Method Article

인간 만능 줄기 세포 유래 장 및 결장 오가노이드의 생성, 유지 및 특성화

DOI:

10.3791/62721

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July 9th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 인간 만능 줄기 세포 유래 소장 및 결장 오가노이드를 생성, 유지 및 특성화하는 자세한 방법에 대해 설명합니다. 이러한 방법은 재현성을 개선하고, 확장성을 확장하며, 오가노이드의 도금 및 패시징에 필요한 작업 시간을 단축하도록 설계되었습니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

장 부위 사양은 발달 중인 위장관(GI)의 지정된 영역에 고유한 형태와 기능이 부여되는 과정을 설명합니다. 장의 부위 사양화는 뼈 형태 유전 단백질(BMP) 경로를 포함한 여러 발달 경로에 의해 주도됩니다. 정상적인 지역 규격에 기반하여 인간 배아 줄기 세포(hES)와 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 포함하는 인간 만능 줄기 세포(hPSC)에서 인간 결장 오가노이드(HCO)를 생성하는 방법을 개발했습니다. BMP 신호전달의 3일 유도는 중간/뒷장 배양을 인간 결장에 존재하는 모든 주요 상피 세포 유형과 공동 발달 중간엽 세포를 포함하는 특수 AT가 풍부한 염기서열 결합 단백질 2(SATB2) 발현 HCO로 충분히 패턴화합니다. 이 중요한 패터닝 기간 동안 BMP의 누락(또는 BMP 억제제 NOGGIN의 추가)은 인간 장 오가노이드(HIO)의 형성을 초래했습니다. HIO와 HCO는 형태학적으로나 분자학적으로 각각 인간이 발달하는 소장과 결장과 유사합니다. 인간의 장 발달을 연구하기 위한 HIO 및 HCO의 유용성에도 불구하고 HIO 및 HCO의 생성은 도전적입니다. 이 백서에서는 HIO 및 HCO를 생성, 유지 관리 및 특성화하는 방법을 제시합니다. 또한 프로토콜의 중요한 단계 및 문제 해결 권장 사항이 제공됩니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간 대장 발달을 연구하는 것은 인간 태아 조직의 사용에 대한 제한으로 인해 어렵습니다. 동물 모델은 매우 중요하며 역사적으로 장 발달을 연구하기 위해 생쥐의 유전적 접근에 사용되었습니다. 그러나 마우스와 인간의 장 발달 간의 차이로 인해 모델 시스템으로서의 마우스의 적용 가능성은 제한적입니다. 예를 들어, 생쥐의 소장과 결장에서 소낭선 형성은 출생 후에 일어나지만, 인간은 완전히 형성된 소낭선1을 가지고 태어난다. 또한, 인간의 소장과 결장에는 소장에서 모틸린(MLN)을 발현하는 장내분비세포(MLN)를 포함하여 마우스에서 발견되지 않는 세포 유형이 포함되어 있습니다 2 및 결장에서 뮤신 5B(MUC5B)를 발현하는 배상세포 3,4. 이러한 이유로 결장 발달의 초기 단계를 정의하는 동적 분자 이벤트를 정확하게 모델링하는 세포 배양 시스템을 갖추는 것이 중요합니다. 따라서 hPSC가 결장 특성을 가진 세포를 생성하도록 지시하는 것은 인간 결장 발달 연구를 위한 강력한 모델을 제공합니다.

프로토콜은 hPSC로부터 장 유사 오가노이드6 및 결장 유사 오가노이드7의재현 가능5, 동기식 및 효율적인 형성을 촉진하기 위해 개발되었습니다. 이러한 프로토콜은 태아의 장과 결장의 발달을 모방하는 단계적 분화 절차를 사용합니다(그림 1). 첫째, 인간 만능 줄기세포에서 결절(Nodal) 모방물질인 Activin A를 처리하여 최종 내배엽을 생성합니다. 최종 내배엽을 높은 수준의 WNT 및 섬유아세포 성장 인자(FGF)에 노출시키면 CDX2+ 중장/후견인 스페로이드에 형태 형성이 유도됩니다. 그런 다음 중장/뒷장 스페로이드는 세포외 기질(ECM)에 삽입되고 BMP 신호의 일시적인 조작을 통해 HIO 또는 HCO로 패터닝됩니다. NOGGIN을 사용하여 BMP 신호 전달을 억제하거나 성장 배지를 단독으로 추가하면 인간 근위 소장과 유사한 HIO가 형성됩니다.

BMP2를 사용하여 BMP 신호를 활성화함으로써 중장/후장 스페로이드는 상피와 중간엽7에서 패터닝을 유지하는 HCO로 패터닝됩니다. HCO는 결장이 풍부한 MUC5B 발현 배상세포를 함유하고 있으며 결장 특이적 인슐린 유사 5(INSL5) 발현 장내분비세포를 생성할 수 있습니다. HCO에서 분리된 간엽은 호메오박스 A13(HOXA13) 및 HOXD13을 발현하며, 이는 인간 1차 결장 간엽8에서도 발현됩니다. 패터닝 단계는 차별화 프로토콜의 7-10일 동안 발생한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 3일의 기간은 확장된 체외 배양 후에도 유지되는 결장 패턴화를 유도하기에 충분합니다.

