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방법 논문

투과된 마우스 피질 뉴런의 핵 수송 분석

1.2K 조회수

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DOI:

10.3791/62710

⸱

2021년 7월 9일

 ,  ,  , 
1Department of Neurology, Johns Hopkins School of Medicine, 2Whiting School of Engineering, Johns Hopkins University

이 논문에서

요약

우리는 뉴런 핵세포질 수송의 고함량 자동 분석을 위해 일차 마우스 피질 뉴런의 선택적 원형질막 투과화에 대한 신뢰할 수 있는 방법을 개발했습니다.

초록

핵세포질 수송의 중단은 신경퇴행성 질환의 발병기전과 점점 더 관련이 있습니다. 더욱이, 핵공극 복합체 구조에서 세포 특이적 차이에 대한 인식이 높아지고 있어 뉴런에 사용하기 위해 핵 수송 방법을 조정해야 할 필요성이 대두되고 있습니다. 원형질막을 디지토닌(digitonin)에 의해 선택적으로 천공하는 투과화된 세포 분석법은 불멸화된 세포주에서 수동 및 능동 핵 수송을 연구하는 데 널리 사용되지만 신경 세포 배양에는 적용되지 않았습니다. 초기 시도에서 우리는 낮은 농도의 디지토닌에 노출된 1차 마우스 피질 뉴런에서 핵막 무결성의 급격한 손실을 관찰했습니다. 우리는 뉴런 핵막이 세포질 지지의 손실에 유일하게 취약할 수 있다는 가설을 세웠습니다. 핵 안정성을 개선하기 위한 여러 접근법을 테스트한 후, 농축된 소 혈청 알부민 쿠션이 있는 상태에서 저장성 용해 후 최적의 핵 무결성을 관찰했습니다. 이 접근법에 의해 준비된 신경 세포핵은 에너지 의존적 방식으로 재조합 형광 화물을 안정적으로 수입하여 자동 분석을 통한 고함량 현미경 검사로 핵 수입 분석을 용이하게 합니다. 우리는 이 방법이 1차 뉴런의 수동 및 능동 핵 수송 연구에 광범위하게 적용될 것으로 예상합니다.

서론

핵세포질 수송(nucleocytoplasmic transport)의 중단, 즉 핵과 세포질 사이의 단백질과 RNA의 조절된 이동은 신경퇴행성 질환의 발병기전과 점점 더 관련이 있습니다(최근 검토1). 본 연구진을 비롯한 연구자들은 C9orf72 근위축성 측삭 경화증(ALS) 및 전두측두엽 치매(FTD), 알츠하이머병, 헌팅턴병의 사후 조직 및 동물 모델에서 핵세포질 수송 장치의 구조적 및 기능적 장애를 보고했다 2,3,4,5. 신경퇴행에 대한 핵세포질 수송 중단의 메커니즘과 기능적 결과, 그리고 치료적 구조를 위한 접근 방식은 지속적인 연구가 진행 중인 영역입니다.

핵공은 ~30개의 뉴클레오포린 단백질로 구성된 큰 막관통 복합체로, 핵막을 가로질러 작은 분자의 확산을 허용하지만 중앙 채널에서 페닐알라닌-글리신(FG)이 풍부한 뉴클레오포린의 투과성 장벽을 통해 >40kD의 화물 통과를 점점 더 제한합니다6. 핵 국소화 신호(NLS) 또는 핵 수출 신호(NES) 염기서열을 포함하는 대형 화물은 핵 수송 수용체(importins 및 exportins)를 통해 공극을 가로질러 능동적이고 수용체에 의해 매개된 수송을 거치며, 핵막을 가로지르는 작은 GTPase Ran의 가파른 구배를 거칩니다(최근 검토7). 배양된 세포의 핵 수송 역학을 분석하기 위해 다양한 방법이 개발되었으며, 여기에는 내인성 화물의 수송 및 수송 수용체의 주요 하위 분류에 대한 기질 역할을 하는 태그가 지정된 리포터 구조체가 포함됩니다. 이러한 접근법은 뉴런 2,5,8에 쉽게 적용되었으며 손상되지 않은 살아있는 세포의 맥락에서 핵 수송 섭동에 대한 판독값을 제공합니다. 그러나 살아있는 세포 분석에서는 핵 수송 반응을 직접 조작하거나 다른 세포 과정과 분리하여 조사할 수 있는 능력이 제한적입니다.

