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방법 논문

생물 의학 및 생물 공학 연구를 위한 문어 생태계 구축

3K 조회수

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DOI:

10.3791/62705

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2021년 9월 22일

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1Department of Biomedical Engineering, Michigan State University, 2Neuroengineering division, The Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University, 3Biomedical Imaging division, The Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University, 4Department of Radiology, Michigan State University

이 논문에서

요약

문어의 독특한 생리 및 해부학 구조를 이해하면 생물 의학 연구에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 이 가이드는 이 종을 수용하기 위해 해양 환경을 설정하고 유지하는 방법을 보여 주며 문어의 신경계 해부학 및 기능을 시각화하기 위한 최첨단 이미징 및 분석 접근법을 포함합니다.

초록

생물 의학 연구에 있는 많은 발달은 다른 종에 있는 특정 기능을 지원하는 해부학과 세포 기계장치를 발견해서 영감을 받았습니다. 문어는 과학자들에게 신경 과학, 로봇 공학, 재생 의학 및 보철분야에 대한 새로운 통찰력을 제공한 뛰어난 동물 중 하나입니다. 이 종의 두족류에 대한 연구에는 프로젝트의 성공에 중요한 문어와 생태계모두에 복잡한 시설과 집중 치료가 필요합니다. 이 시스템은 동물에게 안전하고 깨끗한 환경을 제공하기 위해 여러 가지 기계적 및 생물학적 필터링 시스템이 필요합니다. 제어 시스템과 함께 시설을 장기적으로 효과적으로 운영하려면 특수 한 일상적인 유지 보수 및 청소가 필요합니다. 탱크의 풍경을 바꾸고, 다양한 먹이를 통합하고, 작업할 수 있는 도전적인 작업을 도입하여 이러한 지능형 동물에게 풍요로운 환경을 제공하는 것이 좋습니다. 우리의 결과는 MRI와 전신 자동 형광 화상 진찰뿐만 아니라 그들의 신경계를 더 잘 이해하기 위하여 행동 연구 결과를 포함합니다. 문어는 생물 의학 연구의 많은 분야에 영향을 미칠 수있는 독특한 생리학을 가지고. 지속 가능한 생태계를 제공하는 것은 고유한 역량을 발견하는 첫 번째 중요한 단계입니다.

서론

생물 의학 연구 및 생물 의학 공학의 새로운 개념은 종종 생물 종들이 환경 및 생리적 조건과 과제를 해결하기 위해 가지고 있는 특정 전략을 식별함으로써 영감을 받습니다. 예를 들어, 반딧불에 있는 형광 특성을 이해하면 다른 모델 유기체에서 세포 활성을 보고할 수 있는 새로운 형광 센서의 개발이 주도되었습니다1; 조류에서 빛에 의해 활성화 된 이온 채널을 식별 세포 및 측두성 특정 빛 기반-신경 변조의 개발을 주도 했다2,3,4,5; 지구의 자기장에 따라 탐색 유리 메기에서 단백질을 발견하는 것은 자기 기반 신경 변조의 발달로 이끌어 냈습니다6,7,8,9,10,11; Aplysia에서 사이펀 반사를 이해하는 것은 행동의 세포 기초를 이해하는 데 도움이되었습니다12,13,14.

연구원은 비 전통적인 실험실 종 보유 하는 생리 기능에 독특한 강점과 새로운 관점을 활용 하 여 현재 생명 공학 및 phylogenetic 도구 상자에 확장 계속. 연방 기관은 다양한 종에 수행 새로운 작업을 자금을 지원하여 연구의 이러한 라인을 지원하기 시작했다.

독특한 해부학 및 재생 능력뿐만 아니라 각 무기의 적응 제어, 매혹적인 생물학자와 엔지니어, 사회의 모든 부분에서 관객을 사로 잡는 동물의 한 속은 문어17입니다. 실제로, 문어의 생리학 및 행동의 많은 양상은 지난 수십 년 동안 연구되었습니다15,16,17,18,19,20,21,22,22,23,24,25,26 . 그러나 최근 분자 및 진화 생물학, 로봇 공학, 운동 기록, 이미징, 기계 학습 및 전기 생리학의 발전은 문어 생리학 및 행동과 관련된 발견을 가속화하고 혁신적인 생명 공학 전략으로 변환27,28,29,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39.

여기에서우리는 문어 축산을 설정하고 유지하는 방법을 설명, 이는 다른 배경, 과학적 관심사, 목표에서 과학자와 엔지니어에 관심과 관련이있을 것입니다. 그럼에도 불구 하 고, 우리의 결과 신경 과학 및 신경 공학 연구에 문어의 응용프로그램에 초점을 맞추고. 문어는 중앙 두뇌에 있는 4,500만 개의 뉴런, 광학 엽에 있는 1억 8천만 개의 뉴런, 그리고 8개의 축 코드 및 말초 신경리아에 있는 추가 3억 5천만 신경을 가진 고도로 발달된 신경계를 가지고 있습니다; 이에 비해 개는 비슷한 수의 뉴런과 고양이의 절반에 불과합니다40. 척추 신경계와는 달리, 문어의 뇌에 있는 뉴런의 수백만을 그들의 팔의 축 코드40,41,42에 있는 뉴런의 수백만에 연결하는 단지 32K efferent 및 140K 분포성 섬유가 있습니다. 이러한 비교적 소수의 상호 연결 섬유는 모터 프로그램의 실행을 위한 대부분의 세부 사항이 문어가 가지고 있는 고유하게 분산된 뉴런 제어를 강조하면서 축 코드 자체에서 수행된다는 것을 시사합니다. 문어의 팔에는 특별한 미세 모터 컨트롤이 있어 용기 안에 있더라도 항아리 뚜껑을 여는 것과 같은 조작 기술을 사용할 수 있습니다. 고도로 발달된 이 프리헨셀레 모터 기능은 세탈로포드(문어, 오징어 및 오징어)(43)의 클래스에 고유합니다.