아래에 설명된 프로토콜은 피더가 없는 hPSC 배양에 익숙한 연구자를 위한 것입니다. 이러한 유형의 hPSC 배양에 익숙하지 않은 연구자의 경우, Stem Cell Technologies 또는 Cincinnati Children's Hospital의 Prupotent Stem Cell Facility(PSCF)에서 제공하는 것과 같은 hPSC에 대한 교육 과정을 수강하는 것이 좋습니다. 시작 hPSC의 품질은 매우 중요하며 모든 다운스트림 단계에 영향을 미칠 수 있습니다. 다음 프로토콜은 4일 동안 배양되어 분리할 준비가 된 hPSC로 시작합니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 인간 장 및 결장 오가노이드의 생성

  1. ECM 코팅 플레이트 준비
    1. 50mL의 코니컬 튜브에 50mL의 차가운 DMEM 배지를 추가합니다.
    2. -80°C 냉동고에서 hESC 인증 ECM( 재료 표 참조) 4개 부분 표본을 제거하고 얼음에서 해동합니다.
      참고: 제품의 분석 인증서를 참조하여 4x 스톡을 준비하는 데 필요한 ESC 인증 ECM의 부피를 확인하십시오.
    3. hESC 인증 ECM이 완전히 해동되지 않은 경우 50mL 코니컬 튜브에서 750μL의 DMEM을 ECM과 혼합합니다.
    4. DMEM/hESC 인증 ECM 혼합물을 DMEM이 있는 50mL 코니컬 튜브로 옮기고 잘 혼합합니다. 웰당 0.5mL를 4 x 24웰 세포 배양 플레이트 각각에 추가합니다.
    5. 플레이트를 흔들어 ECM을 웰 전체에 고르게 펴서 전체 표면이 덮이도록 합니다. 파라필름을 사용하여 ECM 코팅 플레이트를 밀봉하고 생물 안전 캐비닛에서 최소 1시간 동안 실온에 둡니다. ECM 코팅 플레이트는 4°C에서 최대 2주 동안 또는 필요할 때까지 보관하십시오.
  2. hPSC 단일 셀 도금
    1. ECM 코팅된 24웰 플레이트를 생물 안전 캐비닛 내부에 30분 동안 놓아 실온에 도달하도록 합니다.
    2. mTeSR1 complete medium, cell detachment solution 및 advanced DMEM을 37°C 수조에 넣고 30분 동안 예열합니다.
    3. hPSC가 최소한의 분화로 85% 이상 합류하는지 확인합니다. 필요한 경우 분화된 세포를 제거합니다.
    4. 50mL 원뿔형 튜브에 13mL의 mTeSR1 및 10mM Y-27632 Rho-associated protein kinase(ROCK) 억제제 13μL와 같이 도금 배지를 준비합니다.
      참고: Y-27632는 아노이키스를 억제하고 단세포의 생존을 증가시킵니다.
    5. 6-well plate에서 세포를 수집하려면 3-4well에서 medium을 흡인하고 well당 2mL의 고급 DMEM으로 한 번 세척합니다.
    6. 고급 DMEM을 흡입하고 각 웰에 1mL의 세포 해리 용액을 분주합니다. 5% CO2, 37 °C 인큐베이터에서 5-7분 동안 플레이트를 배양합니다. 현미경으로 세포가 현탁액 상태인지 확인합니다.
    7. 5mL 피펫을 사용하여 4-5회 위아래로 피펫팅하여 남아 있는 세포 덩어리를 해리합니다.
    8. 각 웰에 2mL의 고급 DMEM을 추가하고 위아래로 4-5회 부드럽게 피펫팅한 다음 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 실온에서 3 분 동안 300×g의 세포를 스핀다운합니다.
    9. 세포 펠렛을 흡인하지 않고 튜브에서 배지를 흡입하고 mTeSR1 plus ROCK 억제제의 준비된 배지 6mL를 추가합니다. 위아래로 3-4회 피펫팅하여 세포를 부드럽게 재현탁시킨 다음 50mL 튜브 내부의 나머지 mTeSR1/ROCK 억제제 배지로 현탁액을 옮깁니다. 4-5회 격렬하게 재현탁하고 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.
    10. 세포를 플레이팅하기 직전에 24웰 플레이트에서 ECM을 흡입합니다. 위아래로 2-3회 피펫팅하여 세포를 다시 현탁시키고 각 웰에 0.5mL의 세포 현탁액을 분주합니다.
      참고: 최적의 도금 밀도는 실험자가 결정해야 합니다. 여기서 최적의 세포 수는 웰당 80,000-200,000개의 세포입니다.
    11. 플레이트를 시계 방향으로 3회, 시계 반대 방향으로 3회, 앞뒤로 3회, 좌우로 3회 부드럽게 흔들어 세포를 고르게 분산시킵니다.
    12. 플레이트를 37°C, 5% CO2 인큐베이터로 옮기고 24시간 동안 배양합니다.
      알림: 웰 내에서 세포가 적절하게 분산되도록 처음 몇 시간 동안 플레이트를 방해하지 마십시오.
    13. 24시간 후(그림 2A), 사용한 배지를 흡인하고, mTeSR1 웰당 0.5mL를 추가하고, 37°C에서 다시 배양하고, 24시간 동안 5% CO2 를 배양한 후(그림 2B), 다음 단계로 진행합니다.
  3. 최종 내배엽(DE)과 hPSC의 구별
