여기서는 애벌레 4C. 예르간 에서 활성 핵 추출물을 분리하고 체외 시스템에서 전사 활동을 시각화하기 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
Caenorhabditis elegans는 1963년에 도입된 이래 생물학 연구를 위한 중요한 모형 시스템이었습니다. 그러나, C. elegans는 체외 전사 및 DNA 복제와 같은 핵 추출물을 사용하여 생물학적 반응의 생화학 연구에서 완전히 활용되지 않았습니다. 생화학 연구에서 C. elegans를 사용 하 여 중요 한 장애물은 핵 추출 물의 활동을 희생 하지 않고 선충의 두꺼운 외부 큐 티 클을 방해. 여러 가지 방법은 Dounce 균질화 또는 초음파 처리와 같은 표피를 깨는 데 사용되지만 종종 단백질 불안정으로 이어질 수 있습니다. 체외 반응에 대한 애벌레 또는 성인 C. elegans에서 활성 핵 단백질을 격리하기위한 확립 된 프로토콜이 없습니다. 여기서, 프로토콜은 발치 균질화제를 사용하여 애벌레 단계 4 C. elegans의 균질화를 자세히 설명합니다. 발치 균질화는 압력을 사용하여 동물을 천천히 좁은 틈새를 통해 동물을 강제로 밀어 내어 그 과정에서 큐티클을 깨뜨린다. 발치 균질화제의 균일한 디자인과 정밀한 가공은 실험 사이에 동물의 일관된 분쇄를 가능하게 합니다. 발치 균질화로부터 얻은 균질화는 C. 예르건의 전사 활성을 속이는 시험관 내 방법으로 사용될 수 있는 기능적으로 활성 핵 추출물을 산출한다.
서론
작고 자유로운 선충 인 Caenorhabditis elegans 는 광범위한 생물학적 질문을 해결하기위한 간단하면서도 강력한 모델 유기체입니다. 1963년에 도입된 이래, 선충은 신경생물학, 신진대사, 노화, 발달, 면역 및 유전학1에 있는 질문에 대답하는 데 귀중했습니다. 이상적인 모델 유기체를 만드는 동물의 많은 특성 중 일부는 짧은 세대 시간, RNA 간섭의 효과, 투명한 신체 및 세포 혈통과 신경계 의 완성 된지도를 포함합니다.
과학에 대한 선충의 기여는 광대하지만, 그들은 효모, 과일 파리 및 포유류 세포 배양2에서 핵 추출물을 사용하여 연구에서 오는 이러한 메커니즘에 대한 우리의 이해의 대부분과 함께, 진핵 전사 시스템을 해명하기 위해 활용되었습니다. 기능성 핵 추출물추출에서 연구원을 설득하는 가장 큰 장애물은 선충의 거친 외부 표피입니다. 이 외골격은 교차 연결된 콜라겐, 큐티클린, 당단백질 및 지질을 포함하며, 화학적 또는 기계적 힘을 통한 단백질 추출에 내성이 있는 성년기에 이르기까지 C. 엘레간을 만듭니다3. C. elegans 핵 추출물을 이용한 <....
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프로토콜
1. 미디어 준비
- 제조 업체의 지시에 따라 멸균 리소제니 국물 (LB) 한천 플레이트 및 액체 매체를 준비합니다.
- LB 한천 플레이트 에서 연속 에슈리치아 대장균 (대장균) 변형 OP50. 하룻밤 사이에 37°C에서 박테리아 를 배양합니다.
- 인큐베이션 후 4°C에 대장균 OP50 행판을 보관합니다. 대장균 OP50 플레이트는 수분 손실을 방지하기 위해 파라필름에 싸인 경우 2주 동안 4°C로 안전하게 보관할 수 있다.
- 표 1의 레시피를 사용하여 선충 성장 미디어(NGM)의 2L을 준비합니다.
참고: Nystatin은 선택 사항입니다. Nystatin은 NGM 플레이트에서 곰팡이 및 기타 곰팡이 오염이 증가하는 것을 방지하는 데 도움이됩니다. 큰 150mm 직경 플레이트는 대장균 OP50을 붓고 파종하기 위해 뚜껑을 제거할 때 곰팡이 포자를 잡을 확률이 높습니다. Nystatin은 10,000 단위 / mL에서 공급 업체로부터 멸균 용액으로 미리 혼합 구입하거나 멸균 분말로 구입하고 멸균 물과 혼합 할 수 있습니다. Nystatin은 자동 으로 사용할 수 없으며 효과적으로 걸이 로소빙 될 수 없습니다. 실험실....