투과성 세포 분석에서 원형질막은 선택적으로 천공되고 세포질이 방출되어 핵막과 핵 공극 복합체는 손상되지 않고 수동 또는 에너지 의존적 양방향 수송을 수행할 수 있습니다 9,10. 이러한 수송 반응은 전체 세포 용해물, 세포질 분획 또는 정제된 재조합 핵 수송 단백질 및 그 화물을 첨가하여 쉽게 재구성할 수 있습니다. 따라서 투과화된 세포 분석은 신경퇴행성 질환 연구와 관련된 재조합 또는 합성 단백질 및 RNA의 전달을 포함하여 광범위한 생화학적 또는 생물물리학적 조사를 가능하게 합니다.

핵공 복합체 구조 및 수송 역학11,12의 세포 특이적 차이에 대한 보고를 감안할 때, 우리는 투과화된 세포 분석을 1차 신경 세포 배양에 사용하기 위해 조정하는 것을 목표로 했습니다. 불멸화된 세포주에서 핵 수송을 분석하는 데 널리 사용되었지만, 철저한 문헌 검색에도 불구하고 핵막 무결성의 보존을 검증한 신경 원형질막 투과화에 대한 발표된 보고는 찾지 못했습니다. 대부분의 프로토콜은 원형질막의 고유한 콜레스테롤 구성을 표적으로 하는 세제인 디지토닌(digitonin)에 의존하여 핵막을 천공하면서 핵막을 천공하고 핵막은 그대로 둡니다13. 1차 마우스 피질 뉴런에서 디지토닌을 사용한 초기 시도는 70kD 형광 덱스트란이 핵으로 확산됨으로써 입증되는 핵막 무결성의 즉각적인 손실을 보여주었습니다. 우리는 핵막 파열이 세포질 지지의 손실로 인한 기계적 섭동에 의해 발생할 수 있다는 가설을 세우고 분자 밀집, 세포골격 안정화 및 대체 세포 용해 방법을 포함한 여러 최적화 방법을 테스트했습니다. 여기에서는 농축된 소 혈청 알부민(BSA) 쿠션을 사용하여 신경 세포핵을 보호하고 신경 세포 핵 가져오기의 다운스트림 분석을 용이하게 하는 빠른 저장성 투과화 방법에 대해 자세히 설명합니다. 우리는 최근 이 방법을 사용하여 C9orf72-ALS/FTD14에서 디펩타이드 반복 단백질 파괴 메커니즘을 평가했으며 1차 뉴런의 수동 및 능동 핵 수송에 대한 향후 연구에 광범위하게 적용할 수 있을 것으로 예상합니다.

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프로토콜

먼저, 프로토콜은 1차 신경 세포 배양(1단계) 및 수송 분석을 위한 물질 준비(2단계)를 설명한 다음, 수송 분석 자체(3-4단계)와 이미지 획득 및 분석(5단계)을 설명합니다. 여기에 설명된 모든 방법은 존스 홉킨스 대학의 동물 관리 및 사용 위원회(ACUC)의 승인을 받았습니다.

