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방법 논문

Pure Shift 핵 자기 공명: 식물 대사체학을 위한 새로운 도구

1.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/62719

⸱

2021년 7월 31일

 ,  , 
1Departamento de Ciencias - Química, CERMN, Pontificia Universidad Católica del Perú

이 논문에서

요약

이 논문은 식물의 대사 프로파일링에서 PSYCHE 및 SAPPHIRE-PSYCHE의 사용을 제시하고 샘플 준비 및 최적의 Pure Shift NMR 스펙트럼 기록에 대한 자세한 절차를 포함합니다. 동핵 디커플링에 의해 달성된 분해능의 이득을 통해 시스템을 보다 포괄적으로 이해할 수 있는 예가 논의됩니다.

초록

핵 자기 공명(NMR)은 대사체학에 사용되는 가장 강력한 도구 중 하나입니다. 이는 정량적 데이터를 제공할 뿐만 아니라 복잡한 혼합물에 존재하는 대사 산물의 구조적 식별을 가능하게 하는 매우 정확하고 재현 가능한 방법입니다.

1H NMR에 의한 대사 프로파일링은 작물 상태 평가, 수확 및 수확 후 처리, 대사 표현형, 대사 경로, 유전자 조절, 바이오마커 식별, 화학 분류학, 품질 관리, 원산지 명칭 등을 포함하는 다양한 유형의 식물 시나리오 연구에 유용한 것으로 입증되었습니다. 그러나 확장된 J-커플링 다플리티와 함께 많은 수의 공진의 신호 중첩은 스펙트럼 분석 및 해석을 복잡하게 만들고 고전적인 1HNMR 프로파일링에 대한 한계를 나타냅니다.

지난 10년 동안 다중 신호가 단일 공진선으로 붕괴되는 새로운 NMR 광대역 동핵 디커플링 기술(일반적으로 순수 시프트 방법이라고 함)이 1HNMR 클래식 스펙트럼에 내재된 스펙트럼 해상도 문제를 극복하기 위해 개발되었습니다.

여기에서는 식물 추출물 준비의 단계별 프로토콜과 바닐라 식물 잎, 감자 괴경(S. tuberosum) 및 케이프 구스베리(P. peruviana)의 세 가지 다른 식물 매트릭스에서 최적의 Pure Shift PSYCHE 및 SAPPHIRE-PSYCHE 스펙트럼을 기록하는 절차를 제시합니다. 대사 식별, 상관 관계 분석 및 다변량 분석에서 분해능 증가의 효과는 고전적 스펙트럼과 비교하여 논의됩니다.

서론

유기체를 구성하는 완전한 대사 산물 세트(생물학적 과정의 기질, 중간체 및 최종 산물)는 1998년에 대사체(metabolome)라는 용어와 함께 만들어졌습니다. 대사체가 표현형과 밀접한 관련이 있다는 것은 잘 알려져 있으며, 유전자형과 환경 사이의 직접적인 상호 작용을 반영하기 때문에 식물에 특히 관심이 있습니다 1,2. 따라서 대사체 프로필의 특성화는 식물에서 가장 중요한 요소가 되었습니다. 바이오마커(주요 대사 산물) 및 대사 패턴의 식별 및 정량화를 통해 종, 품종, 발달 단계, 병원성 질병 또는 환경 조건(일일 및 계절 변화, 토양, 수분 스트레스, 기계적 스트레스, 수확 및 수확 후 처리) 간의 구별이 가능해졌습니다 3,4,5.

질량 분석법(MS) 및 핵 자기 공명(NMR) 분광법은 이러한 목적을 위해 가장 널리 사용되는 분석 플랫폼입니다. MS 방법론과 달리 NMR은 재현성이 높고, 편향되지 않고, 정량적이고, 정확하고, 비파괴적인 기술로서 최소한의 시료 전처리만 필요하므로 대사체학 연구에 적합합니다. 그러나 MS 방법과 비교할 때 본질적으로 낮은 감도는 한계입니다. 최근 몇 년 동안 고자기장 자석, 극저온 프로브, 마이크로 코일 장치 및 DNP(Dynamic Nuclear Polarization) 방법의 사용을 통해 NMR의 감도가 크게 향상되었습니다. 예를 들어, 후자의 접근 방식의 경우, 감도 이득은 6,7 크기의 2-3 자릿수 수준이었습니다. 현재까지 발표된 대사체학 연구의 거의 20%가 NMR 기반이며 그 수는 증가하고 있습니다7.

