죽상동맥경화증에서 내피 투과성 및 (Dys)기능에 대한 정량적 MRI

Summary

우리는 qMETRIC이라는 자기 공명 영상(MRI)을 사용하여 동맥의 내피 투과성 및 기능 장애를 정량화하기 위해 정확하고 비침습적이며 사용하기 쉬운 방법을 개발했습니다. 이 기술을 사용하면 전임상 모델 및 인간에서 죽상동맥경화증과 관련된 혈관 손상 및 심혈관 위험을 평가할 수 있습니다.

Abstract

심혈관 질환은 전 세계적으로 주요 사망 원인입니다. 투과성/누출성 및 기능 장애 내피는 혈관 손상의 가장 초기 지표로 간주되며 죽상 동맥 경화증을 유발하는 것으로 생각됩니다. 생체 내에서 이러한 변화를 확인하는 방법은 임상에서 바람직할 것입니다. 자기공명영상(MRI) 기반 도구 및 기타 기술을 통해 심혈관 질환에서 내피의 역할과 생체 내 위험에 대한 심층적인 이해를 할 수 있었습니다. 그러나 단일 이미징 연구에서 내피 손상을 반영하는 정량화 가능한 데이터를 추출하기 위한 재현 가능하고 간단한 접근 방식이 필요합니다. 동맥 내피 손상(누출/투과성 및 기능 장애)에 대한 두 가지 이미징 바이오마커의 정량화를 가능하게 하는 이미지를 획득하고 분석하기 위해 비침습적이고 구현하기 쉬우며 정량적인 MRI 워크플로우가 개발되었습니다. 여기서, 프로토콜은 임상 MRI 스캐너를 사용하여 죽상경화성 ApoE^-/- 마우스의 상완두동맥에 이 방법을 적용하는 방법을 설명합니다. 먼저, 알부민 결합 프로브를 사용하여 내피 누출을 정량화하기 위한 LGE(Late gadolinium Enhancement) 및 MOLLI(Modified Look-Locker Inversion Recovery) T1 매핑 프로토콜에 대해 설명합니다. 둘째, 아세틸콜린에 대한 반응으로 내피 기능 장애를 측정하기 위한 해부학적, 정량적 혈류 염기서열을 설명합니다. 중요한 것은 여기에 설명된 방법을 통해 큰 체적 범위를 가진 고해상도 3D 이미지를 획득하여 선박 벽 구조를 정확하게 분할하여 관찰자 간 및 관찰자 내 변동성을 개선하고 신뢰성과 재현성을 높일 수 있다는 것입니다. 또한 복잡한 운동 모델링을 위한 고속 해상도가 필요 없는 정량적 데이터를 제공하여 모델에 독립적이며 이동성이 높은 혈관(관상 동맥)의 이미징도 가능합니다. 따라서 이 접근 방식은 데이터 분석을 단순화하고 신속하게 처리합니다. 마지막으로, 이 방법은 다양한 스캐너에서 구현할 수 있고, 다양한 동맥층을 이미지화하도록 확장할 수 있으며, 인간에게 임상적으로 적용할 수 있습니다. 이 방법은 정밀 의학 접근법을 채택하여 죽상동맥경화증 환자를 진단하고 치료하는 데 사용할 수 있습니다.