1. 1차 마우스 피질 뉴런 배양

  1. 재고 용액을 준비합니다.
    1. 해부 완충액: 10x HBSS 50mL, 1M 포도당 15mL(dH2O 내), 1M HEPE 5mL, 100mM 피루브산 나트륨 5mL 및 100x 페니실린-스트렙토마이신 5mL를 결합합니다. dH2O. 멸균 필터로 용량을 500mL로 늘리고 4°C에서 보관하십시오.
    2. 파파인: 박리 완충액으로 파파인을 30mg/mL로 희석합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
    3. DNase: 해부 완충액으로 DNase I를 10mg/mL로 희석합니다. 부분 표본은 -20 °C에서 보관하십시오.
    4. 도금 배지: neurobasal 배지에 5% 소 태아 혈청(FBS), 2% B-27, 1% 글루타맥스 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 추가합니다. 멸균 필터를 사용하여 4°C에서 보관하십시오.
    5. 공급 매체 : Neurobasal 배지에 2 % B-27, 1 % 글루타맥스 및 1 % 페니실린-스트렙토 마이신을 첨가합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
  2. 플레이트를 코팅하십시오.
    1. 광학 유리 바닥 96웰 플레이트를 폴리-D-라이신(20μg/mL) 및 라미닌(1:100)으로 멸균 dH2O로 코팅합니다. 플레이트를 인큐베이터에 밤새 놓습니다.
    2. 해부 당일에는 멸균 dH2O로 우물을 세 번 헹구고 Neurobasal 배지로 교체하십시오. 인큐베이터에서 최소 30분 동안 평형을 유지합니다.
  3. 피질을 해부하고 소화시킵니다.
    참고: 배양 오염을 방지하기 위해 오토클레이브 도구를 사용하여 깨끗한 벤치에서 해부를 수행합니다.
    1. E15-16 C57BL/6J 임산부를 자궁경부 탈구로 안락사시킨다. 복부에 70% 에탄올을 분사합니다. 빠르게 작업하세요. 가위와 톱니가 있는 집게를 사용하여 복부 정중선을 절개하고 자궁을 절제한 다음 양막에서 배아를 페트리 접시로 옮깁니다. 가위로 배아의 목을 베고 해부 완충액이 들어있는 10cm 페트리 접시에 머리를 모읍니다.
    2. 해부 현미경으로 미세한 집게를 사용하여 두개골을 제거하고 수막을 벗겨냅니다. 해부 완충액이 들어있는 신선한 10cm 페트리 접시에 뇌 전체를 옮깁니다. 반구를 분리하고 피질하 구조를 제거합니다.
    3. 멸균 면도날로 피질을 자르고 5mL의 해부 완충액이 들어 있는 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 파파인 100μL(스톡 30mg/mL, 최종 농도 0.6mg/mL)와 DNase 50μL(스톡 10mg/mL, 최종 농도 0.1mg/mL)를 추가합니다. 37°C 수조에서 10분 동안 소화합니다.
      참고: 10분 이상의 소화는 세포 생존에 해롭습니다.
    4. 상층액을 제거하고 10mL의 도금 매체로 두 번 세척하여 소화를 멈춥니다. 각 세척 사이에 조직이 중력에 의해 가라앉도록 합니다.
    5. P1000 피펫을 사용하여 2mL 도금 매체에서 큰 조직 조각이 사라질 때까지 부드럽게 분쇄합니다(약 20회). 8mL의 도금 매체를 더 추가하여 부피를 약 10mL로 늘리고 40μm 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 통과시킵니다.
  4. 뉴런을 플레이트화하고 유지하십시오.
    1. 200 x g 에서 5분 동안 원심분리기 예열된 도금 매체에 세포를 재현탁시킵니다. 세포를 계수하고 도금 매체에서 500,000 cells/mL로 희석합니다. 부드럽게 뒤집어 혼합하고 멸균 다중 채널 저장소로 옮깁니다.
    2. 웰에서 neurobasal media를 흡입하고 즉시 멀티채널 피펫(50,000 cells/well)으로 well당 100μL의 세포를 추가합니다. 코팅된 웰이 건조되지 않도록 하십시오.
    3. 해부 24시간 후 공급 매체로 배지의 50%를 변경합니다. 체외 분석을 수행하기 위해 5-7일째까지 격일로 50% 매체 변화를 계속합니다.