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결과
설명된 단계에 따라 기능성 핵 추출물 (그림 1)을 산출해야 하며, 연삭 또는 세척 단계의 편차는 활동이 좋지 않거나 수율이 낮을 수 있습니다. 기능성 C. elegans 핵 추출물이 얻어지면, 이전에 기술된 시험관 분석 에 추가될 때 DNA 템플릿상CMV 프로모터의 하류 영역을 전사한다. 결과 RNA 전사체는 종래의 방법을 사용하여 핵 단백질 및 DNA 템플릿으로부터 정제될 수 있다. 템플릿 DNA없이, 역 전사 및 후속 PCR 제품은 핵 추출물에 의해 전사 된 RNA의 결과일 수 있습니다. PCR 제품은 아가로즈 젤상에서 시각화될 수 있으며, DNA 대역의 강도는 핵단백질 및 RNA 절연의 품질을 나타낼 수 있다. 약한 대역 강도는 열 또는 완충 제고불량에 의해 핵 추출물의 불활성화에 의해 발생할 수 있다. 지나치게 강한 대역 강도는 RNA 정화 불량 또는 부적절한 DNase 소화.......
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토론
C. elegans 는 저비용 유지 보수와 유전 조작의 용이성 으로 인해 진핵 전사 시스템을 연구하는 매력적인 모델 유기체입니다. 여기서 L4 C. elegans 로부터 기능적으로 활성 핵 추출물의 일관된 절연을 위한 프로토콜이 설명된다. 이 프로토콜은 전사 활성을 시각화하는 데 초점을 맞추고 있지만, 전사 후 생성된 cDNA는 RT-qPCR을 사용하여 전사 활성8의 보다 정밀한 측정을 얻을 수 있다. C. elegans 에서 핵 단백질을 분리하는 이 방법은 진핵 전사 기계의 연구를 확장하는 데 도움이 될 수 있습니다. C. elegans 는 요리나 효모 식민지에 있는 세포의 문화가 아니라 자유 로밍 동물이기 때문에 핵 추출물을 고립시키고 연구하는 것은 전사 기계가 시간이 지남에 따라 또는 다양한 환경에서 어떻게 변할 수 있는지에 대한 명확한 통찰력을 줄 수 있습니다. 이를 통해 연구자들은 C. elegans
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공개 사항
저자는 공개 할 경쟁 이익이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 NIH MIRA 보조금 (J.S.에 R35GM124678)에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Consumables and reagents | |||
| 0.2 mL 8-Strip 튜브 & 플랫 스트립 캡, 클리어 | Genesee Scientific | 24-706 | |
| 0.2 mL 개별 PCR 튜브 | Genesee Scientific | 24-153G | |
| 1.7 mL 멸균 마이크로튜브 | Genesee Scientific | 24-282S | |
| 100% 절대 분자 등급 에탄올 | Fisher Scientific | BP2818 | |
| 100% 에탄올, Koptec | Decon Labs | V1001 | |
| 10 mL 혈청학적 피펫 | VWR international | 89130-898 | |
| 150mm 페트리 플레이트 | Tritech Research | T3325 | |
| 15 mL 원추형 원심분리기 튜브 | Genesee Scientific | 28-103 | |
| 20 mL 플라스틱 주사기 | Fisher Scientific | 14955460 | |
| 2 mL Norm-Ject 주사기 | Henke-Sass Wolf GmbH | 4020 | |
| 500 mL 진공 필터 컵 0.22 µ m PES, Stericup Millipore Express Plus | Millipore Sigma | SCGPU10RE | |
| 50 mL 원추형 원심분리기 튜브 | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| 50 mL 혈청학 피펫 | VWR international | 89130-902 | |
| 5 mL 혈청학적 피펫 | VWR 국제 | 89130-896 | |
| 한천, Criterion | VWR International | C7432 | |
| 아가로스 | 덴빌 사이언티픽 | CA3510-6 | |
| 알코올 방지 마커 | VWR International | 52877-310 | |
| Bacto 펩톤 | VWR International | 90000-264 | |
| Caenorhabditis elegans | CGC | N2 | |
| 칼슘 디클로라이드 | Millipore Sigma | C4901 | |
| 콜레스테롤 | 밀리포어 시그마 | C8667 | |
| 통제 DNA 사원 클로닝 뇌관, 앞으로 5'- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3' | |||
| 통제 DNA 사원 클로닝 뇌관, 앞으로 5' - aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3' | |||
| 탈이온수 | |||
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| DNA 겔 염색, SYBR 안전 | Invitrogen | S33102 | |
| DNA 래더 믹스, O' 유전자 통치자 | 피셔 사이언티픽 | SM1173 | |
| DNA 로딩 염료, 6x TriTrack | Fisher Scientific | ||
| DNase, Baseline-ZERO | Lucigen | ||
| 드라이 아이스 | |||
| Escherichia coli OP50 균주 | CGC | OP50 | |