Proton NMR은 NMR 대사체학 지문 채취를 위한 가장 인기 있고 민감한 실험이지만 몇 가지 단점이 있습니다. 첫째, 샘플에서 검출된 모든 1HNMR 신호는 양성자 화학적 이동 창에 해당하는 작은 창에 분포되어 스펙트럼이 혼잡해집니다. 둘째, 동핵 스칼라 커플링은 신호를 여러 구성 요소(신호 다중성)로 분할하여 프로톤 신호를 더 넓은 주파수 범위로 확산시키고 군집 및 신호 중첩을 증가시켜 스펙트럼 판독을 더욱 복잡하게 만듭니다. 또한, NMR 대사체학은 일반적으로 NMR 관찰 가능한 농도에서 50-300개의 분자를 포함하는 혼합물의 분석에 사용되어 200-2000개의 피크로 구성된 복잡한 스펙트럼을 생성합니다.

순수 이동(Pure Shift)이라고도 하는 동핵 디커플링 양성자 NMR은 다중 신호를 단일 피크로 붕괴를 유도하는 방법입니다. 이는 혼잡한 스펙트럼 8,9,10에서 신호 분해능을 증가시키기 위한 탁월한 도구로서 식물 대사체학(11)에 편리한 도구이다.

지난 10년 동안 감도와 디커플링 성능을 모두 향상시키는 새로운 Pure Shift 펄스 시퀀스가 등장했습니다. 그들의 응용 범위는 분자 구조 규명12,13에서 플럭소믹스14, 혼합물 할당 15,16,17, 병진 확산 측정18, 거울상 이성질체 구별19, 공중 합체의 단위 분포20 등으로 확장되었습니다.

역사적으로 Broadband Pure Shift 실험은 감도가 낮고 처리 방법이 복잡하여 생물학적 추출물 평가에서 그 범위가 제한되었다8. 2014년 Foroozandeh et al.은 anti-z-COSY 펄스 시퀀스를 기반으로 하는 새로운 Pure Shift 실험인 PSYCHE(Pure Shift Yielded by Chirp Excitation)를 발표하여 우수한 동핵 디커플링을 생성하고 감도 값을 개선했습니다21. 그러나 PSYCHE는 시간 도메인 데이터의 청크를 획득하는 2D 인터페로그램 실험이기 때문에 청크의 가장자리에서 J-커플링 변조 왜곡으로 인한 주기적인 측파대 아티팩트가 발생합니다. 복잡한 혼합물에서, 이러한 인공물은 매우 낮은 농도로 존재하는 대사 산물과 관련된 신호보다 더 큰 신호를 생성하여 분석을 방해한다11. 이러한 아티팩트를 제거하는 방법에는 TSE-PHYCHE22 와 SAPPHIRE-PSYCHE(Sideband Averaging by Periodic PHase Incrementation of Residual J Evolution)23라는 PSYCHE 실험의 최신 수정 버전 두 가지가 있습니다.

2019년에 우리는 민감도 페널티(sensitivity penalty23) 없이 인공물을 제거하는 SAPPHIRE-PSYCHE Pure Shift 분석법이 일반적으로 케이프 구스베리11로 알려진 Physalis peruviana의 과일 추출물과 같은 복잡한 생물학적 혼합물의 분석에 사용될 수 있음을 처음으로 입증했습니다11. 우리는 이러한 방법이 대사 할당, 상관 분석 및 다변량 계수 분석과 같은 대사체학 데이터 분석의 성능을 향상시키는 것으로 나타났다11. 그 이후로, 연산호24, 하이페리쿰 식물25, 꿀26,27, 차27, 페퍼민트 오일26 및 호두28와 같은 다양한 생물학적 매트릭스에 대한 여러 Pure Shift 대사체학 연구가 다루어졌으며, 이는 대사체학 분석을 위한 새로운 도구로서의 중요성을 입증했습니다. 역설적이게도, 이러한 연구의 대다수는 더 나은 성능을 보이는 SAPPHIRE-PSYCHE 펄스 시퀀스 대신 모든 분광계 라이브러리에서 사용할 수 있는 표준적이고 구현하기 쉬운 PSYCHE 펄스 시퀀스를 사용했습니다. 그러나 적절한 설정을 위해서는 펄스 시퀀스를 더 잘 이해해야 합니다.