2. 핵 수송 분석 성분의 준비

  1. 전송 버퍼(TRB,15에서 조정)
    1. 5x TRB를 준비하려면 100mM HEPES, 550mM KOAc, 10mM Mg(OAc)2, 25mM NaOAc, 2.5mM EGTA 및 1.25M 슈크로스를dH2O에 용해시킵니다.pH를 7.3으로 조정하고 완충액을 4°C에서 보관합니다.
    2. 운송 실험 당일에는 1x TRB-BSA를 준비합니다. dH2O에 5x TRB를 희석하고 EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일, 2mM의 DTT 및 50mg/mL의 BSA를 추가합니다.
  2. 에너지 재생 믹스 (ERM, 9,16에서 수정)
    1. 20x ERM을 준비하려면 2mM ATP 리튬염, 2mM GTP 리튬염, 80mM 크레아틴 인산염 및 400U/mL 크레아틴 키나아제를 1x TRB에 용해합니다.
    2. 일회용 부분 표본을 -20 °C에서 동결합니다.
  3. 전체 세포 추출물 (WCE, 수송 수용체 및 란 순환 단백질의 공급원)의 준비.
    참고: 실험 목표에 따라 세포질 또는 전체 세포 추출물(WCE)을 사용할 수 있습니다. 여기서, WCE의 제조는 초기 뉴런 수송 검정(10)에 사용된 바와 같이 기재되어 있다.
    1. HEK293T 세포를 15개의 150mm 배양 접시에서 합류하도록 성장시킵니다. 트립신-EDTA로 분리하고, 트립신을 억제하기 위해 10% 소 태아 혈청을 함유한 배지에 재현탁하고, 200 x g 에서 5분 동안 펠릿 세포를 투여합니다. 갓 첨가한 프로테아제 억제제 칵테일과 함께 얼음처럼 차가운 1x TRB 10mL에 세포를 재현탁합니다.
    2. 휴대용 프로브 초음파 발생기를 사용하여 얼음 위에서 3 x 10 펄스로 초음파 처리합니다. 14,000 x g 에서 4°C에서 15분 동안 원심분리하여 정화합니다.
    3. 단백질 농도(목표 8-10 mg/mL)를 측정하고 -80 °C에서 보관하기 전에 액체 질소에서 일회용 분취액을 스냅 동결합니다.
  4. 재조합 원자력 수입 화물
    참고: 3-5단계의 운송 프로토콜은 관심 있는 능동 또는 수동 핵 수송 경로를 조사하기 위해 모든 형광 핵 수송 화물에 맞게 조정될 수 있습니다. 여기서, 프로토콜은 형광 단백질 CyPet 및 YPet14,17 옆에 있는 importin α1의 importin β-binding domain으로 구성된 Rango(Ran-regulated importin β cargo)의 발현 및 핵 수입을 설명합니다. Rango는 FRET 및 핵 수입 분석에 사용할 수 있는 다목적 센서로, 화물β 직접 수입하는 용도로 사용됩니다.
    1. E. coli BL21(DE3) 세포를 Rango plasmid(N-terminal 6-His 태그 포함)로 열충격으로 다음과 같이 형질전환시킵니다. 얼음 위에서 BL21(DE3) 세포 50μL 분취액을 해동합니다. 100-200 ng 플라스미드와 결합하십시오. 튜브를 4-5회 두드려 섞은 다음 얼음에서 30분 동안 배양한 후 42°C 플레이트에 40초 동안 놓습니다. 즉시 얼음 속으로 다시 옮겨 2-5분 더 넣으십시오.
    2. 실온에서 900μL의 SOC 배지를 추가하고 37°C의 셰이커에서 1시간 동안 배양한 후 예열된 한천 플레이트(1.5% 한천, LB 배지, 100μg/mL 암피실린)에 세포를 펴 놓습니다. 플레이트를 37 ° C에서 밤새 배양합니다. 플레이트를 4°C에서 최대 1주일 동안 보관하거나 단백질 생산에 즉시 사용하십시오.
    3. BL21(DE3) 플레이트에서 콜로니 수(~3-10)를 증가시키는 50mL 튜브에 25mL의 스타터 배양 3개를 접종하여 단백질 생산을 시작합니다. 셰이커에서 37°C에서 하룻밤 동안 배양한 후 OD600 nm < 1.0으로 배양물을 선택하여 2.8 L 배플이 없는 Fernbach 플라스크를 사용하여 LB 배지에서 1L 배양액을 접종합니다. OD600 nm = 0.1-0.3에 도달할 때까지 37°C에서 성장합니다.
      참고: 구형 BL21(DE3) LB 한천 플레이트를 사용하거나 고밀도의 스타터 배양(OD600 nm >1.0)을 사용하면 단백질 제제의 수율과 순도가 감소할 수 있습니다.
    4. 얼음 위에 올려 실온(22-25°C)으로 식힙니다. 0.3mM IPTG(최종 농도)로 단백질 발현을 유도하고 실온에서 12-14시간 동안 셰이커(80-120rpm)에서 배양합니다.
    5. 원심분리(6,000 x g, 15분, 4°C)로 세포를 수집하고 EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일을 보충한 PBS(pH 7.4)의 얼음처럼 차가운 10mM 이미다졸 30mL에 재현탁합니다. 얼음처럼 차가운 프렌치 압력 셀을 두 번 통과하여 원심분리(16,000 x g, 40분, 4°C)로 용해물을 정화합니다.
    6. E. coli 배양 1L당 1mL의 수지를 사용하여 고유량 니켈 친화성 아가로스 수지(30-60분, 4°C)로 용해물을 배양합니다. 수지를 크로마토그래피 컬럼에 넣고 얼음처럼 차가운 10mM 이미다졸/PBS(pH 7.4) 10-20량으로 세척합니다. 각 단계에서 5배 베드 용량을 사용하여 25mM 이미다졸/PBS 단위(25-200mM, pH 7.4)로 Rango를 용리합니다.
    7. SDS-PAGE를 사용하여 순도가 가장 높은 배치를 선택하고 풀링합니다.
    8. 10 mM HEPES, 100 mM KCl, 10 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 및 50 mM 슈크로스를dH2O에 용해시켜 XB 완충액을 준비합니다.pH를 7.7로 조정합니다.
    9. XB 완충액의 단백질을 투석하고 30kD 분자량 컷오프의 한외여과 장치에서 원심분리(7500 x g, 4 °C)로 농축합니다.
    10. Bradford 또는 다른 선호되는 방법으로 단백질 농도를 측정하고 -80°C에서 보관하기 전에 액체 질소에서 일회용 분취액을 스냅 동결합니다.