Introduction

심혈관 질환(CVD)은 전 세계적으로 사망률 및 이환율의 주요 원인으로 사망의 약 1/3을 차지하며¹ 의료 시스템에 높은 재정적 비용을 초래하는 평생 장애의 원인입니다¹. CVD 중 허혈성 심장 질환 및 뇌졸중은 주로 죽상경화성 플라크에 의해 발생합니다. 죽상동맥경화증은 복합적인 질병입니다. 그러나 일반적인 특징은 혈관 내피 세포의 조기 손상으로 인해 죽상 경화증이 형성되고 진행되며 결국 합병증이 발생한다는 것입니다. 온전한 혈관 내피는 근본적인 혈관 보호 특성을 가지고 있습니다². 내피는 전신 순환과 혈관 벽 사이의 세포와 분자의 전좌를 제어하여 혈관 투과성을 조절합니다. 혈관 확장제(예: 산화질소, 프로스타시클린)와 혈관 수축제(예: 엔도텔린-1, 안지오텐신 II)의 생산의 균형을 유지하여 혈관 긴장도를 조절합니다. 또한 항응고 특성이 있습니다. 그러나 내피 세포의 기능과 투과성은 심혈관 위험 요인(예: 흡연, 고콜레스테롤, 당뇨병, 전신 염증, 산화 스트레스)의 존재 및 혈류의 혈역학적 패턴에 의해 저하될 수 있습니다. 기능 장애를 일으킨 내피는 스트레스 요인에 대한 반응으로 혈관 확장을 감소시켜 결과적으로 동맥 경직도를 증가시킵니다. 또한, 투과성/누출성 내피는 인접한 세포 ^3,4,5,6,7 사이의 단단한 간극 연접을 넓혔습니다. 이러한 변화는 내강내피(luminal endothelium)와 새로 형성된 플라크(plaque) 미세혈관 모두에서 발생하며, 이는 연약하고, 누출되며, 이형적으로 보인다⁸. 투과성 내피 세포는 혈장 매개 분자 및 세포의 진입점 역할을 하여 심혈관 질환의 위험을 악화시킵니다.

이러한 지식을 바탕으로 지난 15년 동안 내피 투과성 및 기능은 심혈관 질환 위험이 있는 피험자를 더 잘 진단하고 알려지거나 새로운 약물의 효과를 평가하기 위한 유망한 이미징 및 치료 대상으로 부상했습니다. 그러나 내피 기능의 직접적이고 정량적인 영상은 제한적입니다 ^9,10,11,12. 현재 생체 내 내피 기능에 대한 해석의 대부분은 임상적 사건을 유발하는 혈관 침대의 죽상 경화증 부담과 기능이 완만한 상관관계가 있는 말초 혈관의 내피 의존성 확장(FMD)에 대한 연구를 기반으로 합니다 13,14,15. 제한된 수의 영상 연구만이 생체 내에서 내피 기능 장애와 죽상 동맥 경화증 부담 사이의 직접적인 연관성을 보여주었습니다 ^9,10,11,12. 반대로, 접근성이 더 높은 MRI 기반 접근 방식은 영상 내피 투과성을 더 광범위하게 가능하게 했습니다. MRI 가돌리늄 제제 투여 후 혈관 벽 신호 증진 퍼센트를 사용하여 내피 투과성의 반정량적 측정을 제공했습니다^16,17. 나중에, DCE(Dynamic Contrast-Enhanced) 프로토콜의 개발로 혈관 내피 투과성을 개선하고 정량적으로 측정할 수 있게 되었습니다. 키네틱 모델링에서 도출된 조영제 유출률(K^trans) 및 미세혈관 부피(Vρ) 또는 곡선 아래 면적(AUC), 오르막, 피크까지의 시간, 비모델링 방법에서 추출한 피크 농도와 같은 정량적 매개변수는 내피 투과성뿐만 아니라 플라크 혈관성과도 상관관계가 있었다 18,19,20. 그러나 혈관 DCE의 적용은 다음과 같은 이유로 상당한 기술적 발전에도 불구하고 여전히 어렵습니다: (i) 혈관 벽의 정확한 묘사를 위해 높은 공간(0.5-0.7mm2)과 시간 해상도²¹이 모두 필요합니다. 동맥 입력 함수를 계산하기 위해 혈액 내 조영제의 농도를 샘플링하는 것은 또한 운동 모델링을 필요로 하며, 이는 시간적 해상도를 얻기 위해 해부학적 범위를 제한^22,23하거나 그 반대의 경우도 마찬가지입니다^24,25; (ii) 데이터 분석에는 복잡한 약동학 모델링이 필요할 수 있습니다(예: Patlak 대 Tofts). (iii) 제한된 이미지 품질, 낮은 스캔 재스캔 재현성, 평균 관찰자 간 및 관찰자 내 변동성^{제공 26,27}. 따라서 단일 이미징 연구에서 내피 투과성 및 (dys) 기능에 대한 직접적이고 정량화 가능한 데이터를 추출하기 위한 재현 가능하고 간단한 접근 방식이 여전히 필요하며, 이는 더 나은 임상적 유용성을 가질 수 있습니다.