    1. 15mL 코니컬 튜브에 Activin Day 1 배지 13mL( 재료 표 참조), 100μg/mL Activin A 13μL 및 100μg/mL BMP4 1.95μL를 추가합니다. 37°C 수조에서 매체를 데웁니다.
    2. 24웰 플레이트에서 mTeSR1 배지를 흡입하고 웰당 0.5mL의 Activin Day 1 배지를 추가합니다. 플레이트를 37°C, 5% CO2 인큐베이터에 넣고 24시간 동안 배양합니다. 24시간 후에 셀을 확인하십시오.
      참고: 그림 2C에 표시된 것처럼 광범위한 세포 사멸이 명백해야 합니다. 단층은 희박하게 나타나지만 세포 군집은 확장될 것입니다.
    3. 15mL 원뿔형 튜브에서 12.5μL의 100μg/mL Activin A를 12.5mL의 Activin Day 2 배지에 추가하여 Activin Day 2 complete 배지를 준비합니다. 튜브를 37°C 수조에 넣습니다.
    4. CO2 인큐베이터에서 24웰 분화 플레이트를 꺼내고 사용한 매체를 제거합니다. 웰당 예열된 Activin Day 2 배지 0.5mL를 분주하고 플레이트를 CO2 인큐베이터에 다시 24시간 동안 넣습니다.
      알림: 매체를 분배할 때 주의해야 합니다. 웰 중앙에 배지를 직접 분배하면 단층의 세포가 분리되므로 사용하지 마십시오. 웰 측면 아래로 매체를 조심스럽게 분배합니다. 다음날, 세포의 단층이 형성되어 세포 사멸은 무시할 수 있습니다. 이제 세포는 ~90-95% 융합되어야 합니다(그림 2D).
    5. 15mL 코니컬 튜브에서 12.5mL의 Activin Day 3 배지 12.5mL에 12.5μL의 100μg/mL Activin A를 첨가하여 Activin Day 3 complete 배지를 준비합니다. 튜브를 37°C 수조에 넣습니다.
    6. 사용한 배지를 제거하고 웰당 0.5mL의 Activin Day 3 배지를 분주합니다.
      알림: 매체를 분배할 때 주의해야 합니다. 웰 중앙에 배지를 직접 분배하면 단층의 세포가 분리되므로 사용하지 마십시오. 웰 측면 아래로 매체를 조심스럽게 분배합니다. 다음 날, 단층은 이 단계에서 세포 사멸이 거의 또는 전혀 없이 완전한 합류점에 도달해야 합니다. Activin Day 3 배지를 추가한 후 24시간 동안 단층이 합류하지 않는 경우 mid-hindgut 스페로이드를 생성하려고 시도하지 마십시오. mid-hindgut 스페로이드의 생성을 진행하기 전에 DE 단층의 이상적인 형태에 대해서는 그림 2E 를 참조하십시오.
    7. DE 분화를 최적화할 때 포크헤드 박스 A2 단백질(FOXA2) 및 성 결정 영역 Y(SRY)-박스 전사 인자 17(SOX17)의 발현을 위해 단층의 면역형광(IF) 염색을 수행합니다.
  4. DE를 mid-hindgut 스페로이드로 분화
    1. 50mL 원뿔형 튜브에 FGF4(CHIR99021 없음)가 있는 25mL의 중장 유도 배지를 추가하고 37°C 수조에 30분 동안 넣습니다.
    2. 완전한 mid-hindgut 유도 배지를 준비하려면 배지가 따뜻해진 후 7.5μL의 CHIR99021를 추가합니다.
    3. 사용한 배지를 제거하고 웰당 0.5mL의 mid-hindgut 유도 배지를 분주하고 37°C, 5% CO2 에서 24시간 동안 배양합니다.
    4. 다음날 단층 내 세포의 응축이 발생한 후(그림 3A), 사용한 배지를 새로운 mid-hindgut 유도 배지로 교체하고 플레이트를 37°C, 5% CO2 인큐베이터에 24시간 동안 다시 놓습니다.
      참고: 세뇨관 구조는 그림 3B와 같이 48시간 중부 뒷장 유도 후에 눈에 띄게 나타납니다. 뒷장 중간 스페로이드는 그림 3C에서 볼 수 있듯이 3일째에 단층에서 싹을 틔우기 시작합니다.
    5. 배지를 교체하는 동안 부유 스페로이드가 버려지지 않도록 기존 배지를 15mL 튜브에 옮기고 300×g에서 1 분 동안 원 심분리합니다. 12.5mL의 새로운 mid-hindgut 유도 배지에 스페로이드를 재현탁하고, 동일한 24웰 플레이트에 웰당 0.5mL를 첨가하고, 37°C, 5% CO2 에서 24시간 동안 배양합니다.
    6. 뒷장 유도 4일차(그림 3D)에 배지를 15mL 튜브에 모은 다음 300×g에서 1 분 동안 원 심분리하여 플레이트 웰에서 부유 스페로이드를 수확합니다. ECM에 mid-hindgut 스페로이드를 삽입하기 위한 다음 단계로 진행합니다.
  5. ECM에서 mid/hindgut 스페로이드의 도금 및 패터닝
    1. ECM 기저막 매트릭스를 포매딩 전에 밤새 4°C에서 해동합니다.
      참고: 이 ECM은 hESC 적격 ECM과 다릅니다. ECM은 얼음 위에 올려 놓아야 하며, 얼음 위에서 미리 냉각된 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 적절한 양의 ECM을 분주할 수 있습니다. 표 1 에는 ECM 볼륨에 대한 정보가 포함되어 있습니다. 스페로이드가 삽입될 액적에서 ECM의 부피가 75% 이상인지 확인합니다.
    2. 37°C 인큐베이터에서 24웰 플레이트를 예열합니다.