3. 최적의 원형질막 투과화 조건 결정

참고: 뉴런의 각 배치 간의 변화로 인해 각 뉴런 배치에 대한 투과화 조건을 최적화합니다. 핵 수송 분석을 수행하기 전에 같은 날에 이 작업을 수행합니다.

  1. 플라스틱 96웰 스테이징 플레이트에서 50 mg/mL, 100 mg/mL 및 150 mg/mL(분자 밀집/기계적 지지)의 세 가지 BSA 농도 각각에서 0 μM, 10 μM, 20 μM 및 40 μM에서 Tris-HCl pH 7.5(삼투압 팽창 유발)의 연속 희석을 준비합니다. 용액을 37°C로 예열합니다.
  2. 예열된 PBS에서 뉴런을 한 번 헹굽니다. PBS를 제거하고 스테이징 플레이트에서 Tris/BSA를 전송합니다. 인큐베이터로 돌아가 4분 동안 기다립니다.
  3. 인큐베이터에서 꺼내 배양 플레이트를 얼음 위에 놓습니다. 2x TRB-BSA에서 5 x 1 분을 헹굽니다 (2.1.2 단계에서 준비).
  4. 최종 헹굼 후 1x TRB-BSA에 70kD의 Texas Red labeled dextran(0.6mg/mL) 및 Hoechst(1:10,000)를 추가합니다. 접시를 빛으로부터 보호하여 실온에서 15분 동안 벤치에 두십시오.
  5. 컨포칼 현미경을 사용하여 원형질막 투과율이 가장 높지만 핵막이 여전히 70kD 덱스트란의 진입을 제한하는 BSA 농도와 원형질폐≥ 확인하기 위한 이미지. 후속 실험에 이러한 조건을 사용합니다.