여기에서는 한 번의 스캔으로 죽상동맥경화증의 전임상 모델을 사용하여 동맥 내피 손상의 두 가지 마커(누출/투과성 및 기능 장애)를 직접 정량화할 수 있는 이미지를 획득하고 분석하기 위해 비침습적이고 구현하기 쉬운 정량적 MRI를 개발했습니다. 이 방법은 Q, uantitative, M, RI, of E, ndoT, helial pe,R, meab,Ility 및 dysfunCtion(qMETRIC)으로 명명됩니다. 여기에는 혈관 내 알부민 결합 프로브를 투여한 후 내피 누출을 정량화하기 위해 후기 가돌리늄 향상(LGE) 및 MOLLI(Modified Look-Locker Inversion Recovery) T1 매핑 프로토콜을 획득하는 것이 포함됩니다. 아세틸콜린 볼루스에 대한 반응으로 내피 기능 장애를 측정하기 위한 해부학적 및 정량적 혈류 염기서열 획득. 우리는 qMETRIC이 죽상동맥경화증의 중증도와 합병증의 위험을 정확하게 감지한다는 것을 입증했습니다. 치료 반응; 환자 ^5,6,7에서 사용하도록 조정할 수 있습니다. 중요한 것은 여기에 설명된 방법을 통해 고공간 해상도 이미지를 획득하여 혈관 벽을 정확하게 분할하여 관찰자 간/관찰자 내 편향을 최소화하고 큰 해부학적 적용 범위로 신뢰성과 재현성을 높일 수 있다는 것입니다. 마지막으로, 이 방법은 다양한 스캐너에서 사용하도록 조정할 수 있으며 다양한 동맥층(심지어 관상 동맥)을 이미지화하도록 확장할 수 있습니다²⁸). 간단한 워크플로우를 통해 심혈관 영상 커뮤니티에서 이 접근 방식에 더 쉽게 접근할 수 있습니다.

Protocol

이 연구의 모든 구성 요소는 1986년 영국 동물(과학적 절차)법에 따라 King's College London Ethical Review Panel의 승인을 받아 수행되었습니다.

실험 워크플로우는 그림 1에 요약되어 있습니다.