| 빙하 아세트산 | Fisher Scientific | A38 | |
| 글리세롤 | 밀리포어 시그마 | G6279 | |
| HeLa 핵 추출물 체외 전사 시스템, HeLaScribe | Promega | E3110 | |
| 헤페스 용액, 1 M Gibco | 밀리포어 시그마 | 15630080 | |
| 염산 37% | 밀리포어 시그마 | P0662 | |
| 차아염소산염 표백제 | Clorox | ||
| LB 육수 | Millipore 시그마 | L3022 | |
| 마그네슘 디클로라이드 | 밀리포어 시그마 | M8266 | |
| 황산 마그네슘 | 밀리포어 시그마 | M7506 | |
| 중형 접시 | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
| 현미경 슬라이드, Vista vision | VWR International | 16004-368 | |
| 분자 등급 물, Hypure | Hyclone Laboratories | ||
| 니스타틴 | 밀리포어 시그마 | N1638 | |
| PCR 시스템, 프리믹스 A Lucigen을 사용한 FailSafe | |||
| FS99100 염화칼 | Millipore Sigma | P39111 | |
| 인산칼륨 이염기성 | 밀리포어 시그마 | P3786 | |
| 인산칼륨 일염기성 | 밀리포어 시그마 | P0662 | |
| 프로테아제 억제제, 일회용 칵테일 100x | ThermoFisher Scientific | 78430 | |
| 단백질 분석 키트, Qubit | ThermoFisher Scientific | Q33211 | |
| 역전사 키트, Sensiscript | Qiagen | 205211 | |
| RNA 추출 키트 RNeasy 마이크로 키트 | Qiagen | 74004 | |
| RNase 억제제 | 응용 바이오시스템 | ||
| 염화나트륨 | VWR International | BDH9286-12KG | |
| 수산화나트륨 | 밀리포어 시그마 | 1-09137 | |
| 0.2 µ를 이용한 멸균 주사기 필터; m 폴리에테르설폰 멤브레인 | VWR 국제 | 28145-501 | |
| 자당 | VWR 국제 | 200-334-9 | |
| 전사 프라이머, 앞으로 5'- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3' | |||
| 전사 프라이머, 리버스 5'- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3' | |||
| 트리스 베이스 | 피셔 사이언티픽 | BP152 | |
| Tween20 | 밀리포어 시그마 | P2287 | |
| 장비 | |||
| -20 ° C 인큐베이터 | ThermoFisher Scientific | ||
| 20 ° C 인큐베이터 | ThermoFisher Scientific | ||
| 37 ° C 인큐베이터 | Forma Scientific | ||
| 4 ° C 냉장고 | ThermoFisher Scientific-80 | ||
| ° C freezer | Eppendorf | ||
| Autoclave | Sanyo | ||
| Balch, 균질화기, isobiotec 세포 균질화기, | Isobiotec | ||
| Benchtop Vortexer | Fisher | Scientific | |
| 원심분리기, Eppendorf 5418 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| 원심분리기, VWR Clinical 50 | VWR International | 82013-800 | |
| 해부 현미경, Leica M80 | Leica Microsystems | ||
| 형광계, Qubit 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Gel 이미징 시스템, iBright FL1500 | ThermoFisher Scientific | A44241 | |
| 젤 시스템 | , ThermoFisher Scientific | ||
| 열 블록 | VWR International | , 12621-048 | |
| 마이크로 원심분리기, Eppendorf 5424 | Eppendorf | 22620401 | |
| PIPETBOY acu 2 | Integra | 155017 | |
| 피펫, L-1000, XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014382 | |
| 피펫 L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014388 | |
| , 피펫 L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014391 | |
| 피펫 L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014392 | |
| Rocking platform | VWR International | ||
| Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro | Eppendorf | 950030010 |
참고문헌
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Blackwell, T. K., Walker, A. K. Transcription mechanisms. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-16 (2006). ....
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재인쇄 및 허가