    3. 1000μL 피펫을 사용하여 모든 24웰에서 부유 스페로이드를 수집하고 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 스페로이드를 300 × g 으로 실온에서 1분 동안 탈수합니다. 대부분의 매체를 흡입하되 도금에 필요한 부피는 남겨 둡니다(표 1).
    4. 1000 μL 및 200 μL 피펫 팁의 끝을 절단하여 준비합니다. 예열된 24웰 플레이트를 꺼냅니다.
    5. 떠 있는 스페로이드를 혼합하고 얼음 위에 놓인 ECM 튜브에 적절한 부피를 옮긴 다음 피펫팅으로 스페로이드와 ECM을 다시 현탁시켜 잘 혼합합니다.
    6. 절단된 200μL 피펫 팁으로 스페로이드와 ECM의 혼합물 65μL를 취하고 24웰 플레이트의 각 웰 중앙에 로드합니다. 양호한 ECM 방울이 형성되도록 하려면 혼합물을 분배하는 동안 피펫을 천천히 들어 올리십시오.
      참고: 웰당 30-100개의 스페로이드를 플레이트화합니다.
    7. 플레이트를 37°C, 5% CO2 인큐베이터로 부드럽게 옮기고 5분 동안 인큐베이트합니다.
    8. 플레이트를 거꾸로 뒤집고 15-25분 동안 배양하면 ECM 액적이 돔과 같은 구조를 유지하는 데 도움이 됩니다.
    9. 배양하는 동안 필요한 배지를 준비하고 예열하십시오. ECM이 응고되면 각 웰에 0.5mL의 HIO- 또는 HCO 패터닝 배지를 추가하고 37°C, 5% CO2에서 배양합니다. ECM의 스페로이드 이미지는 그림 3E 를 참조하십시오.
    10. 패터닝 배지에서 스페로이드를 3일 동안 배양합니다.
    11. 3일 후, HIO- 또는 HCO-패터닝 배지를 정상 성장 배지로 변경하고 37°C, 5% CO2에서 배양합니다.
      참고: 이 시점(10일차)의 오가노이드는 초기 단계의 오가노이드입니다. 프로젝트 목표에 따라 섹션 2에 자세히 설명된 대로 일부 초기 단계의 오가노이드를 초기 패터닝 분석에 사용할 수 있습니다.
  6. 인간 장 및 결장 오가노이드의 성장 및 전달(Outgrowth and Passaging of human intestinal and colonic organoids)
    1. 10일째 이후에는 3일마다 성장 배지를 교체하십시오.
      참고: 도금 밀도와 오가노이드의 성장에 따라 더 빈번한 매체 교체가 필요할 수 있습니다. 매체의 페놀 레드(pH 지시약)가 노란색이 되기 전에 매체 변경을 수행해야 합니다.
    2. 21일차까지 오가노이드를 배양합니다(그림 3F).
      참고: BMP2 처리는 스페로이드에서 자라는 오가노이드의 수를 감소시킵니다(HIO보다 ~3배 적음). 따라서 HCO 생성을 위해 더 많은 수의 스페로이드를 도금해야 합니다.
  7. 21일차에 오가노이드 분할
    1. 오가노이드를 검사합니다.
      참고: 오가노이드는 오가노이드의 성장과 확장으로 인해 ECM이 21일째까지 거의 저하되므로 21일째에 분리해야 합니다.
    2. 1000 μL 및 200 μL 피펫 팁의 끝을 절단하여 준비합니다.
    3. 37°C 인큐베이터에서 24웰 Nunc 플레이트를 예열합니다.
    4. 적절한 부피의 ECM을 미리 냉각된 1.5mL 튜브에 분주합니다(표 1).
    5. 1000μL 피펫 팁으로 오가노이드로 ECM 방울을 부드럽게 긁어내고 혼합물을 위아래로 여러 번 피펫팅하여 ECM을 분해합니다.
    6. 혼합물을 60mm 페트리 접시에 옮기고 현미경으로 오가노이드를 확인합니다. 필요한 경우 멸균 겸자를 사용하여 오가노이드를 서로 분리합니다. 분리로 인해 오가노이드의 상피가 손상되지 않는지 확인하십시오.
    7. 오가노이드를 15mL 코니컬 튜브로 옮기고 300× g 에서 30초 동안 원심분리합니다. 상등액을 흡입하고 튜브에 ~1mL의 배지를 남겨둡니다.
      참고: 매체의 부피는 실험 목적에 따라 변경될 수 있습니다. ECM 액적당 더 많은 오가노이드가 필요한 경우 중간 부피를 줄일 수 있습니다. 그러나 더 적은 수의 오가노이드가 필요한 경우 중간 부피를 늘릴 수 있습니다.
    8. 오가노이드를 잘 혼합하고, 얼음 위에 놓인 ECM 튜브에 적절한 부피를 옮긴 다음, 피펫팅으로 오가노이드와 ECM을 다시 현탁시켜 잘 혼합합니다.
    9. 절단된 200μL 피펫 팁을 사용하여 24웰 플레이트의 각 웰 중앙에 스페로이드와 ECM 혼합물 65μL를 추가합니다.
      참고: 파이펫팅 중에 오가노이드를 먼저 섭취한 다음 ECM을 섭취하는 것이 중요합니다. 따라서 혼합물을 분주하는 동안 오가노이드는 ECM 액적의 상단에 있습니다.
    10. 플레이트를 37°C, 5% CO2 인큐베이터에 5분 동안 넣습니다.
    11. ECM 방울이 돔과 같은 구조를 유지할 수 있도록 15-25분 동안 플레이트를 거꾸로 뒤집습니다.
    12. 각 웰에 0.5mL의 HIO/HCO 성장 배지를 추가하고 37°C, 5% CO2에서 배양합니다.
      참고: 외성장 매체는 패터닝 후 HIO와 HCO 모두에서 동일합니다.
    13. 35일째까지 2-3일마다 매체를 교체합니다(그림 3G).