1. 동물 준비

1. ApoE^-/- 생쥐에게 라드에서 추출한 지방 21%와 콜레스테롤 0.15%(wt/wt)를 최대 12주 동안 평균 섭취한 고지방 식단을 먹이면 죽상동맥경화증을 유발할 수 있습니다.
2. 29G의 바늘 인슐린 주사기에 적절한 양의 조영제(gadofosveset trisordium)를 주입하여 0.03mmol/kg의 용량을 달성합니다. 주입량을 50-150μL 사이로 유지하십시오.
3. 37°C로 설정된 가열 패드에 케이지를 올려 동물을 예열하고 체온을 유지합니다.
4. 흡수성 조직이 늘어선 인덕션 박스에 마우스를 넣어 마취를 유도합니다. 약 3-5분 동안 O₂ 의 1L/분에서 유량계를 3%-5%의 이소플루란으로 조정합니다.
   참고: 분당 70회 호흡(bpm) 미만으로 감소해야 하는 느린 호흡 속도를 식별하여 올바른 마취 깊이를 확인하십시오.
5. 발가락 꼬집기 방법을 사용하여 마취를 확인합니다(즉, 발가락 꼬집음에 대한 금단 반사 상실). 동물을 홀더에 옮기고 코를 콧방울 모양에 넣습니다. 동물의 체온을 유지하기 위해 홀더를 가열 패드에 올려 놓습니다.
6. 홀더의 마취 공기 흐름을 O₂의 1L/분에서 1%-2% 이소플루란으로 설정하여 코를 통해 전달되는 마취를 유지합니다.
7. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 동물의 눈에 수의사 연고를 바르십시오.
8. 동물을 엎드리거나 옆으로 눕히고 알코올 면봉으로 꼬리를 닦습니다. 두 개의 꼬리 정맥 중 하나를 찾습니다. 필요한 경우 UV 램프로 꼬리를 워밍업하여 꼬리 정맥이 더 잘 보이도록 합니다.
9. 29G 인슐린 바늘을 바늘의 경사가 위를 향하도록 정맥과 평행하게 삽입합니다. gadofosveset trisodium이 들어있는 미리 채워진 주사기의 부피를 부드럽게 주입합니다. 바늘을 빼낸 후 주사 부위에 출혈이 없는지 확인하십시오.
10. gadofosveset가 순환할 때까지 30초 동안 기다린 다음 마우스를 MRI 침대로 옮깁니다.

2. MRI 스캐너 준비( 그림 1 참조)

1. MRI 테이블을 흡수성 티슈로 덮습니다.
2. MRI 침대에 MRI 단일 루프 수신기 코일을 놓습니다. 플랫폼을 사용하여 수신기 코일을 올리고 수신기 코일과 MRI 테이블 사이의 직접적인 접촉을 피하십시오.
3. 수술용 테이프를 사용하여 코일을 플랫폼에 고정합니다.
4. 순환 가열 펌프에 연결된 튜브를 코일 주위에 놓고 고정하고 이미징하는 동안 동물의 체온을 유지하기 위해 37°C로 설정합니다.
5. 마취 전달 튜브를 MRI 스캐너의 구멍에 넣고 노즈 콘이 동물의 머리가 놓일 수신기 코일의 끝에 도달하도록 테이프로 붙입니다.
6. 인보어 카메라를 켜서 콘솔룸에서 동물을 모니터링하세요.
7. MRI 콘솔룸에서 소프트웨어 인터페이스를 사용하여 동물(환자)에 대한 새로운 연구를 시작합니다.

3. MRI 스캐너에서의 동물 위치 파악 및 모니터링( 그림 2 참조)

1. 마취된 동물을 스캐너실로 옮깁니다. 마우스를 리시버 코일의 엎드린 위치에 놓고 마취를 유지하기 위해 주둥이가 콧방울에 맞는지 확인합니다. 마취 기류를 O₂의 1L/분에서 1%-1.5% 이소플루란으로 돌립니다.
2. 동물의 심장과 목 부위가 수신기 코일의 중앙에 위치하도록 MRI 코일에 동물을 올려 놓으십시오.
3. 마우스의 코를 플랫폼의 노즈콘, 복부, 꼬리에 테이프로 고정합니다.
4. 앞발과 뒷발에 4개의 전극을 놓고 발가락 손바닥이 완전히 열려 심전도(ECG)를 기록하는지 확인합니다. 전도성을 향상시키기 위해 ECG 패드를 부착하기 전에 마우스의 발에 ECG 전도성 젤을 사용하십시오.
5. 테이프를 사용하여 전극을 플랫폼에 단단히 부착하십시오.
6. 스캐너 침대의 레이저를 심장의 기저부(근위부)에 맞춥니다. 쇄골과 앞쪽 발 라인을 랜드마크로 사용합니다. 자동 MR 테이블을 사용하여 동물을 자석의 등심원에 배치합니다.