4. 핵 수입 분석

  1. 수송 반응을 준비합니다.
    참고: 플레이트의 모든 반응을 동시에 시작할 수 있도록 하려면 뉴런 투과화 전에 얼음 위의 플라스틱 96웰 스테이징 플레이트에서 반응 혼합물을 준비합니다. 조건당 최소 2회의 기술 반복을 수행합니다. 각 플레이트에 컨트롤을 포함합니다.
    1. 웰당 50 μL에 충분한 1x TRB-BSA에 2.5 mg/mL의 WCE, 1x ERM, 형광 화물(200 nM Rango) 및 Hoechst 33342(10 mg/mL, 1:10,000)로 구성된 염기 반응 혼합물을 준비합니다. 옵션: 핵 덱스트란 배제를 이미지화하기 위해 컨포칼 현미경 검사가 필요하다는 점을 염두에 두고 수송 반응 전반에 걸쳐 핵 공극 무결성을 모니터링할 수 있도록 70kD Texas 레드 라벨링 덱스트란을 포함합니다.
      참고: 제공된 WCE 농도는 분석 최적화를 위한 합리적인 시작점입니다. WCE의 각 배치에 대한 실증적 테스트를 수행하여 원하는 화물의 효율적인 핵 수입에 필요한 최적의 농도를 결정합니다. 가져오기 효율성이 다를 수 있으므로 서로 다른 WCE 배치로 준비된 반복실험의 데이터를 결합하지 마십시오.
    2. (1) 화물 단독: Rango, WCE 또는 ERM 제외 및 (2) 억제제: 형광 화물, ERM, WCE 및 100μM importazole(IPZ, importinβ 18의 저분자 억제제)을 포함한 대조군을 준비합니다. 대체 억제제로 0.8mg/mL의 밀 배아 응집소(WGA)19를 사용합니다.
      참고: 수송을 시작하기 전에 최소 30분 동안 WCE를 포함하는 분석 혼합물에서 억제제를 평형화합니다. 최대 억제를 위해 해당 웰의 투과화 후 헹굼 단계에도 억제제가 포함되어야 합니다.
  2. 뉴런을 투과하고 헹굽니다.
    1. 3단계에서 식별된 최적의 배치 특이적 프로토콜에 따라 뉴런을 투과합니다.
    2. 인큐베이터에서 배양 플레이트를 제거하고 즉시 얼음 위에 놓습니다. 1x TRB-BSA에서 5분 동안 2번 헹굽니다. 지정된 웰의 헹굼에 억제제를 포함하십시오.
  3. 수송 반응을 실행합니다.
    1. 최종 헹굼 후 1x TRB-BSA를 제거합니다. 빠르게 작동하는 멀티채널 피펫(50 μL/well)을 사용하여 사전 혼합된 수송 반응을 투과화된 세포로 전달합니다.
    2. 실온에서 고함량 현미경에 플레이트를 즉시 로드하여 타임 랩스 이미징을 시작하거나(4.4단계 참조) 플레이트를 빛으로부터 보호된 벤치에 놓고 고정 및 이미징 전에 원하는 시간(예: 30-120분) 동안 반응이 진행되도록 합니다.
    3. 원하는 경우 4% 파라포름알데히드/PBS로 15분 동안 고정하고 PBS에서 2회 5번 헹구고 나중에 이미징을 위해 50% 글리세롤/PBS로 옮깁니다. 고정 플레이트를 4°C에서 빛으로부터 보호하십시오(최대 1주일 이상 안정적).
  4. 라이브 이미징
    참고: 이 단계에서 선호하는 이미지 획득 및 분석 방법을 적용하십시오.
    1. 고함량 현미경에 플레이트를 로드합니다. 초기 테스트 플레이트를 실행하여 배율, 초점, 노출 시간(Hoechst 및 FITC) 및 실험 샘플을 실행하기 전에 간격을 포함한 이미징 매개변수를 최적화하고 저장합니다. 매개변수를 저장하여 각 후속 플레이트와 함께 다시 로드합니다.
      참고: 정량 분석의 경우, 정상 상태에서 포화 상태보다 훨씬 낮은 FITC(Fluorescent Import Cargo)의 노출 시간을 설정하거나 사용할 최신 시점으로 설정합니다. 테스트 플레이트를 사용하여 이를 설정하고, 실험 조건에 따라 강도의 변화를 허용하기 위해 절반 최대 포화를 목표로 합니다. 각 프레임 및 시간대에 대한 Hoechst 이미지를 수집하여 후속 자동 분석 중에 핵 식별을 가능하게 합니다.
    2. 필요한 경우 Hoechst를 초점 파장으로 사용하여 초점 오프셋을 조정하고 이미징 프로토콜을 실행합니다. 30분 동안 5분마다 이미지를 수집합니다. 관심 있는 가져오기 반응의 이미징 속도와 역학에 따라 필요에 따라 간격과 반응 시간을 조정합니다.