실제로 수억 년의 진화를 통해 문어는 과학 및 공학 분야에서 새로운 발전과 발전에 영감을 주었던 놀랍고 정교한 게놈 및 생리 시스템을 개발했습니다43,44. 예를 들어, 문어의 빨판의 해부학적 구조를 기반으로 한 방수 접착제 패치는 습식 및 건식 표면에 충실할 수 있다45; 문어의 위장 피부에서 영감을 받은 합성 위장 소재로 평평한 2D 표면을 범프와 구덩이로 3차원 표면으로 변환할 수 있습니다. 미래에 신체 47 내부의 수술 도구로 사용될 수있는 소형 소프트 및 자율 로봇 (즉, Octobots); 탱크와 같은 로봇48에 부착된 팔(즉, OctoArm)도 개발되었다. 문어의 많은 종은 생물 의학 연구에 사용됩니다 예를 들어, 문어 저속한, 문어 시넨시스, 문어 바리아빌리스, 그리고 문어 bimaculoides (O. bimaculoides); O. 저속한 과 O. bimaculoides 는 가장 일반적인 34,49,50. 다른 문어 게놈의 최근 시퀀싱은 특정 관심의 이 속을 만들고 문어 연구에 새로운 국경을 엽니 다34,43,51,52.

우리의 설정에 사용되는 O. bimaculoides는 1949 년에 처음 발견 된 문어의 중간 크기의 종이며, 캘리포니아 중부에서 바하 캘리포니아 반도 17 의 남쪽에 있는 동북 태평양 연안의 얕은 바다에서 발견 될 수 있습니다. 그것은 눈 아래 맨틀에 거짓 안점에 의해 인식 될 수있다. 자이언트 퍼시픽 문어(엔테로토퍼스 도플리니)와 커먼 문어(O. vulgaris)와 비교했을 때, 캘리포니아 2점 문어(O. bimaculoides)의 크기는 비교적 작으며, 몇 센티미터보다 작아 서서히 빠르게 성장하고 있습니다. 실험실 내에서 제기 될 때, 성인 맨틀 크기는 100cm의 평균 크기로 성장할 수 있으며 800 g53,54까지 무게. 문어는 처음 200 일 이내에 급속한 성장 기간을 가지고; 그때까지, 그들은 성인으로 간주되며 평생 동안 계속 성장합니다555,56,57. 문어는 식인풍이 될 수 있습니다, 특히 두 남녀탱크 내에서 함께 보관될 때; 따라서 별도의 탱크58에 개별적으로 보관해야합니다.

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프로토콜

모든 동물 연구는 미시간 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.

1. 문어 탱크 장비 설정

  1. 첫째, 재료의 표에 표시된 바와 같이, 해양 환경 시스템에 통합 될 수족관에 대한 모든 비 생물학적 재료를 얻을. 크기는 인치로 제공됩니다.
  2. 설치 전에 모든 튜브, 배관 및 필터 시스템 부품을 70% 에탄올과 탈온화(DI) 물로 세척합니다. 청소 할 때 비누 나 다른 화학 물질을 사용하지 마십시오.
  3. 유리 섬유 테이블 13 인치 x 49 인치 x 1/2 인치 (부품 #71) 탄소 섬유로 만든 4 개의 테이블 다리와 2 인치 x 2 인치 x 23 인치 (Part #72)의 치수. 탁상 모서리 아래에 다리를 직접 부착합니다.
  4. 상단 표면 아래, 테이블 다리의 각 사이에, 배치 2 인치 x 2 인치 길이 (부품 #72) 테이블의 아래쪽에 부착 탄소 섬유 안정화 중괄호와 직접 상단 선반의 가장자리에. 테이블 아래 바닥에 직접 동일한 치수를 가진 다른 선반을 나사로 부착합니다. 펌프( 재료 표 참조)가 탱크가 상단 표면에 있는 동안 바닥 선반 표면에 직접 앉게 합니다. 이 시스템은 그림 1에 표시됩니다.
    참고: 탱크의 물 출력은 중력을 공급하고 탱크 안팎으로 공급하는 것을 제외한 모든 튜브는 최대 배수 헤드 압력을 보장하기 위해 탱크의 바닥보다 낮을 필요가 있습니다.