이 논문은 새로운 사용자가 식물, 특히 Vanilla sp (V. planifolia 및 V. pompona) 29, 감자 괴경 (S. tuberosum) 30 및 Cape gooseberry (P. peruviana) 31의 잎 연구에 Pure Shift 방법을 적용하는 데 도움을주기위한 것입니다. 샘플 준비, NMR 실험 설정, 데이터 수집 및 데이터 분석에 대해 자세히 설명합니다. 또한 이 프로토콜에는 이 분야를 처음 접하는 연구자가 식물의 대사체 프로파일링에서 PSYCHE 및 SAPPHIRE-PSYCHE 실험을 적절하게 설정하는 데 도움이 되는 핵심 사항이 포함되어 있습니다.

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프로토콜

1. 시료 전처리

  1. 케이프 구스베리
    1. 100-200g의 신선한 과일을 블렌더 꽃병에 넣습니다. 4°C에서 30분 동안 유지한 다음 실험실 블렌더에서 균질화합니다.
    2. 즉시 주스를 50mL 플라스틱 튜브에 옮기고 액체 질소에 얼린 다음 4-5 일 동안 건조시킵니다.
    3. 전기 그라인더를 사용하여 동결 건조 된 재료를 미세한 분말로 분쇄합니다.
      알림: 분말은 흡습성이 높기 때문에 건조 물질의 취급을 신속하게 수행해야 합니다.
    4. 분쇄 재료 1g의 무게를 측정하고 초순수 10mL를 추가합니다. 1분 동안 소용돌이
    5. 10 ° C에서 20 분 동안 초음파 처리 한 다음 23,000 × g 에서 10 ° C에서 20 분 동안 원심 분리합니다.
    6. 상층액을 회수하고 13mm 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 0.45μm 주사기 필터를 통해 여과합니다.
    7. 여과된 추출물 1mL를 동결건조시킨 후 얻어진 고체를 0.9mL의 200mM 옥살산나트륨 완충액 pH 4에 다시 현탁시킵니다. 소용돌이.
    8. 생성된 샘플을 동결건조시켜 건조시키고 5mM의 3-(트리메틸실릴)프로피온-2,2,3,3-d4 산성 나트륨염(TMSP-d4)을 함유한 0.9mL의 산화중수소에 용해시킵니다.
    9. 마이크로피펫을 사용하여 NMR 튜브에 0.6mL의 샘플을 채웁니다.
  2. 바닐라 잎
    1. 잎을 모아 젖은 티슈 페이퍼로 닦고 액체 질소로 통째로 얼립니다.
    2. 잎을 작은 조각으로 부수고 건조될 때까지 4일 동안 동결 건조합니다.
    3. 전기 그라인더를 사용하여 건조 물질을 미세한 분말로 갈아줍니다.
    4. 50mg의 분쇄 물질을 칭량하고 0.1%의 TMSP(w/w) 및 0.75mL의 메탄올-d4를 포함하는 산화중수소에 pH 6.0 0.75mL 인산염 완충액 pH 4를 추가합니다. 1분 동안 소용돌이
    5. 25 ° C에서 20 분 동안 초음파 처리합니다.
    6. 13,000× g 에서 25°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
    7. 상층액(~1.3-1.4mL)을 회수하고 13mm PTFE 0.45μm 주사기 필터를 통해 여과합니다.
    8. 마이크로피펫을 사용하여 여과된 샘플 0.6mL를 NMR 튜브에 채웁니다.
  3. 감자 괴경
    1. 4-8개의 괴경을 껍질을 벗기고 자릅니다. 즉시 약 125g의 재료를 스탠드업 백에 넣고 액체 질소에 얼립니다.
      알림: 취급 중 산화를 방지하려면 감자를 damp.
    2. 완전히 건조될 때까지 4-6일 동안 동결 건조합니다.
    3. 전기 그라인더를 사용하여 건조 물질을 미세한 분말로 갈아줍니다.
    4. 분쇄된 괴경 160mg의 무게를 측정하고 탈이온수 1.6mL를 추가합니다. 1분 동안 소용돌이
    5. 10 ° C에서 45 분 동안 초음파 처리합니다.
    6. 23,000 x g 에서 10°C에서 20분 동안 원심분리합니다.
    7. 상층액(~1.5 -1.6mL)을 회수하고 냉장 원심 진공 농축기에서 10°C에서 16시간 동안 건조되도록 증발시킵니다.
    8. 얻어진 고형물(20-25mg) 0.9mL의 100mM 옥살산나트륨 완충액 pH 4, 와류에 넣고 10°C에서 16시간 동안 증발시킵니다.
    9. 얻어진 고체를 3mM의 TMSP를 함유한 산화중수소 0.9mL에 용해시킨다.
    10. 23,000 x g에서 10 °C에서 5 분 동안 원심 분리하고 13mm PTFE 0.45 μm 주사기 필터를 통해 상층액을 NMR 튜브로 직접 여과합니다.
      참고: 이 경우 1000개 이상의 샘플 준비 단계를 줄이기 위해 NMR 튜브로의 직접 여과를 수행했습니다.