4. MRI 이미지 계획 및 획득

1. 스카우트 스캔을 시작하여 MRI 시스템에 대한 표준 보정을 실행합니다.
2. ECG의 R-파를 감지하도록 모니터링 장비를 설정합니다. 각 마우스와 이미징 세션 내에서 임계값을 조정하여 신뢰할 수 있는 트리거링이 이루어지도록 합니다.
   알림: 깊은 마취 상태에서 마우스의 심장 박동 주파수는 일반적으로 분당 400-600회(bpm) 사이입니다.
3. 3D 그라디언트 에코 스캔(GRE)을 획득하여 다중 평면 파일럿 이미지(스카우트 이미지)를 얻고 나머지 스캔을 계획합니다(MRI 획득 매개변수는 표 1 참조, 계획은 그림 3 참조).
4. 스카우트 이미지, 특히 코로나 뷰에서 심장을 유동 아티팩트로 가장 쉽게 식별할 수 있습니다.
   알림: 이미지에 마우스가 코일 또는 등심원의 중앙에 잘 있지 않은 것으로 표시되면 베드를 집어넣고 위치를 반복하십시오.
5. 8mm 시야(FOV)로 심장 기저부에서 목 및 경동맥을 향해 연장되는 횡평면에서 3D 조영제 강화 MR 혈관 조영술(MRA) 스캔(MRA 판독 스캔은 표 1 참조, 계획은 그림 3 참조)을 계획합니다.
6. MIP(Maximum Intensity Projection) 이미지를 사용하여 대동맥궁, 상완두동맥 및 경동맥을 시각화하고 후속 후기 가돌리늄 향상(LGE), T1 매핑 및 시네 스캔을 계획합니다(대표 이미지는 그림 3 참조).
   참고: 이미징 볼륨의 수준이 정확하지 않으면 슬라이스를 근접 또는 원점으로 이동하여 획득을 반복합니다.
7. 내피 투과성을 측정하기 위한 MRI 이미지 획득.
   1. 이전에 획득한 MIP 및 횡방향 MRA 이미지를 사용하여 상행 대동맥 또는 경동맥에 수직인 단일 슬라이스 2D-Look-Locker(LL) 획득을 계획합니다(MRI 획득 매개변수는 스캔은 표 1 , 대표 이미지는 그림 3 참조).
   2. 시뮬레이션된 ECG 신호를 사용할 때 심박수를 60bpm으로 설정하거나 블랭킹 기간을 설정하여 기록된 ECG 신호를 사용할 때 후속 반전 회복 펄스 사이의 반전 회복 펄스가 1000ms가 되도록 합니다.
   3. Look-Locker 이미지를 사용하여 LGE 스캔에 필요한 혈액 신호 널링에 대한 최적의 반전 시간(TI)을 결정합니다.
   4. LGE 이미징: gadofosveset 주입 20-30분 후 및 LL 스캔 직후(4.7.1-4.7.3 단계에서 설명) 반전-복구 3D 고속 구배 에코 시퀀스를 사용하여 LGE 스캔을 획득합니다(MRI 획득 매개변수는 표 1 참조, 대표 이미지는 그림 3 참조).
   5. 위의 MRA와 동일한 형상을 사용하여 발-머리 방향으로 8mm 시야(FOV)를 가진 심장 기저부(대동맥근의 일부 포함), 상완두동맥(대동맥근에서 쇄골하 분기점 사이) 및 경동맥의 일부를 덮도록 횡방향 3D 고속 구배 에코 LGE 스캔을 계획합니다(대표 이미지는 그림 3 참조).
   6. 시뮬레이션된 ECG 신호를 사용할 때 심박수를 60bpm으로 설정하거나 기록된 ECG 신호를 사용할 때 LGE 스캔에 대해 1000ms마다 연속 반전 회복 펄스가 발생하도록 블랭킹 기간을 설정합니다(위의 4.7.2단계 참조).
      알림: 이것은 연속적인 반전 회복 펄스 사이의 자화의 일관되고 심박수와 무관한 회복에 중요합니다.
   7. Look-Locker에서 얻은 T1을 Contrast > Inversion Delay의 LGE 시퀀스에 삽입합니다.
   8. T1 매핑 이미징: 3D 고속 그래디언트 에코 획득을 사용하여 gadofosveset 주입 후 45분 후에 횡방향 T1 매핑 이미지를 획득합니다. 위의 LGE 스캔과 동일한 방향 및 형상으로 시퀀스를 계획합니다(MRI 획득 매개변수는 표 1 참조, 대표 이미지는 그림 3 참조).
   9. 시뮬레이션된 ECG를 사용할 때 심박수를 120bpm으로 설정하거나, 기록된 ECG 추적을 사용할 때 두 이미징 트레인 간의 반전 회복 펄스가 500ms마다 발생하도록 블랭킹 기간을 설정합니다.
      참고: T1 매핑 시퀀스는 반전 시간이 20-2000ms 사이인 2개의 비선택적 반전 펄스를 사용한 다음 8개의 개별 이미지에 대해 8개의 세그먼트 판독을 사용합니다. 두 이미징 트레일의 조합으로 인해 다양한 반전 시간을 가진 슬라이스당 총 16개의 이미지가 생성됩니다. 이미지는 3개의 매개변수가 있는 맞춤 모델을 사용하여 스캐너에서 자동으로 재구성됩니다. T1 파라메트릭 맵을 생성하는 데 사용되는 방정식은 다음과 같습니다.
      