figure-protocol-1
그림 1: 문어 탱크 설정. 물 입구 및 콘센트 (a). 각각 1.22m x 0.3m(b)의 면적을 가진 3개의 문어 탱크. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 유리 절단 드릴 비트를 사용하여 탱크의 측면 중 하나에서 2 인치, 단일 13/4 인치 구멍을 드릴. 물 출력 흡입 화면의 바닥은 도 2a의 오른쪽에 표시된 바와 같이 출력 구멍의 고도를 결정합니다. 수위는 흡입 스크린에 의해 결정되며 탱크 상단에서 적어도 6 인치여야하여 물 튀김 구역이 필요합니다.
  2. PVC 프라이머와 시멘트를 사용하여 섹션을 영구적으로 연결합니다. 이렇게하려면 먼저 의도 된 남성 PVC 파이프의 끝을 여성 파이프의 끝으로 밀어 넣습니다. 프라이머와 시멘트가 파이프 바깥쪽에 표시되지 않도록 여전히 보이는 남성 부품의 외부에 화가 테이프조각을 놓습니다. 테이핑 후 부품을 분리하고 동일한 영역에서 시멘트를 적용 한 후 남성 파이프의 외부에 프라이머의 가벼운 코트를 배치합니다.
  3. 시멘트를 적용한 후 가능한 한 빨리 남성 파이프를 여성 파이프에 재장착하고 테이프를 제거합니다. 프라이머와 시멘트를 적용한 후 24시간, 새로 연결된 부품을 DI물로 씻어낸다. 경화 시간을 위해 시멘트 제품을 더 자세히 살펴보십시오.
    참고: PVC 프라이머와 시멘트를 사용하기 전에 모든 튜브 및 장비의 설치가 제대로 배치되었는지 확인하십시오. 파이프 길이 요구 사항은 다를 수 있습니다.
  4. 다음으로, 흡입 화면의 1인치 외부 직경(OD) 끝을 팔꿈치 관절의 1인치 내경(ID) 끝에 영구적으로 연결한다. 팔꿈치 관절의 끝을 직선 PVC 튜브(1인치 OD)에 연결합니다. 직선 튜브의 다른 쪽을 통해 벽 직선 어댑터 여성 소켓 연결의 1 인치 ID에 연결합니다.
    참고: ID는 파이프내부 벽 사이의 가장 넓은 거리를 나타냅니다. OD는 튜빙 폭의 외부를 말합니다.
  5. 스루 월 직선 어댑터를 직선 4인치 길이의 PVC 파이프에 1인치 OD(1.8단계부터)에 영구적으로 연결합니다. 이 파이프는 탱크에서 직면하게 될 것입니다.
  6. PVC 커넥터의 중앙에 직선 파이프를 영구적으로 연결합니다(1인치 ID 티 모양; 1.9단계에서). 다음으로, 영구적으로 두 개의 6 인치 길이 (부품 #69) 파이프 (1 인치 OD)를 티 커넥터-1의 반대쪽 끝 모두에 영구적으로 연결 하여 공기 방출을 위해 직접 위로 향하고 다른 하나는 물 흐름을 위해 직접 아래로 향합니다.
  7. 영구적으로 아래쪽 확장 직선 파이프 (단계 1.10에서) 여성 소켓 가시 파이프 (1 인치 ID) 직선 어댑터에 연결합니다. 가시 파이프 어댑터에 36인치 길이의 고무 튜브(3/4인치 ID)를 부착합니다.
  8. 냉각 시스템을 물 출력 튜브와 섬프 시스템 사이에 배치합니다.
  9. 시스템과 함께 제공되는 3/4 인치 바브 피팅을 냉각기 장치의 입력 및 출력 포트에 부착합니다. 냉각기의 입구 피팅에 고무 튜브 (1.11 단계부터)를 넣습니다.
  10. 도 2b에 표시된 대로 냉각기 출력(1.12단계에서)에서 3/4 인치 ID 튜브의 새 조각을 연결합니다.
  11. 다음으로, 도 2에 표시된 대로 4인치 x 12인치 양말 필터를 200 μm 크기의 모공 크기로 지정된 영역에 배치합니다. 또한 그림 2에 묘사된 바와 같이 단백질 스키머와 리턴 펌프를 적절한 부위에 배치합니다. 리턴 펌프와 함께 펌프 영역의 내부 벽에 자동 상단 오프 플로트 밸브를 부착하여 펌프 의 물 입구 상단 에서 2 인치 를 연결하십시오. 필요한 경우 펌프가 탱크에서 제거되는 것을 막지 마십시오.
  12. 12인치 길이의 직선 튜브(3/4인치 OD)를 펌프 콘센트(1.15단계부터)에 영구적으로 연결합니다. 3/4 인치 OD 직선 튜브의 다른 쪽 끝에, 영구적으로 3/4 인치 ID 45° 팔꿈치 관절에 튜브의 OD를 연결합니다. 관절의 다른 쪽 끝에 3/4 인치 OD 튜브를 영구적으로 연결합니다.
  13. 직선 튜브의 다른 쪽 끝(1.16단계부터)을 직선 감소 어댑터의 3/4 인치 ID에 부착합니다. 더 큰 어댑터 끝(2인치 OD)을 UV 광의 입력에 영구적으로 연결합니다.
    참고: 스트레이트 튜빙 길이는 다를 수 있습니다.
  14. 다음으로, UV 광 입구의 배치를 펌프의 출력 파이프(1.17 단계부터)와 일치하여 파이프가 빛과 펌프(1.15단계부터)사이에 구부러지지 않도록 합니다. UV 라이트 부착 구멍에 맞게 안정화 중괄호에 구멍을 뚫습니다. 나사 크기와 드릴 비트와 일치하고 주어진 나사를 사용하여 UV 광을 테이블에 부착합니다.
  15. 다른 감소 어댑터의 2인치 면을 UV 광출력(1.18단계에서)에 영구적으로 연결합니다. 어댑터의 1인치 ID에 5인치 길이의 직선 튜브1인치 OD를 부착합니다. 다음으로 90° 코너 피스와 1인치 ID를 1인치 OD 튜브에 연결합니다. 물 입력이 이동하도록 의도된 탱크의 측면을 가리키는 코너 조각의 부착되지 않은 끝이 있습니다(1.5단계와 같은 면).
  16. 모서리의 다른 쪽 끝(1.19단계부터)을 6인치 길이 튜브(Part #69)에 유량 제어 장치(Part #2)의 입력과 함께 1인치 OD를 갖는 경우 를 영구적으로 연결합니다. 다른 1인치 OD 튜브(Part #69)를 유량 모니터링 장치의 출력에 영구적으로 연결; 길이는 탱크의 측면을 넘어 적어도 3 인치를 확장해야합니다.
  17. 13/4 인치 유리 절단 드릴 비트 (부품 #1)를 사용하여, 의도 된 수로 위의 새로운 구멍 3 인치와 탱크의 측면에서 2 인치 (그림 1a) 물 출력 구멍이있는 것과 반대쪽. 탱크를 마주보고 있는 1인치 슬립(Part #77)이 있는 또 다른 스루 월 벌크헤드 피팅을 부착합니다.
  18. 격벽 슬립에 1 인치 OD와 4 인치 길이 (부품 #69)와 직선 튜브를 영구적으로 연결합니다. 이 튜브가 탱크에서 연장되는 거리에 맞게 1.21 단계의 마지막 부분에서 튜브를 줄입니다. 90° 튜브(Part #65)를 각 오픈 파이프에 영구적으로 연결하고 두 코너 조각을 영구적으로 연결하는 최종 1인치 OD 직선 튜브(Part #69)를 잘라냅니다.
    참고 : 그림 3 수족관 시스템의 간단한 표현을 보여줍니다.
  19. 제어 시스템의 나머지 부분(Part #34)을 설정하고, 먼저 전원 스트립(Part #53)을 테이블 자체 또는 인근 벽에 장착합니다. 그 옆에는 유체 모니터링 모듈(Part #2)이 장착되어 있습니다.
  20. 유량 센서, 파워 스트립 및 누출 감지 센서를 모듈에 연결합니다. 조류 쓰레기통에 부착된 성장 광(부품 #26)을 설정합니다(그림 2).
  21. 유량 센서, 자외선, 성장 광, 펌프 및 단백질 스키머를 에너지 바에 연결합니다. 제조업체 매뉴얼에 따라 수중 제어 시스템 프로그래밍을 설정합니다.
  22. 시판되는 소금 믹스 반 컵을 역삼투(RO) 또는 탈온화(DI) 물과 혼합하여 바닷물을 준비한다. 45 갤런을 만들어 탱크 한 대와 섬프 시스템을 완전히 채웁니다.
  23. sump 시스템 흐름 컨트롤러 내에서 펌프를 켜고 자동 상단 오프 밸브가 꺼져 있어 추가 담수가 필요하지 않은 때까지 바닷물을 계속 추가하십시오.
  24. 물이 가득 차면, 물을 채우는 것을 멈추고 냉각 장치를 켜서 18°C에서 22°C 사이의 온도를 설정하는 것이 바람직한 온도 범위53입니다. 단백질 스키머를 켭니다.
  25. 탱크 바닥에 30kg의 으깬 산호와 으깬 산호층을 조류 쓰레기통 바닥에 넣습니다. 여러 라이브 바위와 문어 환경에 다른 추가에 추가합니다. 탱크의 개구부를 덮기 위해 상단을 놓습니다.
    참고 : 살아있는 바위는 박테리아와 조류와 같은 거시적 인 해양 생물에 의해 살고있는 죽은 산호입니다.
  26. 포장에 지시된 바닷물 수족관에 사용되는 생분해균을 추가합니다. 물 테스트 키트, pH 센서 및 온도 센서를 통해 매일 온도, 염분, pH, 암모니아, 아질산염 및 질산염을 확인하여 지시대로 계속 추가하십시오. 암모니아, 아질산염 및 질산염 수준에 대한 안전한 값은 각각 0.5 ppm, 0.25 ppm 및 10 ppm 미만입니다58.
  27. 바닷물 미생물이 성장할 수 있도록 박테리아가 추가되는 일 동안 자외선이 꺼져 있는지 확인하십시오. 파라미터가 안전 범위 내에 있는 후 UV 광을 다시 활성화할 수 있습니다.
  28. 시스템이 확립된 후 pH 및 산소가 각각 8.0-8.4 및 figure-protocol-259에 있는지 확인합니다. 수족관에 동물을 추가하기 전에 구리 물 테스트 키트를 사용하여 시스템 내에 구리 및 산소 수준의 존재를 확인하십시오.
    참고: 구리는 무척추 동물에 손상을 입히고 물고기 아가미60,61의 삼투압을 방해합니다.
  29. 구리가 물에서 발견되는 경우 DI/RO 수원을 테스트합니다. 수원에 구리가 포함되어 있지 않다고 결정한 후 30%의 물 변화를 수행하고 활성탄 블록(Part #46)을 물 안에 놓습니다. 문제가 지속되면 전체 물 변경을 수행하고 모든 부품을 청소하십시오.
  30. 모든 물 매개 변수가 안전한 수준 내에 있다고 결정되면 문어를 추가하기 최소 일주일 전에 10 개의 유령 새우를 시스템에 추가하십시오. 이것은 박테리아를 위한 biomass를 소개하고 전반적인 수질을 표시하는 것을 도울 것입니다.
  31. 조류 쓰레기통에 수족관 생태계 주민을 추가합니다. 여기에는 채토모르파 스프(스파게티 조류), 트로커스 스프가 포함됩니다. (붕대 트로커스 달팽이), 그리고 메르세나리아 용병 (체리 스톤 조개).