2. 역전사 정량 중합효소연쇄반응(RT-qPCR)에 의한 오가노이드의 패터닝 검증

  1. RNA를 수집하기 전에 제조업체의 지침에 따라 1x RNA 용해 완충액을 준비합니다.
  2. 사용한 배지를 버리고 350μL의 용해 완충액을 24웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 1mL 피펫을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 오가노이드를 용해합니다. 더 나은 용해를 위해 5초 동안 최대 속도로 잠시 소용돌이칩니다.
  3. RNA 추출 준비가 될 때까지 모든 샘플을 -80°C에서 유지하십시오. 준비가 되면 -80°C 냉동고에서 RNA 샘플을 제거하고 얼음에서 10분 동안 해동합니다. 샘플의 완전한 용해를 보장하기 위해 실온에서 10-15분 동안 튜브를 격렬하게 소용돌이치십시오.
  4. 샘플을 얼음 위에 다시 놓고 제조업체의 지시에 따라 RNA 추출을 진행합니다. RNA 샘플을 -80°C 냉동고로 옮깁니다.다음 단계로 진행할 준비가 되지 않은 경우.
  5. 표준 방법론을 사용하여 RNA 추출, DNAse 처리, cDNA 합성 및 RT-qPCR을 수행합니다. 프라이머 이름 및 염기서열 목록에 대해서는 표 2 를 참조하십시오.

3. 면역형광에 의한 오가노이드의 패터닝 검증

  1. 오가노이드(organoids)의 수집 및 고정
    1. 적절한 웰에서 HIO 또는 HCO 배지를 흡입하고 각 웰에 1mL의 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)를 추가합니다. 절단된 200 μL 피펫 팁을 사용하여 ECM에서 오가노이드를 분리합니다. 피펫을 위아래로 움직여 오가노이드에서 큰 ECM 덩어리를 분리합니다.
    2. 오가노이드를 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 튜브의 나머지 부분을 얼음처럼 차가운 PBS로 채우고 튜브를 뒤집어 부드럽게 혼합합니다. 오가노이드가 중력에 의해 가라앉도록 하고 PBS를 흡인합니다.
      참고: 오가노이드가 중력에 의해 침전되지 않으면 300× g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
    3. PBS를 흡입하고 얼음처럼 차가운 ECM 분해 용액 1mL를 추가합니다. 부드럽게 흔들면서 회전하는 플랫폼에서 튜브를 10-15분 동안 얼음 위에 두십시오.
      참고: 튜브를 45° 각도로 기울여 오가노이드와 세포 회수 용액이 적절하게 혼합될 수 있도록 합니다. 10-15분 후 오가노이드가 튜브 바닥에 가라앉아 ECM이 완전히 분해되었음을 나타냅니다.
    4. 튜브에 차가운 PBS를 최대 15mL까지 추가합니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 잘 섞습니다. 오가노이드가 튜브 바닥에 가라앉으면 PBS를 흡인하고 사전 냉각된 4% 파라포름알데히드 1mL를 첨가하여 오가노이드를 고정합니다. 4% 파라포름알데히드가 함유된 오가노이드를 얼음에서 1시간 동안 배양합니다.
    5. 튜브의 나머지 부분을 얼음처럼 차가운 PBS로 채우고 4°C의 흔들 플랫폼에 수평으로 하룻밤 동안 놓습니다. 다음날, 파라포름알데히드/PBS를 지정된 폐기물 용기에 버리고 3.1.2단계에 설명된 대로 15mL의 얼음처럼 차가운 PBS로 한 번 세척합니다.
    6. PBS를 흡인하고 PBS에 30% 자당을 튜브에 채웁니다. 튜브를 4°C의 흔들 플랫폼에 밤새 수평으로 놓습니다.
    7. 다음 날, OCT 매체가 있는 7mm x 7mm x 5mm 기본 모델에 오가노이드를 삽입하고 드라이 아이스/에탄올 수조를 사용하여 급속 동결합니다.
    8. 실험실용 물티슈로 블록을 말리고 종이 타월로 싸서 -80°C 냉동고에 밤새 보관합니다. 다음 날, 저온 유지 장치를 사용하여 현미경 슬라이드에서 5μm 절편을 절단합니다. 슬라이드는 -80°C에서 보관하십시오.
  2. 오가노이드(organoids)의 면역형광 염색(Immunofluorescence staining)
    1. -80°C 냉동고에서 슬라이드를 처리하고 표준 프로토콜을 사용하여 IF 염색을 수행합니다.
    2. 슬라이드에 커버슬립을 적용하고 이미징 전에 최소 2시간 동안 또는 밤새 빛으로부터 보호된 실온에서 건조시킵니다.
    3. 컨포칼 현미경의 25x 대물렌즈를 사용하여 슬라이드를 이미지화합니다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

중기/후장 유도 단계에서 스페로이드의 성공적인 생성은 성공적인 패터닝을 나타냅니다. 부유 스페로이드 및 단층에서 CDX2에 대한 IF 염색을 수행하여 패터닝이 올바른지 확인합니다. 최종 내배엽(DE) 단계에서의 염색은 DE 유도의 효과를 나타낼 수 있지만, 효율적인 DE 유도 없이는 스페로이드 생성이 불가능합니다. DE 유도의 효율성을 테스트하려면 FOXA2 및 SOX17에 대해 IF 염색 및/또는 RT-qPCR을 수행합니다.

