극 사이의 적절한 ECT 형성. 흰색과 검은색 화살표는 부적절한 주조로 인해 ECT의 구조적 결함을 가리킵니다. 규모 표시줄: 5mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

7. 세포 배양 배양 인큐베이터 내부에 48웰 주조 판을 조심스럽게 배치하고 ECT 하이드로겔 혼합물을 15-30분 동안 재구성하게 한다. 잠복 후 젤과 같은 불투명하게 나타납니다 (그림 3, 중간 패널).
8. 이 조직 중단을 초래할 수 있기 때문에 배양 배지를 성형 ECT에 직접 피펫하지 않고, 우물 당 37 °C 의 600 μL을 추가합니다. 이 시점에서와 같이 우물 벽을 따라 배양 매체를 부드럽게 추가하면 ECT도 바닥에서 분리해서는 안됩니다(그림 4).

그림 4: 갓 캐스팅된 ECT에 문화 매체를 적절하고 부적절하게 추가합니다. (A) 초기 ECT 응고 후 배양 배지를 추가하는 동안(주조 후 20분), 응축 ECT는 웰의 바닥에 방해받지 않고 남겨두어야 한다. 다음 24시간 동안 셀 구동 매트릭스 다짐은 ECT가 경사로위로 밀어 올 것이다. 최종 ECT 위치는 정의된 극 높이의 오목한 충치에 의해 제어됩니다. 이렇게 하면 모든 ECT가 동일한 위치에 정착하여 병렬 ECT 배양에서 극 굽힘 활동을 비교할 수 있습니다. (B) 배양 배지를 너무 빠르게 추가하면서 바닥에서 분리된 ECT를 형성한다. 부동 ECT는 상부 배양 매체 수준에서 컴팩트합니다. ECT가 다른 위치에 정착하는 경우 극 수축 세력은 직접 비교할 수 없습니다. 스케일 바: 2mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

9. 24 시간 동안 배양하십시오.
10. 그 후 매일 배지를 500 μL의 FGM으로 교체하여 분석할 때까지 교체하십시오.
    참고: 세포 독립적 겔화의 초기 단계 후, 인간 CF는 ECT 하이드로겔 혼합물을 더욱 압축하기 시작합니다. 24시간 이내에 ECT는 플렉시블 폴에서 개최되는 수준으로 압축및 상승하는 것으로 나타났습니다(그림 3 및 도 4A).

4. 단면 영역 (CSA)을 측정하여 ECT 다짐을 평가합니다 (ECT 당 5 분).

참고: 조직 압축은 콜라겐 조립 직후에 시작되며 첫 번째 시간 동안 특히 중요합니다. 다짐은 주로 조직의 긴 축에 수직으로 매트릭스의 세포 구동 압축에 의해 트리거 변화를 설명합니다. 이 매개 변수는 ECT의 단면 영역(CSA)을 결정하여 평가됩니다.

1. 원하는 시점에서 스테레오 현미경을 사용하여 ECT의 상단 및 측면 뷰의 거시적 이미지를 기록합니다(그림 5C).
   참고 : ECT는 48 웰 캐스팅 플레이트의 배양 우물 내부를 이미지 할 수 있습니다. 또는, 이미징을 위한 명확한 바닥 멀티 웰 플레이트로 ECT를 전송합니다. 그 전하의 손실로 이끌어 내는 것을 제거하는 것과 같이 극에 ECT를 심상하는 것이 좋습니다, 그리고 결과적으로, 짧은 기간 안에, 조직은 치수의 분석을 위한 적당한 화상 진찰을 방해할 수 있는 긴장 방출 때문에 최종 비틀림으로 추가 계약할 수 있습니다.
2. 이미지 처리 프로그램을 사용하여 라인 스캔 분석을 수행합니다. 배율을 설정하고 직선 도구를 사용하여 각 이미징 평면에서 암당 최소 6개의 위치에서 ECT 직경을 추적하고 측정합니다(그림 5B, C).
3. 위쪽 뷰 평면에서 평균 직경을 계산하고 타원형 영역 방정식에 따라 CSA를 계산합니다.
   

그림 5: CSA(단면 영역) 분석을 통해 시간이 지남에 따라 ECT 압축을 모니터링합니다. ECT는 인간 CF 및 콜라겐 타입 I를 사용하여 생성되었고 5일 동안 2개의 유연한 극 주위로 배양되었다. (A) 5일 동안 유연한 금형에 배치된 제어 ECT의 대표적인 이미지가 제시된다. 스케일 바 = 5mm. 이러한 밝은 필드 이미지는 또한 조직 수축을 추정하기 위한 극 편향 변이를 결정하기 위하여 이용될 수 있습니다. (B) ECT의 단면 면적의 회로도 표현(녹색 및 측면 뷰 직경의 상단 뷰 직경 은 분홍색). (C) 이미지 처리 프로그램을 사용하여 조직의 직경의 계체 스캔 분석의 스테레오 현미경 및 통신 예로 얻은 ECT의 상부 및 측면 뷰의 매크로 이미지. 스케일 바 = 2mm. 평균 직경은 각 뷰 계획에서 측정된 모든 선 길이의 평균에서 계산됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. 극 편향 분석에 의한 ECT 수축 모니터링(48웰 주조 플레이트당 15분).