2. NMR 데이터 수집 및 처리

  1. NMR 초기 설정
    1. 샘플을 NMR 분광계로 옮깁니다.
    2. 프로브 헤드를 조정하고 일치시킵니다.
    3. 샘플을 잠그고 끼웁니다.
    4. 90° 하드 펄스를 보정합니다. 표준 절차 중 하나를 사용하여 90° 펄스를 보정합니다.
    5. 표준 1D 양성자 NMR 스펙트럼을 실행합니다.
  2. PSYCHE 실험
    1. Bruker Topspin 라이브러리에서 reset_psyche_1d 펄스 시퀀스를 선택합니다(그림 S1). 5kHz 스펙트럼 폭(SW2), 최소 1초 또는 2초의 이완 회복 지연(D1), 16개의 더미 스캔(DS), 블록당 64개 또는 128개의 복합 데이터 포인트(L31), 64개 또는 128개의 스캔(NS)과 같은 표준 매개변수를 사용합니다(그림 S1).
      참고: L31은 각 Pure Shift 블록에서 획득한 복잡한 디지털 포인트의 수로, 2의 거듭제곱으로 설정하는 것이 가장 좋습니다. 21명
    2. 원하는 CHIRP 펄스 플립 각도 여기(CNST61)를 설정하고 CHIRP 펄스 대역폭(CNST60)에 대해 10kHz를 설정합니다(그림 S2).
      참고: PSYCHE 실험은 anti-z-COSY 스킴을 기반으로 합니다. 따라서 아티팩트의 재결합을 방지하기 위해 CHIRP 펄스 플립 각도가 작아야 합니다(그림 1). 절대 강도는 여기 플립 각도에 따라 증가합니다. 주기적 아티팩트도 향상되어 스펙트럼으로 퍼지고 "노이즈"가 증가합니다(그림 1). "소음"은 표준 소음과 삐걱거리는 아티팩트의 조합이 됩니다. 감도와 낮은 재결합 아티팩트 사이의 좋은 절충안은 CNST61 = 20°를 설정하는 것입니다. 19,22년
    3. 하드 펄스 길이(P1)를 이전에 보정된 값으로 설정하고 PSYCHE 모양 펄스 길이를 30ms(P49)로 설정합니다(그림 S2).
      알림: 형상 펄스 전력이 이 값에서 자동으로 계산되므로 하드 펄스 값을 보정하는 것이 매우 중요합니다.
    4. PSYCHE 소자에 대한 Crp_psyche.20(SPNAM 37) 형상 펄스를 선택합니다(그림 S2).
    5. PSYCHE 요소(GPZ0) 중에 적용되는 펄스 필드 구배의 강도를 설정합니다. 그라디언트 모양 펄스(GPNAM 0)에 대해 RECT.1을 선택합니다(그림 S2).
      알림: 약한 자기장 구배는 프로브에 따라 일반적으로 구배의 최대 강도의 1%에서 4% 사이로 PSYCHE 요소 중에 적용됩니다.
    6. Pure Shift FID(TD1)를 재구성하기 위해 수집할 블록 수를 설정합니다(그림 S3).
      참고: PSYCHE는 TD1이 Pure Shift 인터페로그램 블록의 수인 유사 2D 실험으로 획득됩니다. 스펙트럼 분해능은 스펙트럼 윈도우(SW1)의 크기와 획득한 점의 총 개수(TD1*2*L31)에 따라 달라집니다. 일반적으로 블록당 64개 또는 128개의 복합 포인트가 있는 16개 또는 32개의 블록은 충분한 디지털 해상도를 제공합니다. PSYCHE는 인터페로그램 방식으로 기록되기 때문에 블록 수가 많을수록 디지털 해상도가 증가하지만 총 획득 시간도 증가합니다(19). 동핵 J-커플링은 각 블록 동안 진화하여 진동 J 변조 패턴21,23을 생성합니다. 푸리에 변환 후에는 블록의 길이에 따라 달라지는 주기적인 측파대 아티팩트가 생성됩니다(그림 2). 아티팩트를 줄이려면 블록의 지속 시간이 일반적으로 16ms 미만으로 짧아야 합니다(블록 지속 시간 = 2*in0: 그림 S1). 블록 지속 시간이 길면 L31을 줄입니다.
    7. Bruker의 Proc_reset AU 프로그램과 푸리에 변환을 사용하여 데이터를 처리합니다.
      참고: 제로 필링(zero filling)과 사인 벨 아포다이제이션(sine bell apodization)을 사용하여 스펙트럼을 변환하는 것이 좋습니다(그림 S4).
  3. SAPPHIRE-PSYCHE 실험