패터닝 단계 후에 HOX 요인의 발현은 성공적인 패터닝의 가장 좋은 지표입니다. HOX 인자는 주로 장 및 결장 간엽에서 발현됩니다 8,9. 따라서 HOX factor 표현식은 중간엽의 패터닝을 반영합니다. 전방 HOX 인자 HOXD3의 mRNA 발현은 NOGGIN 처리 HIO에서 가장 높고, 상피 성장 인자(EGF) 처리 HIO에서 적...

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Discussion

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hPSC를 HIO와 HCO로 구별하는 것은 각 단계에서 품질 관리가 필요한 복잡한 프로세스입니다. 시작 hPSC는 DE로 분화를 시작하기 전에 최소한의 분화가 있어야 합니다. DE 분화를 위해 도금된 hPSC의 밀도를 최적화하는 것은 프로토콜의 성공에 매우 중요합니다. DE 차별화의 품질을 보장하려면 FOXA2 및 SOX17에 대해 IF를 수행하여 DE 차별화의 효율성을 결정합니다. DE 분화로 인해 처리된 세포의 80% 이상이 FOXA2 및 SOX17에 대해 양성으로 염색되어야 합니다. 최적의 밀도가 설정되면 이 동일한 밀도를 유사한 성공을 거둔 여러 실험에 사용할 수 있습니다. 성공적인 DE 분화 후에는 mid/hindgut 유도가 매우 효율적이어야 합니다. ECM에서 도금한 후 BMP2로 중장/뒷장 스페노이드를 패터닝하면 스페로이드의 오가노이드 형성 효율(~15%)이 낮아집니다. 따라서 HCO 생성을 위해 HIO에 비해 ECM 버블당 플레이트가 2-3배 더 많습니...