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그림 2: 섬프 시스템. 섬프 시스템의 측면 보기 (a). 섬프 시스템의 상단 보기 (b). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 탱크 및 환경 제어 장치 아래에 섬프 필터링 시스템이 있는 수족관. 녹색 화살표는 시스템을 통한 물 흐름방향을 나타냅니다. 냉각을 위해 1부에서 2절까지 흐르는 물은 무거운 생물학적 물질을 가벼운 물질로부터 분리합니다. 무거운 폐기물은 바닥과 섹션 5로 떠다니며 작은 생물학적 물질이 섹션 4 내에서 양말 필터로 흐릅니다. 물은 물 안에 남아 있는 폐기물을 제거하기 위하여 6에서 단백질 스키머를 입력하는 4개의 섹션 5에서 흐릅니다. 조류 쓰레기통에는 폐기물, 암모니아 및 질산염을 분해하고 물을 산소화하는 미생물이 포함되어 있습니다. 시스템의 마지막 부분에서, 탱크로 다시 펌핑되기 전에 증발을 고려하여 더 많은 물이 추가됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 저장 탱크

  1. 두 개의 키가 큰 60 갤런 물 저장 탱크를 설정, 바닷물에 대 한 하나 및 RO 물에 대 한 다른. 담수 탱크의 최대 채우기 라인이 테이블보다 더 높은지 확인합니다. 1/4 인치 튜빙을 섬프 시스템의 플로트 밸브의 자동 상단에 부착하고 담수 탱크의 바닥에 튜브의 다른 끝을 부착합니다.
    참고: 물이 증발하면 다시 채우기 위한 것입니다. 소금은 물에 머무를 것입니다.
  2. 바닷물 탱크를 물로 채우고 탱크에 소금의 비례 량을 추가합니다. 혼합 및 적절한 산소를 위해 해수 저장 탱크를 지속적으로 흡입합니다. 소금의 전체 혼합을 보장하기 위해 사용하기 전에 한 시간 동안 기다립니다.
    참고: 해수 탱크는 청소 후 탱크를 다시 채우는 데 유용합니다.