5. 이미지 분석

  1. microscope Review Plate 대화 상자에서 대표 프레임의 Hoechst 및 FITC 이미지를 엽니다. Run Analysis(분석 실행 ) 탭에서 Translocation-Enhanced module(전위 향상 모듈)을 선택하고 설정을 구성합니다. Hoechst를 격실 이미지로, FITC를 전위 프로브 이미지로 설정합니다.
  2. compartments(구획)에서 대략적인 핵 폭, 로컬 배경 위의 강도, 최소/최대 면적을 조정합니다. Auto Separate Touching Compartments를 활성화하여 뉴런이 클러스터링되는 경향이 있습니다. 테스트 실행을 선택하여 결과를 봅니다. 설정을 조정하여 뉴런 핵 식별의 정확도를 최대화하는 동시에 비뉴런 핵 또는 파편의 잘못된 포함을 제한합니다.
    참고: 신경교세포 오염이 존재하는 경우 일반적으로 핵 크기에 따라 이 단계에서 제외할 수 있습니다. 최적의 격실 식별 설정 결정은 정확도와 세포 수 간의 절충안이며 분석, 세포 유형 및 배양 밀도에 따라 경험적으로 설정해야 합니다. 엄격한 매개변수는 많은 셀을 생략하지만 더 적은 오류를 포함하는 반면, 자유주의 매개변수는 더 포괄적이지만 더 많은 오류를 포함합니다. 핵 크기에 영향을 줄 수 있는 다양한 세포 집단(즉, 질병 돌연변이) 또는 치료법이 포함된 경우, 실험 내에서 여러 매개변수 세트가 필요하지 않도록 모든 조건을 수용할 수 있을 만큼 충분히 광범위한 크기/강도 매개변수를 설정하는 것이 좋습니다.
  3. 핵 가장자리의 아티팩트를 방지하려면 Hoechst 염색에 의해 정의된 구획 가장자리 내부 및 외부의 여러 픽셀로 측정 영역을 정의합니다. 배율 및 범주화에 따라 내부 영역 거리에 대해 2-4픽셀을 설정하고 외부 영역 거리에 대해 1-2픽셀을 설정합니다. 외부 영역 너비(1-2픽셀)를 조정합니다.
  4. 원하는 배경 추정 방법을 선택합니다(기본값인 Auto Constant 권장). Configure data log(데이터 로그 구성)에서 mean inner intensity(평균 내부 강도), mean outer intensity(평균 외부 강도) 및 inner/outer mean intensity(핵 대 세포질(N/C) 비율)를 포함하여 원하는 출력 매개 변수를 선택합니다. 해석 매개변수를 저장합니다.
    참고: 각 실험에 내부 양성 및 음성 대조군을 포함하는 것은 매개변수가 관심 있는 생물학적 사건을 감지하기 위한 감도를 최대화하도록 하기 위해 강력히 권장됩니다.
  5. Plate Utilities 대화 상자를 사용하여 저장된 매개변수를 사용하여 원하는 플레이트에 대한 분석을 실행하고 측정값을 내보냅니다.
  6. 처리 조건별로 데이터를 검토하고 요약합니다. 옵션: 필터를 적용하여 프로브 강도 = 0 및 극단적인 N/C 비율(예: <0.1 및 >100)과 같은 비생리학적 데이터를 제거합니다. 모든 조건 및 실험에 필터를 동일하게 적용합니다.
  7. 기준선 형광에 대한 추가 보정으로, 용해물과 ER이 생략된 대조군 웰로 데이터를 정규화합니다. 생물학적 복제물(즉, 독립적인 신경 세포 배양 제제) 간의 비교를 용이하게 하기 위해 최종 핵 가져오기 데이터를 시간 0의 백분율로 표현합니다.

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결과

원형질막의 선택적 투과화(그림 1A)는 프로토콜에서 가장 중요한 단계이며 핵 수입 분석을 진행하기 전에 검증해야 합니다. 각 배양 준비 간의 차이로 인해 3단계에서 설명한 대로 저장성 Tris-HCl 완충액 및 BSA 쿠션의 최적 배치 특이적 농도를 식별하기 위해 초기 적정 플레이트가 일상적으로 실행됩니다. 과소 투과 및 과투과 세포는 70kD dextran이 세포질 구획으로 침투하지 못하거나 세포질 및 핵 구획 내에 각각 dextran이 존재하기 때문에 컨포칼 현미경(그림 1B)으로 쉽게 식별할 수 있습니다. 최적의 조건에서 대다수의 세포(≥80%)는 핵막을 둘러싸고 있지만 교차하지 않는 70kD 덱스트란을 보여줍니다.