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Disclosures

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Múnera 실험실은 NIH/NCI 5U54CA210962-02 South Carolina Cancer Disparities Research Center (SC CADRE), NIH/NIGMS P20 GM130457-01A1 COBRE in Digestive and Liver Disease, NIH/NIDDK 1P30 DK123704-01 MUSC Digestive Disease Research Core Center의 지원을 받습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1% 소 혈청 알부민(BSA) 용액해당 사항 없음해당 사항 없음해당 사항 없음
15mL 코닝 튜브송골매21008-918해당 사항 없음
30% 자당해당 사항 없음해당 사항 없음PBS에서 제작되었습니다.
5% 일반 당나귀 세럼잭슨 면역연구소017-000-121해당 사항 없음
50 mL 코닝 튜브송골매21008-951해당 사항 없음
아큐타제써모 사이언티픽A1110501세포 박리 용액; Accutase 5mL를 총 20개의 튜브로 구성된 10mL 튜브에 분취하고 -20 °에서 보관합니다. 최대 6개월 동안 C. 4 °에 놓습니다. C 사용 전 밤새 사용하십시오.
액티빈 A세포 유도 시스템GFH6-100x10동결건조된 분말을 100 & micro로 재구성합니다. 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유한 멸균 PBS의 g/mL. 분취량 38 & 마이크로; L의 액티빈 A를 미리 냉각된 미세 원심분리기 튜브에 넣고 -80 °에서 보관합니다. C(튜브는 수령일로부터 12개월 후에 만료됩니다).
액티빈 1일차 배지(RPMI 1640)코 닝MT10041CV비필수 아미노산(NEAA, Corning 11140050)을 사용하고 4°C에서 보관합니다. 기본 1일차 배지: RPMI 1640 500mL 및 NEAA 500mL. Activin Day 1 배지를 준비할 때, 13 mL의 기본 Day 1 배지, 13 및 micro를 첨가하십시오. l 액티빈 A(100 & micro; g/mL) 및 2 & micro; BMP4의 l(100 & micro; g/mL)를 사용합니다. 기본 배지는 최대 3주 동안 안정적이지만 성장 인자를 첨가한 직후에 사용해야 합니다.
액티빈 2일 배지(RPMI 1640, 0.2% FBS vol/vol)하이클론SH30070.03T비필수 아미노산(Corning 11140050)을 사용하고 4°C에서 보관합니다. 기본 2일차 배지: RPMI 1640 500mL, NEAA 500mL 및 0.2% 혈청 1mL. Activin Day 2 배지를 준비할 때 12.5mL의 기본 Day 2 배지와 12.5 & micro; L의 액티빈 A(100 & micro; g/mL)를 사용합니다. 기본 배지는 최대 3주 동안 안정적이지만 성장 인자를 첨가한 직후에 사용해야 합니다.
액티빈 3일차 배지(RPMI 1640, 2% FBS vol/vol)하이클론SH30070.03T비필수 아미노산(Corning 11140050)을 사용하고 4°C에서 보관합니다. 기본 3일차 배지: RPMI 1640 500mL, NEAA 500mL, 2% 혈청 10mL. Activin Day 3 배지를 준비할 때 12.5mL의 기본 day 3 및 12.5 & micro를 첨가합니다. L의 액티빈 A(100 & micro; g/mL)를 사용합니다. 기본 배지는 최대 3주 동안 안정적이지만 성장 인자를 첨가한 직후에 사용해야 합니다.
Alexa Fluor 488 당나귀 안티 염소써모 사이언티픽A110551:500 희석(2차 항체)
Alexa Fluor 488 당나귀 안티 토끼써모 사이언티픽A212061:500 희석(2차 항체)
Alexa Fluor 546 당나귀 안티 마우스써모 사이언티픽A100361:500 희석(2차 항체)
Alexa Fluor 647 당나귀 안티 마우스써모 사이언티픽A315711:500 희석(2차 항체)
베이스 금형어부22-363-552해당 사항 없음
기본 장 배지(고급 DMEM)깁코12491015  염기성 장 배지를 준비할 때 DMEM 500mL, N2 500mL(Gibco 17-502-048), B27(Gibco) 500mL, L-글루타민 500mL를 첨가하여 2mM L-글루타민(Corning A2916801), 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 5mL(Gibco 15-140-122) 및 7.5mL  15mM HEPES를 얻으려면 1M HEPES가 됩니다.  기본 배지는 최대 3주 동안 안정적이지만 성장 인자를 첨가한 직후에 사용해야 합니다.
Biorad CFX96 터치 실시간 PCR 검출 시스템바이오라드해당 사항 없음다른 qRT-PCR 시스템을 사용할 수 있습니다.
세포 회수 솔루션코 닝354253ECM 성능 저하 솔루션
CHIR99021리프로셀400041010mM에서 2.15mL의 DMSO를 첨가하여 재구성합니다. 50 & 마이크로를 준비합니다. L 분취량 및 -20 °C.  분말을 4도 및 도에서 보관하십시오. C, 빛으로부터 보호됩니다.
CTRL HIO 패터닝 매체해당 사항 없음해당 사항 없음기본 장 배지 및 100ng/mL EGF.
DAPI시그마-알드리치디95421:100 희석(2차 항체)
DE 단층해당 사항 없음해당 사항 없음단층은 이전 단계에서 생성되었습니다(섹션 4.4).
분산깁코17105041동결건조 분말을 Advanced DMEM(Gibco MT15090CV)에 1mg/mL 최종 농도로 재현탁합니다. Millipore 필터 멸균 튜브를 사용하여 진공 청소기로 청소하여 멸균용 용액을 여과합니다. 10mL 분취량(1mg/mL)을 만들고 -20 °에서 보관합니다. 최대 6개월 동안 C. 4 °에 놓습니다. C 사용 전 밤새 사용하십시오.
EGF써모 사이언티픽236-EG-01M100 ng/mL EGF를 준비할 때 500 & micro; 멸균 PBS에서 g/mL. 다음으로 멸균 PBS 2mL를 1mg EGF에 넣고 500 & micro; g/mL EGF 용액. 분취량 100 & 마이크로; 20개의 튜브에 L의 EGF.
Fisherbrand 6cm 페트리 접시(뚜껑 뚜껑 포함)어부FB0875713A해당 사항 없음
피셔브랜드 셀 리프터어부08-100-240해당 사항 없음
Fisherbrand 클래스 B 투명 유리 나사산 바이알(마개 부착 포함)어부03-338B해당 사항 없음
Fisherbrand 일회용 붕규산 유리 파스퇴르 피펫어부13-678-2D0해당 사항 없음