3. 식품 탱크 설정

  1. 새우를 1주일 이상 살아 있게 하려면 30 ppt 이하의 명분과 25°C에 가까운 온도로 문어와 별도의 탱크에 보관하십시오.
  2. 이렇게 하려면 문어 탱크가 숙성된 지 일주일 후, 숙성된 바닷물 8갤런을 새우 탱크로 옮기습니다. 탱크 바닥에 15 kg의 으깬 산호를 추가합니다. 용해 (그림 4)에 대한 은신처를 숨기기 위해 탱크에 몇 개의 살아있는 바위를 추가합니다.
    참고: 성숙한 바닷물은 1.30단계에서 와 같이 해수 내에서 해양 박테리아가 성장할 수 있도록 하는 과정을 말합니다.
  3. 탱크 가장자리에 캐니스터 필터를 부착합니다. 제조업체의 지시에 따라 캐니스터 필터를 설정합니다. 탱크에 에어 스톤이 부착된 튜브에 연결된 탱크 옆에 에어 펌프를 추가합니다.
  4. 필터를 청소하고 매주 필터 패드를 변경합니다. 또한 물의 25%를 동시에 교체해야 합니다. 1.30 단계에서 설명한 바와 같이 수질 테스트 키트를 식품 탱크에서 질소, pH 및 온도 매개 변수를 매일 확인하십시오. 물 질소 매개 변수가 높은 상태로 유지되면 추가 적인 물 변화를 수행하고 물에 질소 흡수백을 추가하십시오. 또는 문제가 한 달 이상 지속되면 새우를 더 큰 탱크로 옮겨야 합니다.
  5. 으깬 산호 퇴적물을 사라지자마자 새우를 넣으세요. 먼저 새우를 추가하려면, 도착 시, 작은 바닷물 탱크에 물을 발송하지 않고 새우를 5 분 동안 이동하여 바이오 폐기물을 제거하십시오. 이어서, 새우는 탱크에 직접 첨가할 수 있다. 모기 물고기는 도착 시 새우 탱크에 직접 첨가 할 수 있습니다.
    참고: 새우와 모기 물고기는 재료 시트 또는 기타 식품 공급 업체에 나열된 살아있는 동물 상업 공급 업체에서 구입할 수 있습니다. 또한 문어 해동 새우를 제공 할 수 있습니다.
  6. 새우와 생선에 생선 조각, 죽은 식물 또는 조류62를 먹이십시오.
  7. 게 탱크의 경우 바닷물 1 갤런과 자갈 10kg을 추가합니다. 한쪽에 자갈을 쌓아 한쪽에 마른 땅과 다른 쪽에 2cm의 바닷물을 남깁니다(그림 4에 명시된 대로). 이러한 무척추 동물에 대한 최적의 환경 용 수분 매개변수는 각각 염분 및 온도11,63에 대해 30-35 ppt 및 22-25 °C여야합니다.
  8. 만지작게를 탱크에 직접 넣습니다(그림 4). 게는 육지에서 대부분의 생명을 보내지만 한 번에 며칠 동안 수중이 될 수 있으므로 장기적인 생존을 위해 부분적으로 수중이 중요한 탱크가 됩니다.
  9. 탱크의 건조한 부위에 생선 조각을 접시에 추가하여 하루에 한 번 피들러 게를 먹이십시오. 게를 제거하고 바닷물의 100 %를 변경하여 매주 청소하십시오. 자갈을 청소합니다.
  10. 문어가 자신을 열고 또 다른 물 여과 메커니즘을 제공하기 위해 바닷물 탱크 내에 해양 바이밸브 연체 동물 (조개와 홍합)을 저장합니다.
  11. 문어 탱크의 필터링 시스템에 불필요한 폐기물 부하를 두지 않도록 첫 주 동안 별도의 비어있는 탱크 내부에 홍합을 놓습니다.
    참고: 홍합은 문어가 선택한 음식이지만 도착 직후 죽을 가능성이 높으며 대량으로 존재하는 경우 탱크 내의 생물학적 폐기물을 실질적으로 증가시킬 것입니다.

4. 탱크에 문어의 소개

  1. 암모니아, 아질산염 및 질산염 수준이 각각 0.5 ppm, 0.25 ppm 및 10 ppm 미만인지 확인하십시오. 탱크에서 문어 잉크를 제거할 수 있는 워터 핸드 펌프를 사용할 수 있습니다. 또한이 절차에 대 한 두 사람이 하는 것이 좋습니다.
  2. 도착 시 가방을 비늘에 놓고 문어를 제거 한 후 가방의 무게를 뺍니다. 동물을 탱크로 옮기는 동안 물 산소를 증가시키기 위해 가방에 공기 석을 추가합니다. 운송물의 온도와 아일린을 측정합니다. 발송 후 장기간 질병의 경우를 기록합니다.
    1. 가방에서 탱크로 물을 옮기지 않고 탱크 구석에 운송 가방을 걸어 서 탱크 물에 부분적으로 잠긴 가방을 들고 운송 가방의 온도를 바꾸기 시작합니다. 가방에서 물 10%를 제거하고 싱크대를 덤프합니다. 탱크에서 동일한 양의 물을 가방에 넣습니다. 가방의 수온이 탱크의 수온과 1° 이상 다르지 않은 때까지 10분마다 반복합니다.
    2. 가방과 탱크의 온도 차가 1°이되면 문어를 개별 탱크로 옮기기 위해 장갑을 착용해야 합니다. 이동하려면 양손을 문어 아래에 배치하여 전송 중에 지원을 제공합니다. 두 번째 사람은 봉지 옆에서 흡입된 팔을 부드럽게 당겨야 합니다.
    3. 문어가 가방에서 꺼내나면, 새 서식지의 물로 빠르게 이동하여 배송 가방에서 물을 적게 옮기세요. 핸드 펌프를 사용하여 탱크에 있을 때 문어가 방출되는 잉크를 제거합니다. 이제 동물의 대략적인 무게를 얻기 위해 물로 가방을 무게.
  3. 도착 후 처음 2 주 동안, 주위 해야 문어의 일일 소비를 모니터링 4% 받는 사람의 무게58,65,66. 문어는 하루에 네 번 확인해야합니다. 이는 2주 후에 하루에 두 번 감소될 수 있습니다. 필요에 따라 음식 소비를 조정하기 위해 2주마다 계량합니다.
    참고 : 문어의 일부 종은 탱크에서 탈출하는 것으로 알려져 있으므로 탱크 뚜껑에 2.5 kg의 무게를 배치하는 것이 좋습니다.