투과성 최적화에 이어 4단계에서 설명한 다음 중요한 단계는 형광 화물의 핵 수입이 에너지 및 수송 수용체에 의존한다는 것을 확인하는 것입니다(

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토론

위에서 자세히 설명한 프로토콜은 핵 가져오기 분석을 위해 1차 마우스 피질 뉴런의 원형질막을 선택적으로 투과화하기 위한 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법을 제공합니다. 여기에서는 직접 수입 β 화물(Rango)의 핵 수입 분석 방법의 응용 프로그램을 보여주지만, 이와 동일한 접근 방식을 사용하여 광범위한 형광 화물의 수동 및 능동 수입을 분석할 수 있습니다. 투과화는 ALS 및 FTD14와 관련된 돌연변이 C9orf72 디펩타이드 반복 단백질(DPR)에 대해 최근에 설명한 것처럼 온전한 세포에서는 실현 가능하지 않은 방식으로 수송 반응을 정밀하게 조작할 수 있습니다. 합성 DPR 단백질은 핵 수입 반응이 시작되기 전에 수송 용해물로 사전 배양되어 아르기닌 함유 DPR에 의한 핵 수입 차단의 농도 및 길이 의존성 분석을 용이하게 했습니다. 분획 연구에서는 핵 수입에 대한 기능적 결과를 분석하기 위해 DPR 유도 ...

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공개 사항

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감사의 글

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 M HEPESGibco15630-080
10x HBSSGibco14185-052
32% 파라포름알데히드전자 현미경 과학15714-S
96웰 광학 유리판CellVisP96-1.5H-N
ATP 리튬 염Millipore Sigma11140965001
B27Gibco17504-044
Bio-Rad 단백질 분석 키트 IIBio-Rad5000002
BL21(DE3) E. coliNEBC2527H
소 혈청 알부민 분획 V, 열 충격, 지방산 무함유Sigma-Aldrich3117057001
크로마토그래피 컬럼Bio-Rad7311550
크레아틴 키나아제Millipore Sigma10127566001
크레아틴 인산Millipore Sigma10621722001
Dextran, Texas Red, 70,000 MWThermo FisherD1864
DNase ISigma-AldrichDN25
E15-16 시간 제한 임산부 C57BL/6J 암컷 마우스Jackson Laboratory000664
ExcelMicrosoftN/A
Fetal bovine serumHycloneSH30070.03
GlutamaxGibco35050-061
GlycerolThermo Fisher15514011
GTP 리튬 염Millipore Sigma11140957001
HALT 프로테아제 억제제 (100x)Thermo Fisher78439
HEK293T 세포ATCCCRL-3216
HIS-Select HF Nickel affinity gelSigma-AldrichHO537
Hoechst 33342Thermo FisherH1399
ImageExpress Micro Confocal High-content Imaging System분자 소자해당 없음타임랩스 이미징에 사용
ImidazoleMilliporeI3386
ImportazoleSigma-AldrichSML0341
IPTGCorning46-102-RF
LamininSigma-AldrichL2020
LB brothGrainger31FZ62
LSM800 컨포칼 현미경ZeissN/A덱스트란 이미징에 사용
MetaXpress High Content Image Analysis SoftwareMolecular DevicesN/A
Neurobasal mediumGibco21103
파파인워딩턴LS003126
페니실린-스트렙토마이신Gibco15140-122
폴리-D-라이신시그마-알드리치P6407
프로테아제 억제제 칵테일밀리포어 시그마11873580001
랑고 플라스미드 (pRSET Rango2/a1 + 링커)N/AN-terminal6-His 함유 태그
: SOC(catabolite 억제가 있는 초최적 육수), 미디어품질: 생물학340-031-671
피루브산 나트륨Gibco11360-070
Spin-X, UF 농축기(30K MWCO),코닝CLS431484
트립신-EDTA(0.05%), Gibco25300054
염 , , , , ,

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