      
8. 내피 기능을 측정하기 위한 MRI 이미지 획득
   1. 식염수에 희석 된 아세틸 콜린 용액을 준비합니다. 29G 바늘 인슐린 주사기에 적절한 양의 용액(16.6mg/kg)을 로드합니다. 주입량을 50-150μL 사이로 유지하십시오.
   2. 횡방향 MRA 및 해당 MIP 이미지를 사용하여 상완두동맥을 가로질러 대동맥근과 쇄골하 분기점 사이의 횡방향 슬라이스를 배치합니다(대표 이미지는 그림 3 ).
   3. 후향적 ECG 게이팅과 함께 횡방향 2D 구배 에코(GRE)를 사용하여 상완두동맥의 시간적으로 분해된 cine 이미지를 획득합니다(MRI 획득 매개변수는 표 1 참조, 대표 이미지는 그림 3 참조).
   4. 각 동물의 심박수에 맞게 최대 심장 위상 수를 조정합니다.
      참고: 일반적으로 14개의 심장 단계는 충분한 시간적 해상도를 제공합니다.
   5. 기준선 이미지를 획득한 후 MRI 스캐너실로 들어갑니다. 마우스가 스캐너에서 마취되는 동안 아세틸콜린을 복강내(IP)로 부드럽게 주입합니다. 코일에서 마우스를 움직이지 마십시오.
   6. 심박수가 안정화될 때까지 6-10분 동안 기다렸다가 획득을 반복합니다.
   7. 이미징 절차가 끝나면 마우스를 케이지로 되돌리고 복구를 위해 케이지를 가열 패드에 놓습니다.
      참고: 생쥐는 흉골 누운 상태를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복하면 회복됩니다.
   8. 획득한 이미지를 DICOM(Digital Imaging and Communications in medicine) 형식으로 내보내고 개방형 플랫폼 이미지 분석 소프트웨어를 사용합니다.