5. 일일 관리

  1. pH, 암모니아, 아질산염 및 질산염용 상용 해수 테스트 키트를 사용하여 키트 지향량의 탱크 물을 키트와 함께 제공되는 4개의 테스트 튜브에 추가합니다. 테스트 키트에 명시된 대로 해당 튜브에 색색 반응제의 양을 추가합니다.
  2. 암모니아, 아질산염 및 질산염 수치가 각각 0.5 ppm, 0.25 ppm 및 10 ppm 이상이면 양말 필터에서 바이오매스를 씻어 내거나 새로운 양말 필터로 변경합니다. 또한, 브러시로 스키머 의 상단에서 바이오 매스를 청소하고 탱크에 추가 탈모 박테리아를 추가합니다. 문제가 지속되면 담수의 25%를 교체하십시오.
    참고: 위의 단계는 생태계 내의 질소 화합물을 감소시다.
  3. 탱크에서 죽은 게와 새우 시체와 핸드 펌프를 사용하여 문어 배설물을 모두 제거하십시오. 탱크에서 남은 살아있는 게를 모두 제거하고 저장 탱크로 다시 이동합니다. 다음으로 탱크 내에서 큰 물체를 다시 정렬합니다.
  4. 문어가 매일 먹을 게의 절반을 1.25 +/- 0.25g의 탱크에 소개합니다. 해동새우나 작은 수컷 피들러 게를 어린 문어에 먹이. 실험에 따라 게와 새우는 탱크 나 문어의 어느 곳에서나 직접 소개 할 수 있습니다.
    참고: 문어 매일 음식 소비는 그들의 무게67의 4%-8%입니다. 냉동 새우는 문어의 무게에 따라 음식 소스로 제공 될 수있다.
  5. 매일 5개의 유령 새우를 제공합니다. 평균적으로 이 실험에서 3개가 소비되었습니다. 문어에 다양한 음식을 제공하려면 일주일에 한 번 살아있는 조개 나 홍합을 주고 항상 탱크 내부에 세 마리의 모기 물고기를 유지하십시오.
    참고: 동물에게 다양한 음식을 제공하는 것은 필요하지 않으며 실험 중에 동물들이 음식에 매료되는 것을 방지할 수 있습니다. 문어 먹이주기와 행동을 가장 잘 모니터링하는 데 사용되는 수유 일정은 체중에 따라 게의 절반수를 도입하고 아침에 새우수를 5명으로 늘리는 것입니다. 저녁에는 게의 후반기를 탱크에 소개합니다.

6. 주간 위생

  1. sump 시스템을 청소하기 전에 스키머, 펌프 및 조류 빈 조명을 종료합니다. 그런 다음 물을 제거하기 전에 시스템의 자동 밸브를 끕니다. 마지막으로, sump 시스템에서만 스키머와 모든 물을 제거합니다.
  2. 조류 쓰레기통을 가볍게 문질러 서 대부분의 바이오매스를 벽에서 제거합니다. 나머지 섬프 영역을 브러시로 청소합니다. 양말 필터를 제거하고 식초로 청소하고 건조시키십시오. 3개월마다 새 양말 필터로 교체하여 매주 다른 양말 필터로 회전합니다. 제거 하 고 스키머 의 상단에서 바이오 매스를 청소 매주.
    참고: 금속을 사용하여 플라스틱을 청소하지 마십시오.
  3. 스키머를 다시 시스템에 넣고 바닷물로 리필하기 시작합니다. 펌프 영역이 채워지기 시작하면 모든 시스템을 다시 켜질 수 있습니다. 플로트 밸브의 자동 상단이 꺼져 있을 때 물 추가를 중지합니다.

figure-protocol-5
그림 4: 바이올린 게 탱크 (미누카 푸냑). 탱크의 바닥은 마른 침대로 지정된 절반, 나머지 절반은 얕은 바닷물 2cm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-protocol-6
그림 5: 유령 새우 탱크 (팔레모네팔루도서스). 새우 탱크의 바위는 새우가 숨기고 용액뿐만 아니라 미생물의 성장을위한 장소를 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

7. 비운 동물 관리

  1. 문어 의 웰빙을 평가하기 위해 가이드 참조66 을 따르십시오.
    참고 : 여성 문어의 경우, 수명 주기의 끝은 일반적으로 계란을 낳은 후 시작됩니다. 동물은 음식 소비를 감소하기 시작하고 모두 먹는 중지하고 더 무기력하게 될 것입니다. 수명 종료 과정 이후에 수명이 다릅니다. 동물을 먹이고 모니터링하는 것 외에는 더 이상의 조치를 취할 수 없습니다. 노화 남성은 음식 소비를 감소시키고 무기력68이 될 것입니다.