참고: ECT 배양은 일반적으로 5일 동안 수행되지만 적어도 20일까지 연장될 수 있습니다. 극 편향은 조직의 긴 축을 따라 장력 방향으로 세포 수축력에 의해 구동되는 조직 수축으로 인해 발생합니다. ECT 수축의 평가는 문화 기간 동안 어느 날에이미징에 의해 수행될 수 있다.

1. 고해상도(≥ 5메가픽셀) 흑백 이미지 센서가 장착된 통합 영역 스캔 카메라가 고정 된 거리에 배치된 레코딩 장치 아래에서 48웰 주조 플레이트를 이미지합니다.
   1. 거의 UV(~390nm) 광원을 사용하여 콘트라스트를 최대화하고 형광염(그림 6A, C)을 함유하고 있어 극의 팁을 자동으로 감지할 수 있습니다. 사용 가능한 경우 이미지 왜곡을 최소화하므로 이미징에 텔레센트릭 렌즈를 권장합니다.
      참고: 대안적으로, 단일 우물또는 스케일 바가 포함된 전체 플레이트의 거시적인 밝은 필드 이미지가 해석에 사용될 수 있다(그림 5A).
2. 어두운 배경에서 고대비 밝은 픽셀을 감지할 수 있는 소프트웨어에서 녹화된 이미지를 실행하여 이미지 처리 프로그램 또는 자동화된 분석을 사용하여 일일 레코드(그림 6C,D)의 극 사이의 거리를 측정합니다.
3. 0일의 초기 거리와 비교할 때 극의 거리 변화를 통해 극 편향을 계산합니다.

도 6: 극 편향에 따른 조직 수축 의 평가에 대한 회로도 개요. (A) 거의 UV 광 여기 아래 48웰 주조 판에서 형광극의 예시고해상도 기록. 이 방법은 보다 정확한 극 팁 자동 추적을 위해 밝은 필드 사진보다 선호됩니다. (B) 회로도도는 ECT 다짐과 수축이 극 굽힘으로 이어지는 방법을 보여줍니다. (C) 주조 후 0일 및 5일째에 동일한 플레이트 기록의 예시적인 행. D. 클로즈업은 이미지 프로세싱 프로그램을 사용하여 극 사이의 거리(분홍색 선)를 측정하는 방법을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

참고: 밝은 팁 이미지로 측정된 극 편향은 이미징 평면의 차이로 인한 조직 수축의 추정일 뿐이라는 점을 고려하십시오. 또한 조직 배양 시 TGF-β1과 같은 섬유질 물질을 적용하면 ECT 다짐과 수축이 향상되고 궁극적으로 초기 조직 중단으로 이어질 수 있습니다.

6. 파괴적인 인장 측정 및 응력 변형 분석에 의한 ECT의 강성 및 기타 생체 역학적 특성 평가(ECT 당 20분)

참고: 최적의 응력-변형 곡선은 발가락 영역, 탄성 영역 및 플라스틱 영역의 세 가지 영역을 표시할 수 있습니다. ECT 응력-변형 곡선 예제는 도 7에 도시되어 있다. 응력-스트레인 커브를 분석하면 강성, 최대 강도, 탄력성, 가소성, 확장성, 탄력성 및 인성과 같은 조직의 중요한 생체 역학 적 파라미터를 추출할 수 있습니다.

1. 먼저 집게를 사용하여 ECT를 포함한 들것을 우물에서 당겨 서 ECT를 수확하십시오. 그런 다음 들것을 베이스에 보관할 수 있으며, ECT는 미세한 후크 또는 파이펫 팁을 사용하여 들것 팁 위로 미끄러졌습니다.
2. ECT를 고정된 팔과 트랜스듀서 암에 고정된 2개의 후크로 옮기고 PBS(도 7A)로 채워진 37°C 강화 장기 목욕(custom-made)을 장착한 확장동적 기계적 해석(DMA) 류미터의 트랜스듀서 암에 전달한다.