    1. SAPPHIRE-PSYCHE 펄스 시퀀스를 선택하고 펄스 시퀀스 매개변수를 설정합니다. 표준 매개변수는 5kHz 스펙트럼 폭(SW3), 최소 1초 또는 2초의 이완 지연(D1), 16개의 더미 스캔(DS), 증분당 8개 또는 16개의 스캔(NS) 및 D2 - 14ms입니다(그림 S5).
      참고: 이 시퀀스는 Bruker의 레퍼토리에 포함되지 않지만, 시퀀스 및 처리 프로그램은 Manchester NMR Methodology Group 웹사이트, (https://www.nmr.chemistry.manchester.ac.uk/?q=node/426)23에서 얻을 수 있습니다. D2 지연은 T2 완화가 각 J 변조 증가에서 일정하게 유지되도록 합니다. D2는 1/4*SW1+p16+2*d16보다 커야 합니다. 23명
    2. 원하는 CHIRP 펄스 플립 각도 여기(CNST20)를 설정하고 CHIRP 펄스 대역폭(CNST21)에 대해 10kHz를 설정합니다(그림 S6).
      참고: 일반 PSYCHE 실험에서와 같이 CHIRP 펄스 플립 각도는 아티팩트의 재결합을 피하기 위해 짧아야 합니다. CNST20 = 20°는 감도와 낮은 재결합 아티팩트 21,23,25 사이의 좋은 절충안입니다.
    3. 하드 펄스 길이(P1)를 이전에 보정된 값으로 설정하고 PSYCHE 모양 펄스 길이를 30ms(P40)로 설정합니다(그림 S6).
      알림: 형상 펄스 전력이 자동으로 계산되므로 하드 펄스 값을 보정하는 것이 중요합니다.
    4. PSYCHE 소자에 대한 PSYCHE_Saltire_10kHz_30m 형상 펄스를 선택합니다(그림 S6).
    5. PSYCHE 요소(GPZ10) 중에 적용되는 펄스 필드 구배의 강도를 설정합니다. 그래디언트 모양 펄스(GPNAM 10)에 대해 RECT.1을 선택합니다(그림 S7).
      알림: 약한 자기장 구배는 일반적으로 PSYCHE 요소 중에 적용되며 일반적으로 구배의 최대 강도의 1%에서 4% 사이이며 값은 프로브에 따라 다릅니다.
    6. F2(TD2)에서 SAPPHIRE J 변조 증분 수를 설정합니다(그림 S7).
      참고: 일반적으로 8 증분은 측파대 아티팩트의 탁월한 억제를 보장합니다(그림 2 및 3). 최종 Pure Shift FID의 총 스캔 횟수는 NS*TD2입니다. 23명
    7. F1 및 F2 스펙트럼 창(SW1 및 SW2)을 설정합니다(그림 S5).
      참고 : SW2 = SW3 / (2 * TD2) 및 SW3 / SW1 = TD2 * N은 TD2이고 N은 짝수 정수23입니다. SAPPHIRE-PSYCHE 실험은 F2가 J-커플링 아티팩트 위상 변조를 인코딩하고 F1이 순수 시프트 인터페로그램 획득20을 인코딩하는 의사 3D로 획득됩니다. SAPPHIRE-PSYCHE는 J 변조 측파대를 제거하기 때문에 인터페로그램 Pure Shift 블록 지속 시간은 일반 PSYCHE(Pure Shift 블록 지속 시간 = 1/SW1)보다 일반적으로 20-40ms 더 길 수 있습니다(그림 2). 그러나, 더 긴 청크 데이터 수집은 더 높은 J-커플링 진화로 이어지며,이는 23에 달성된 더 강한 측파대를 제거하기 위해 더 많은 J-커플링 위상 변조 증분을 필요로 할 것이다.
    8. Pure Shift 블록(TD1)의 수를 설정합니다(그림 S7).
      참고: SAPPHIRE-PSYCHE는 첫 번째 블록의 J-커플링 위상 변조를 보상해야 하므로 추가 블록을 획득해야 합니다. 일반적으로 17 (16 + 1) 또는 33 (32 + 1) 블록은 충분한 디지털 해상도23을 제공합니다.
    9. pm_pshift 및 pm_fidadd AU 프로그램을 실행한 후 푸리에 변환23을 실행하여 데이터를 처리합니다.
      참고: 제로 필링(zero filling)과 사인 벨 아포다이제이션(sine bell apodization)을 사용하여 스펙트럼을 변환하는 것이 좋습니다(그림 S4).