5. MRI 세분화 및 데이터 분석( 그림 4 참조)

1. Dicom 파일을 오픈 플랫폼 소프트웨어의 데이터베이스로 끌어다 놓아 모든 이미지를 로드합니다.
2. LGE 이미지를 사용하여 혈관 벽의 대비 흡수를 시각화하고 내피 세포 누출의 대리 마커로 강화 영역을 계산합니다.
3. MRA 및 반전 복구 검사를 모두 선택합니다. Enter 키를 눌러 이러한 이미지를 나란히 로드합니다. 스캔 이름 옆에 있는 작은 아이콘을 클릭하고 MRA 이미지를 LGE 이미지로 끌어다 놓습니다.
4. Re-sample(재샘플링) 옵션을 선택하면 LGE 이미지를 참조로 사용하여 슬라이스 두께의 차이를 고려하여 MRA 이미지를 다시 슬라이스할 수 있습니다.
5. 스캔 이름 옆에 있는 작은 아이콘을 클릭합니다. LGE 이미지를 MRA 이미지로 끌어다 놓습니다(위의 5.4단계 참조). 메뉴에서 Image Fusion 을 선택하여 LGE 및 MRA 이미지를 오버레이합니다.
6. 도구 모음에서 2D 뷰어를 클릭한 다음 3D 위치 패널을 선택합니다. 버튼을 사용하여 동물 호흡으로 인한 잠재적인 작은 변위를 고려하여 평면 이동을 수동으로 수정합니다.
7. 도구막대에 있는 Closed Polygon 도구를 사용하여 시각적으로 향상된 용기 벽 세그먼트를 수동으로 분할합니다. 공동 등록된 MRA 및 LGE 이미지를 사용하여 세분화를 안내합니다.
8. 상완두동맥을 둘러싸고 있는 모든 LGE 이미지를 분류합니다.
   참고: 혈관 벽의 개선이 확산되거나 고르지 않은 모양인 경우 각 슬라이스에서 개별적으로 분할합니다.
9. 툴바에서 Plugins(플러그인 ) 버튼을 클릭하고 ROI Tools(ROI 도구)를 선택한 다음 Export ROI(ROIs )를 선택하여 스프레드시트의 각 관심 영역(ROI)에 대한 세그먼트화된 영역(mm²)을 내보냅니다.
10. 각 슬라이스의 면적을 합산하여 스프레드시트에서 상완두동맥의 총 향상 면적을 계산합니다.
    참고: 전체 향상 면적은 내피 투과성의 정량적 마커로 사용할 수 있습니다.
11. MRI 스캐너 컴퓨터에서 자동으로 생성되는 T1 맵을 사용하여 혈관 벽으로의 gadofosveset의 흡수량을 반영하는 혈관 벽의 평균 T1 값을 계산하십시오. 이는 내피 투과성의 또 다른 정량적 마커입니다.
12. MRA 및 T1 맵 이미지를 로드하고 위에서 설명한 것과 유사한 접근 방식(5.3-5.9단계)에 따라 혈관 벽을 분할하고 T1 값(ms)을 추출합니다.
13. 스프레드시트에서 T1 값을 반전시키고 1000을 곱하여 완화 시간 R1 = 1/T1을 초 단위로 계산합니다. 각 동물의 상완두동맥을 덮고 있는 모든 절편에 대한 평균 R1을 계산합니다.
14. 위상차 혈관 조영술 영상과 속도 맵을 불러와 심장 주기 동안 혈관 면적과 혈류 속도의 변화를 각각 계산합니다.
15. 아세틸콜린 주입 전과 후에 획득한 이미지를 모두 분할하여 내피(dys) 기능의 대리 마커인 내피 의존성 혈관 활성도를 계산합니다.
16. ROI 탭에서 사용할 수 있는 반자동 성장 영역 도구를 사용하거나 도구 모음에서 사용할 수 있는 닫힌 다각형 옵션(5.7단계 설명)을 사용하여 혈관 조영술 이미지에서 상완두동맥의 내강 면적(mm²)을 분할합니다.
    참고: 반자동 도구는 픽셀 임계값을 사용하여 신호 강도에 따라 혈액 풀을 포함하는 픽셀을 클러스터링합니다.
17. Close Polygon 도구를 사용하여 해당 혈류 속도로 인코딩된 맵을 분할하여 혈류 속도(cm/s)를 계산합니다.
18. 루멘 면적(mm²)과 혈류 속도(cm/s)를 스프레드시트(5.9단계에서 설명)로 내보내고, 이완기 말기(최대 면적) 및 수축기 말기(최소 면적) 심장 단계에 해당하는 것을 식별합니다.
19. 표 형식의 스프레드시트를 사용하여 내피 의존성 혈관 확장(아세틸콜린 주입 전후 이완기(ED) 내강 면적 및 혈류 속도의 백분율 변화 계산)을 계산합니다. 다음 수식을 사용합니다.
    면적 변경=
    흐름 변경=
20. 각 동물에 대해 분석을 위해 통계 소프트웨어의 LGE 이미지, T1 맵 및 아세틸콜린 테스트에서 파생된 해당 데이터를 표로 만듭니다.