8. 문어 마취

  1. 버틀러-스트루벤 외.69에 자세히 설명된 문어 마취를 수행한다.
  2. 키가 15cm 이상인 뚜껑이 있는 6L 용기를 얻습니다. 문어 탱크에서 직접 4 L의 물을 용기에 넣고 공기 석이있는 작은 공기 펌프를 사용하여 4 L의 바닷물에 대한 폭기를 제공하여 산소를 물 환경에 전파합니다58.
  3. 문어 소개 전에 용기에 1% EtOH를 추가합니다. 문어를 처리하기 전에 사이펀에서 물 호기를 계산하여 분당 호흡 수를 기록하십시오.
    참고: 연구원의 실험실 내문어의 경우 기준선 호흡은 분당 16-24 호흡입니다.
  4. 문어를 움직이기 전에 문어의 피부 색소 침착과 기준선 호흡 속도를 기록하십시오. 깨끗한 4L 오픈 입 용기를 사용하여 탱크에서 문어를 제거하여 주변 물로 스푸핑합니다.
    참고: 마취 중 호흡 속도가 반드시 완전한 마취를 나타내는 것은 아닙니다.
  5. 용기에 있는 동안 문어의 무게를 측정한 다음 양손을 문어 의 몸 주위에 놓고 들어 올려 서 움직입니다. 두 번째 사람은 용기 벽에서 흡입 된 사지를 제거하는 데 필요할 수 있습니다.
  6. 1% EtOH로 문어를 준비된 용기에 빠르게 옮킨다. 뚜껑을 닫아 탈출이 가능한 것을 방지합니다.
  7. 처음 5분 말에 사이펀에서 물 호기를 세어 분당 문어의 호흡을 기록합니다. 호흡이 기준선 위에 남아 있고 동물이 가벼운 핀치에 계속 반응하는 경우 물에 0.25 % EtOH를 추가하십시오. 물에 에탄올을 첨가하면 EtOH의 최대 3%까지 지속될 수 있습니다.
    참고: 문어가 무의식적이라는 한 가지 징후는 크로마토포어를 통제하지 못했다는 것입니다. 이 경우 피부는 평소보다 창백해 보입니다. 또 다른 징후는 팔을 가볍게 꼬집어 모터 응답이 있는지 여부를 테스트하는 것입니다. 이 시점에서 응답이 아직 없는 경우 문어가 무의식적이며 실험을 수행할 수 있습니다.
  8. 마취 하에 문어의 호흡과 색상을 모니터링하여 시술 기간 동안 의식을 유지하십시오. 절차 중에 문어가 깨어나기 시작하면 0.25% EtOH를 추가합니다.
  9. 에탄올 마취의 효과를 반전시키기 위해, 영구 보유 탱크에서 새로운 4 L 또는 더 큰 산소 탱크로 문어를 옮길 수 있습니다. 호흡이 정상으로 돌아오면 문어가 활성화되고 피부가 정상적인 안료로 돌아갑니다. 탱크로 다시 이동할 수 있습니다.

9. 문어 안락사

  1. 피오리토 외, 몰츠샤니우스키즈 외, 버틀러-스트루벤 외, 버틀러-스트루벤 외에서 자세히 설명한 문어 안락사에 대한 국제 표준을 따르십시오.
  2. 문어의 보관 탱크에서 4 L의 물로 새로운 6 L 용기를 준비하십시오. MgCl2 에서 안락사 탱크에 4%의 농도로 혼합합니다. 문어를 마취하기 위해 8.1에서 8.9까지단계를 수행합니다.
  3. 8.8단계 후 문어를 안락사 탱크로 옮는다. 호흡이 멈춘 후, 5분간 기다렸다가 문어의 장식을 수행하거나 안락사 탱크에 5분 간 추가로 보관하십시오.

10. O. 비마쿨로이드의 행동

  1. 나사 캡 용기를 사용하도록 훈련받을 때 아침에 문어를 먹이지 마십시오. 수유를 목적으로 하는 영역을 가리키는 카메라 녹화 장치를 설정합니다.
  2. 표면 전체에 1mm 직경의 구멍이 있는 50mL 나사 캡 튜브와 용기 전체의 물 흐름캡을 획득하십시오. 바이올린 게를 용기 안에 놓습니다. 용기 내에 무게를 두거나 외부에 부착하여 탱크 의 바닥에 남아 있습니다.
  3. 컨테이너를 열린 영역 내에 문어와 카메라를 볼 수 있도록 탱크 바닥에 놓습니다. 게가 4 시간 후에 먹지 않은 경우 튜브에서 꺼내 하루 동안 먹이 일정을 재개하십시오. 매일 이 운동을 계속 하십시오.
    참고: 그림 6 에 표시되며 대표 결과 섹션에서 설명합니다.

11. 문어 MRI

참고: 이전에는 문어망막에서 작용성 MRI 반응을 마취된 동물70으로 측정했습니다. 여기서, 우리는 스캔 의 시간이 필요 문어신경계의 초고 공간 해상도 MRI를 얻었다. 따라서, 이것은 안락사된 O. bimaculoides에서 수행되었다.

  1. 7T 시스템을 사용하여 MRI 이미지를 가져옵니다. 조직의 수분을 유지하기 위해 부엌 급 폴리 염화 비닐 랩에 문어를 감싸. 문어를 랩에 놓고 끝에 집어 넣은 다음 롤하여 밀봉합니다.
  2. 직경 4cm의 코일을 전송/수신하여 뇌와 다중 팔의 이미지를 획득하는 볼륨 전송/수신 코일을 사용합니다. 다음 매개 변수와 T1 가중 희귀 시퀀스를 사용: 1500 ms의 반복 시간 (TR), 20 ms의 에코 시간 (TE), 117 x 117 x 500 μm 해상도, 100 평균, 희귀 인자 8. 이들은 설치류 두뇌를 화상 진찰을 위한 전형적인 MRI 매개변수입니다. RARE 계수를 사용하면 이미징속도가 빨라지고 100개의 이미지가 함께 평균화되어 신호 대 잡음 비율이 증가합니다71.
  3. 86mm 볼륨을 사용하여 문어 암을 이미지 코일을 전송하고 4 x 4cm 4 채널 어레이는 코일을 수신합니다. 수술 가위를 사용하여 팔을 잘라 인산완충식식염으로 채워진 15 mL 원피스 튜브에 놓습니다.
    참고 : 시퀀스는 매개 변수가있는 T1_weighted 반전 복구 시퀀스 (MP-RAGE)였으며 TR / TE = 4000 / 2.17 ms, 반전 지연 1050 ms, 100 x 100 x 50μm 해상도, 9 평균, 스캔 시간 1.5 h (그림 7). 반전 복구 시퀀스는 물에서 신호를 무효화하고 이미지 내의 대비를 증가시킵니다. 이 시퀀스는 arm72의 내부 해부학을 시각화할 수 있기 때문에 선택되었습니다.