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결과

NMR 스펙트럼 분석
PSYCHE 실험은 결합된 공명을 단일항21로 축소하여 스펙트럼 분해능을 증가시키며, 이는 차례로 중복을 줄이고 할당 및 데이터 분석을 용이하게 합니다. Pure Shift NMR은 식물 추출물에 적용할 수 있습니다. 여기에서 우리는 바닐라 잎, 감자 괴경 및 Physalis peruviana 과일의 세 가지 다른 매트릭스에서 그 사용을 보여줍니다. 이러한 식물 추출물의 스펙트럼에서 달성된 분해능 향상은 그림 S8-S11에서 분명합니다.

NMR 신호의 분해능에서 이러한 펄스 시퀀스의 효과를 평가하기 위해, 최대 높이의 10%인W10에서 주파수 단위의 선의 폭을 여러 유형의 공진에 대해 계산하였으며, 모두 바닐라 sp 추출물로 수득된 스펙트럼에서 예시되었다 - 고전적인 1HNMR에 ...

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토론

대사체 구조 식별 및 정량화는 대사체의 특성화에서 핵심 문제이며, 다변수 분석을 통해 연구 중인 생물학적 시스템을 더 잘 이해할 수 있는 데이터입니다. 시료 전처리 및 데이터 수집은 신뢰할 수 있는 결과를 제공하기 위해 최적화가 필요한 중요한 측면입니다.

이 기사에서는 세 가지 다른 식물 매트릭스의 NMR 분석을 위한 샘플 준비를 설명하고 설명합니다. 다른 추출 절차와 마찬가지로 재료 그램당 용매의 양과 선택한 용매의 물리적 특성에 따라 최종 추출물의 화학적 조성과 추출된 대사 산물의 농도가 결정됩니다. NMR 대사체 프로파일링의 경우 pH, 독립적인 샘플 추출 간의 재현성 및 NMR 튜브의 최종 추출물량도 최적화가 필요한 측면입니다. 대사체학에서 재현성의 중요성은 신뢰할 수 없는 결과로 이어질 수 있는 비상관 분산의 도입을 피하는 것입니다. 우리의 경험에 따르면, 건조하고 분쇄된 식물 재료로 최적의 추출 조건을 달성했...

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공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 Consejo Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación Tecnológica (CONCYTEC) - Programa Atracción de Investigadores Cienciactiva - Contract # 008-2017-FONDECYT의 자금 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
77500 시리즈 Freezone 4.5리터 벤치탑Labconco77500
Bruker Avance III 500MHz, 5mm TCI Z-gradient 극저온 프로브장착 Bruker Corporation
Centrivap 냉장 원심 농축기 Labconco 7310000 시리즈Labconco7310000
중수소산화물Sigma-Aldrich151882
그라인더 기계 MKM6003BoschMKM6003
Licuadora 블렌더 8011S 모델 Hgb2wts3WaringHgb2wts3
메탄올 -d4시그마 - 알드리치151947

참고문헌

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