그림 7: ECT 파괴적인 인장 측정 분석. (A) 확장 동적 기계적 해석(DMA) 류미터의 유변학적 파괴 인장 측정. 상부 고전력 시야: 환경 챔버에 _L0 에 장착하고 응력 변형 분석을 위해 상하극에 연결한 후 ECT. 하단 고출력 뷰: ECT는 궁극적인 변형시 실패 지점까지 일정한 속도 0.03 mm/s로 긴장됩니다. 스케일 바 = 5mm. (B) 주요 측정 파라미터를 나타내는 ECT의 응력 변형 다이어그램. 탄성 영역의 상한은 수율 점에 대응하고 플라스틱 영역은 수율 점과 고장 점(덕트)사이에 구성된다. 탄성 영역의 선형 단계의 경사는 조직 강성을 반사하는 Young의 계수에 해당합니다. 최대 강도는 조직이 견딜 수있는 최대 인장 스트레스에 해당합니다. 섬유 미세 골절로 인해 조직이 실패 지점에 도달할 때까지 스트레스가 감소합니다. 이것은 조직의 파열로 인해 스트레스의 급격한 하락이 관찰되는 궁극적 인 변형 (확장성)에서 발생합니다. 탄력성은 영구 변형(yield point까지) 전에 조직에 흡수된 에너지(kJ/^m3)에 대응하며, 항복점 균주까지 곡선(AUC) 아래 영역에 의해 주어진다. 인성은 조직이 파열 될 때까지 흡수 할 수있는 총 에너지 (kJ / ^m3)에 해당하며 궁극적 인 균주까지 AUC에 의해 주어집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 레오미터를 설정하여 초당 후크 사이의 초기 거리의 약 1 %의 일정한 선형 속도로 동축 장력을 적용합니다. 0.03 mm/s의 일정한 스트레칭 속도는 일반적인 ECT 치수와 함께 사용할 수 있습니다. 트랜스듀서를 타러, ECT 파열 지점까지 스트레치 및 기록을 시작합니다.
   주의: CSA가 데이터 정규화에 필요하므로 ECT(단계 4.1)의 매크로 픽처 픽처 픽처픽 사진은 인장 테스트 전에 기록되어야 합니다.
   참고: CSA 계산을 포함한 스트레스 변형 분석은 인장 테스트 시 나중에 처리할 수 있습니다. 데이터를 분석하기 위해 스프레드시트 소프트웨어와 통계 분석 소프트웨어를 사용합니다.
4. CsA(^mm2)에 의해 ECT당 측정된 힘 값(mN)을 정규화하여 응력 값(kPa)을 얻습니다.
5. XY 그래프에서 변형에 대한 응력 값(상부 및 하부 후크 사이의 상대적 거리에 의해 주어진 조직 변형의 기하학적 측정)에 대해 플롯합니다.
   참고: 스트레치가 계속되기 직전에 조직의 초기 길이(상부 및 하부 후크 사이의 거리)는 수동으로 조정되어야 하며 발가락 영역의 시작부분에 대응해야 합니다(조직 특성에 따라 발가락 영역이 없을 수 있음). 각 스트레인 포인트 값은 _Ltotal이 모든 측정 지점에서 총 간격인 방정식에 따라 계산되어야 합니다.
   
   데이터를 플로팅할 때 선택한 _L0 의 응력 값을 배경 빼기에 사용합니다.
6. 응력-변형 곡선에서 다른 생체 역학 파라미터를 결정합니다( 그림 7B 를 예로 사용).
   참고: 응력-변형 곡선은 발가락, 탄성 및 플라스틱 영역의 세 가지 영역을 표시할 수 있습니다. 탄성 영역의 상한은 조직이 미세 골절을 시작하기 전에 수율 점에 해당하며, 그 균주는 조직 탄성의 척도이다. 플라스틱 영역은 수율 점과 실패 지점 사이에 구성됩니다. 나중에 점은 조직의 파열로 인한 스트레스의 급격한 하락에 해당하며, 조직 확장성을 측정하는 궁극적 인 얼룩을 정의합니다. 세 번째 측정 점은 조직이 스트레치 중에 깨지지 않고 견딜 수있는 가장 높은 스트레스에 의해 정의되는 최대 강도에 해당합니다. 곡선 아래 영역에 의해 주어진 탄력성과 인성은 각각 수율 지점및 실패 지점까지 조직에 의해 흡수되는 에너지에 해당한다. 각 획득 된 곡선에 대해, 탄성 영역의 선형 부분의 경사는 탄성 계수라고도 하는 Young의 계수에 해당하며 조직의 강성을 측정하는 기계적 특성입니다.
   1. 각 곡선에서 출력지점, 실패점 및 최대 응력 점의 XY 값(각각 변형 및 응력)을 추출합니다.
   2. 해당 영역의 선형 회귀를 플로팅하여 탄성 영역의 선형 부분의 경사에서 각 ECT의 영의 계수를 평가한다.
   3. 통계 프로그램을 사용하여 곡선(AUC) 아래 영역을 계산하여 각각 수율 점과 실패 지점까지 복원력과 인성을 모두 결정합니다. 사다리꼴 방법에 의해 AUC를 계산합니다. 기준선을 0으로 설정하고 최소값에서 Y축의 최대 값까지 의 거리의 10% 이상인 기준선 위의 피크만 고려합니다.
      참고: 탄력성과 인성의 계수는 σ 스트레스(kPa)이고 ε 변형(L/_ΔL, mm/mm)인 σ × ε 의해 제공됩니다. 따라서, 탄력성과 인성은 kJ/^m3의 에너지(kPa=kN·^m-2 = kN·^m-3=kJ/m·m·^m-3=kJ/^m3)의 에너지가 영구변형 전과 파열전까지 각각 조직에 흡수된다.