12. 극저온 형광 단층 촬영 (CFT) 이미징

  1. 문어를 플래시 동결 : 연기 후드에서 작동합니다. 드라이 아이스로 드와르 의 바닥을 덮은 다음 육산으로 채웁니다. 문어를 약 10분 이상 육산으로 천천히 낮추고, 차가운 육산으로 문어를 완전히 덮는 데 필요한 신선한 육산과 드라이 아이스를 추가합니다. 문어가 내장될 때까지 -20°C에서 동결된 상태로 유지합니다.
  2. 문어 포함 및 섹션: CFT 제조업체에서 제공하는 도구를 사용하여 문어를 보관할 적절한 크기의 직사각형 금형을 만듭니다. 10월(최적 절삭 온도) 매체(역사학 실험실에서 사용되는 표준 재료)로 금형의 바닥을 덮고 반고체 젤로 동결합니다.
  3. 냉동 문어를 10월의 젤 층에 넣은 다음 10월로 2-3층으로 천천히 덮습니다. 붓는 단계 사이에 10월이 젤 단계에 들어설 때까지 블록 단계를 동결합니다. 문어가 완전히 덮여 후 - 20 °C에서 적어도 12 시간 동안 블록을 동결하십시오.
  4. 극저온 형광 단층 촬영 계에 샘플을 로드73.
  5. 3개의 방출/여기 필터를 사용하여 중간 해상도로 전체 안락사 된 O. bimaculoides를 이미지하여 여러 3D isotropic 데이터 세트를 생성합니다.
  6. 단면이 팔과 소화 시스템에 도달하면, 추가 히스토로지에 대한 슬라이드에 섹션을 전송합니다.
  7. 원시 데이터 집합을 빠른 처리를 가능하게 하도록 특별히 설계된 CFT 공급업체의 재구성 소프트웨어에 로드합니다.
  8. 각 파장에 대한 지표형 형광 효과 제거를 포함하여 랜드마크 정렬, 히스토그램 밸런싱 및 형광 보정 및 정규화를 사용하여 3차원 스택을 재구성합니다.
  9. 최종 3D 스택이 재구성 도구에 의해 생성되면 이미징 소프트웨어 도구로 데이터를 시각화하고 3D 최대 강도 프로젝션(3D-MIPS)과 함께 백색광 및 형광 오버레이가 있는 플라이스루를 만듭니다(예: 그림 873).

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결과

우리의 연구 결과에 있는 모든 동물은 야생에서 얻어졌고, 따라서 그들의 정확한 나이는 결정할 수 없었고 실험실에서 그들의 체류는 가변이었습니다. 문어 상태는 매일 관찰되었다. 우리는 기생충, 박테리아, 피부 손상, 또는 이상한 행동을 보이지 않았습니다. 동물의 평균 무게는 170.38 +/- 77.25 g이었다. 각 동물은 자신의 40 갤런 탱크에 살고. 1주일 동안 탱크에 대해 기록된 파라미터에 대한 평균 ± 표준 편차는 pH 8.4 ± 0.0, 염분 34.06 ± 0.61 ppt, 온도 18.7 ± 0.75 °C, 암모니아 0.11 ± 0.14 ppm, 아민산 0.25 ± 0.14 ppm, 4.4 prate ± 4.

O. bimaculoides의 행동: 문어의 학습 및 메모리 기능뿐만 아니라 감각 운동 기능을 이해하기 위해, 미완성 테스트 튜브는 유용한 테스트로 표시되었습니다 (도 6

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토론

시스템 설정:
수족관 생태계는 물을 여과하고 산소화하는 기계적 및 생물학적 방법을 모두 사용하는 방식으로 개발되었습니다. 시스템의 필터링 요소는 질소와 산소 수준을 유지하기 위해 양말 필터, 단백질 스키머 및 정기적 인 청소를 활용합니다. 더 중요한 것은, 우리는 또한 위험한 질소 화합물 및 그밖 생물학 폐기물을 소모하고 광합성의 과정을 통해 근해를 통하는 해양 미생물에 의지합니다. 추가 방법은, 조류의 사용 외에도, 물에 산소를 추가하는 것은 부착 된 공기 석조와 외부 에레이터를 통해이다. 어떤 박테리아를 추가 하기 전에, 그것은 성장 매체로 라이브 모래 또는 분쇄 산호를 추가 하는 것이 좋습니다. 미디어가 없으면 유기체가 시스템 내에서 자신을 확립하는 데 더 오래 걸릴 것입니다. 이러한 개발은 생체 폐기물을 효과적으로 분해하고 적절한 매개 변수 내에서 질소 주기를 안정화하는 데 1-3주가 소요됩니다.

환경 강화:

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공개 사항

모든 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 글

이 작품은 NIH UF1NS115817 (G.P.)에 의해 지원되었다. G.P.는 NIH 보조금 R01NS072171 및 R01NS098231에 의해 부분적으로 지원됩니다. 우리는 제라 이미징 플랫폼의 데이터를 수집하고 시각화하는 데 도움이 도움과 지원을 에미트 이미징에서 패트릭 Zakrzewki와 모하메드 Farhoud 감사드립니다. MSU는 브루커 바이오스핀과 연구 계약을 맺고 있습니다.

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참고문헌

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