플루오로마운트 G 슬라이드 마운팅 매체VWR100241-874해당 사항 없음
Gibco 고급 DMEM깁코12-491-023해당 사항 없음
염소 항-E-카드헤린R& D 시스템AF6481:400 희석(1차 항체)
염소 항 SOX17R& D 시스템AF19241:500 희석(1차 항체)
HCO 패터닝 매체해당 사항 없음해당 사항 없음기본 장 배지, 100 ng/mL EGF 및 100 ng/mL BMP2. BMP2를 준비할 때 멸균 4mM HCl 0.1% BSA 1mL를 BMP2 바이알(100 & micro; g). 분취량 25 & 마이크로; 4개의 튜브에 있는 BMP4 용액의 L.  기본 배지는 최대 3주 동안 안정적이지만 성장 인자를 첨가한 직후에 사용해야 합니다.
혈구계시그마-알드리치Z359629해당 사항 없음
인간만능줄기세포(hPSC)만능줄기세포 시설해당 사항 없음마트리겔 코팅 24웰 플레이트(Thermo Scientific 73520-906)에 세포를 파종했습니다.
얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드 용액(PFA)해당 사항 없음해당 사항 없음해당 사항 없음
얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)해당 사항 없음해당 사항 없음pH는 7.4여야 합니다.
ImmEdge 소수성 배리어 펜벡터 연구소101098-065해당 사항 없음
유도만능줄기세포(iPSC)만능줄기세포 시설(신시내티 어린이병원 의료 센터)해당 사항 없음다른 hESC 또는 iPSC 라인을 사용할 수 있지만 프로토콜은 각 세포주에 최적화되어야 합니다.
라이카 마이크로톰해당 사항 없음해당 사항 없음해당 사항 없음
LSM 880공초점 현미경
Matrigel 기저막 매트릭스코 닝354234해당 사항 없음
Matrigel hESC 인증 매트릭스코 닝3542774 x 6웰 접시에 충분한 희석 마트리겔을 만들기에 충분한 양에 해당하는 4 x 마트리겔 분취량을 준비합니다.
중간 후장 유도 배지(RPMI 1640)코 닝MT10041CV비필수 아미노산(Corning 11140050), 2% FBS vol/vol(Hyclone SH30070.03T), 3 & micro; M CHIR99021 및 500ng/mL FGF4. 기본 배지는 최대 3주 동안 안정적이지만 성장 인자를 첨가한 직후에 사용해야 합니다.
중간 후장 스페로이드해당 사항 없음해당 사항 없음해당 사항 없음
MilliporeSigma Steriflip 멸균 일회용 진공 필터 장치밀리포어시그마SCGP00525해당 사항 없음
마우스 안티 CDX2바이오제넥스MU392-UC1:300 희석(1차 항체)
마우스 안티 FOXA2아브노바/노부스H00003170-M011:500 희석
mTeSR1 완전 성장 배지줄기세포 기술85870100mL의 mTeSR 보충제(85870)를 하나의 400mL mTeSR 배지(85870)에 첨가하고 오염을 피하면서 50mL 튜브에 분취합니다. 4°에 보관하십시오. C를 사용할 때까지 사용합니다.
머레이의 투명 솔루션(BABB라고도 함)머레이의해당 사항 없음1:2 벤질 벤조에이트 및 벤질 알코올.
NOG HIO 패터닝 매체해당 사항 없음해당 사항 없음기본 장 배지, 100 ng/mL EGF 및 100 ng/mL NOGGIN(Dispose 25 & micro; 250 & 마이크로의 NOGGIN g; l 0.1% BSA를 함유한 멸균 PBS).
뉴클레오스핀 RNA타카라740955.25다른 RNA 분리 키트를 사용할 수 있습니다.
Nunclon 델타 표면 조직 배양 접시 24웰(Nunc)써모 사이언티픽73521-004해당 사항 없음
Nunclon 델타 표면 조직 배양 접시 24웰 코팅 마트리겔써모 사이언티픽73521-004해당 사항 없음
Nunclon 델타 표면 조직 배양 접시 6-웰 (Nunc)써모 사이언티픽73520-906해당 사항 없음
Nunclon 델타 표면 조직 배양 접시 6웰 코팅  마트리겔.써모 사이언티픽73520-906해당 사항 없음
HIO, CTRL HIO 및 HCO를 위한 성장 배지해당 사항 없음해당 사항 없음기본 장 배지 및 100 ng/mL EGF(최종 농도)
인산염 완충 식염수, 0.5% Triton X(PBS-T)해당 사항 없음해당 사항 없음해당 사항 없음
뇌관통합 DNA 기술, Inc.(IDT)해당 사항 없음프라이머는 프로토콜의 표 2에 나열되어 있습니다.
토끼 안티 CDX2셀 마크EPR22764Y1:100 희석(1차 항체)
토끼 안티 SATB2셀 마크281 회1:100 희석(1차 항체)
재조합 인간 BMP-4 단백질R& D 시스템314-BP-010동결건조된 분말을 100 & micro로 재구성합니다. 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유한 멸균 4mM HCl의 g/mL. 4.17mL HCl 용액을 45.83mL 분자수에 첨가하여 총 50mL의 1M HCl에 첨가합니다. 그런 다음 200 & micro를 추가합니다. L 1 M HCl 내의 분자 등급 물 49.8 mL, 총 50 mL의 4 mM HCl. 그런 다음 4mM HCl 50mL에 0.05g BSA를 첨가하고 여과하여 멸균 상태로 만듭니다. 멸균 4 mM HCl 0.1% BSA를 33 마이크로 원심분리기 튜브에 분취하여 -20 &°C에서 보관합니다. 100 µ를 추가합니다. l 멸균 4mM HCl 0.1% BSA를 BMP4 바이알(10 & micro; g) 100 & micro에서 BMP4 용액을 만드는 것; g/mL입니다.
재조합 인간 FGF-4 단백질R& D 시스템235-F4-01M100 & micro에서 재구성; 0.1% 소 혈청 알부민을 함유한 멸균 PBS의 g/mL. PBS 50mL에 BSA 0.05g을 첨가하여 0.1% BSA를 만듭니다. 필터 0.22 & 마이크로; BSA를 멸균하기 위한 M BSA. 5개의 튜브에 0.1% BSA 10mL를 분취합니다. 멸균 0.1% BSA 10mL에 FGF-4 1mg을 첨가합니다. 분취량 250 & 마이크로; L을 미리 냉각된 40개의 미세 원심분리기 튜브에 넣고 -80°C에서 보관합니다.
ROCK 억제제 Y-27632토크리스1254최종 농도는 10mM(10mmol/L)입니다. DMSO에 10mM로 재현탁하고 필터 멸균합니다. 각 바이알에 멸균 PBS 3mL를 추가합니다. 알리쿠트 100 & 마이크로; 30개의 튜브에 L의 ROCK 억제제를 넣고 -20°C에서 보관합니다.
SuperScript VILO cDNA 합성 키트써모 사이언티픽11-754-250해당 사항 없음
SuperFrost Plus 현미경 슬라이드
티슈 텍 OCT 컴파운드VWR25608-930해당 사항 없음

References

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