ECT는 처음 24시간 내에 초기 세포 콜라겐 하이드로겔 부피에 비해 약 95%의 다짐에 도달한다. 제어 조건하에서 조직 압축 및 수축은 주조 후 몇 시간 동안 계속되며 특히 5일째까지 증가합니다(그림 5A). 극 편향은 다음 15 일 동안 더 증가 할 수 있습니다 (20 일 은 가장 긴 시간 테스트했다). 극 편향의 크기는 세포 유형, 세포 상태 및 세포 및 조직 배양 조건에 따라 달라집니다. 전형적으로, 생체역학적 특성은 배양 5일째에 측정되지만, 언제든지 선택할 수 있다. ECT 모델의 적용 가능성의 예로, 이 프로토콜이 조직 기능에 대한 액틴 세포골격 무결성의 영향을 연구하는 데 어떻게 도움이 되는지 를 보여 주었습니다. ECT는 48웰 주조 플레이트에서 제조되었고 액틴 중합 억제제 라트룬쿨린 A(Lat-A, 7 ng/mL)로 처리하였다. 처리는 대조군에 비해 CSA에서 1.7 배의 유의한 증가에 의해 표시된 ECT 다짐을 감소 (도 8A, B). 더욱이, 조직의 수축은 문화의 5 일 동안 평가되었다. 약물이 없을 경우 수축이 점차 5일째까지 증가하여 ~40% 수축에 도달했습니다. Lat-A는 영향을 받는 조직 수축으로 인해 최대 수축이 ~20%에 불과합니다(그림 8A,C). 파괴적인 단방향 스트레스-스트레인 테스트는 5일째에 수행되었다. ECT(도 7B)를 위해 수득된 것과 같은 일반적인 응력-변형 곡선에서, 몇몇 생체역학파라미터를 추출할 수 있다. 예시적으로, 액틴 중합화의 억제가 대조군(도 8D)에 비해 조직 강성에 있는 ~50%의 현저한 감소를 주도한 것으로 나타났다. 종합하면, 모범적인 데이터는 액틴 시토켈레탈 무결성이 ECT 다짐, 수축 및 경직에 필수적이라는 것을 보여줍니다.

도 8: 액틴 중합의 억제는 ECT 다짐, 수축 및 강성에 영향을 미친다. 인간 CF 및 콜라겐 타입으로 생성된 ECT는 7 ng/mL 라틀라룬쿨린-A(Lat-A)의 부재 시 약 2개의 유연한 극을 배양하였다. (A) 5일 후 유연한 극에 배치된 제어 및 처리된 ECT의 대표적인 이미지가 표시됩니다. 스케일 바 = 2mm. (B) 단면 영역(CSA)은 거시적 이미지(n = 22)로부터 계산하였다. (C) 극 편향은 5일 동안 계산하였다. 값은 수단으로 ±SEM(n = 22)으로 제공됩니다. 중요한 변화는 여러 비교에 대한 던넷의 (*p<0.05 대 제어) 포스트 hoc 테스트와 2 방향 ANOVA에 의해 평가되었다. (D) 조직은 유변학적 파괴 인장 측정을 실시하였고 영의 변둘리는 스트레스 변형 분석(n=16)으로부터 회수되었다. (B 및 D) 상자는 하부 및 상부 사분위수를 나타냅니다. 각 상자의 수평 선은 각각 중앙값 CSA 및 강성을 나타냅니다. 각 그룹에 대한 수단은 +로 표시됩니다. 각 상자에서 확장되는 세로 선은 측정된 최소 값과 최대 값을 나타냅니다. B 와 D 의 중요한 변화는 짝을 이루지 않은 두 꼬리 학생의 t-test(*p<0.05)로 평가되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

GLS와 SL은 원고초안을 작성했습니다. 모든 저자는 프로토콜 개발에 기여하고 원고를 편집했습니다. TM, MT 및 WHZ는 myriamed GmbH. WHZ의 과학 고문입니다.