Results

이 보고서에서는 죽상경화성 ApoE^-/- 마우스의 상완두동맥에서 EndoThelial peRmeabIlity 및 (dys)funCtion(qMETRIC)을 측정하기 위해 Quantitative MRI 방법의 적용이 demonstarted되었습니다. 이 방법은 내피 손상의 두 가지 마커인 투과성과 (장애)기능에 대한 직접적이고 정량화 가능한 데이터를 제공하며, 이는 단일 이미징 세션 내에서 획득한 생체 내 혈관 벽 스캔에서 추출할 수 있습니다. 첫째, LGE는 혈관 벽 강화 면적(mm³)을 측정하는 데 사용되며, T1(또는 R1) 맵은 투과성의 대리 마커인 gadofosveset를 투여한 후 혈관 벽(^s-1)의 이완 속도를 정량화하는 데 사용됩니다(대표적인 결과는 그림 5 참조). 혈관 벽 R1 이완율은 고지방 식단의 4주, 8주, 12주에 각각 2.42 ^s-1 ± 0.35 ^s-1 3.45 ^s-1 ± 0.54 ^s-1 3.83 ^s-1 ± 0.52 ^s-1 범위였다. 반대로, 야생형(R1 = 2.15 ± 0.34 ^s-1) 및 스타틴 처리된 ApoE^-/-(R1 = 3.0 ± 0.65 ^s-1) 마우스는 개선이 덜했습니다. 최대 12개월 동안 고지방 식단을 섭취한 ApoE^-/- 마우스에서 조직학적 분석, Evans Blue 염료 및 전자 현미경을 통해 죽상동맥경화증이 진행되는 동안 내피 투과성이 증가한다는 것을 보여주었으며, 이는 LGE 혈관 벽 부피 증가, 혈관 벽 R1 이완성의 변화 증가, 아세틸콜린 주입 후 역설적인 혈관 수축과 일치했습니다⁵. 반대로, 스타틴과 다른 내피 표적 치료는 내피 투과성과 플라크 크기를 감소시켰으며, 이는 LGE 부피 감소,^{R1 수치 저하 5,7}, 혈관 확장 개선에 반영되었습니다. 기계적으로, gadofosveset는 혈청 알부민에 가역적으로 결합합니다. 그 결과 프로브(²⁹)의 T1 이완성이 5-6배 증가하여 고감도로 MRI로 검출할 수 있습니다. 여기서, 이 연구는 알부민과 결합된 프로브의 흡수가 내피 누출을 반영한다는 것을 보여주는데, 이는 내피 누출을 정량화하는 생체 외 방법인 Evan's blue dye(그림 5)의 흡수 및 더 넓은 밀착 간극 연접⁵의 흡수와 상관관계가 있기 때문입니다. 둘째, 아세틸콜린에 대한 반응으로 내피(dys) 기능을 측정하는 간단한 검사가 입증되었습니다. 대조 혈관에서 아세틸콜린은 내피 의존성 혈관 이완을 유발하여 동맥 면적/부피 및 혈류를 증가시킵니다. 내피(dys) 기능을 측정하기 위해 아세틸콜린 투여 전후에 획득한 ECG 트리거 혈관 조영술 이미지를 사용했습니다. 이 연구는 아세틸콜린 투여 전후의 혈관 내강의 이완기 말기 영역(또는 부피)의 변화를 계산합니다. 아세틸콜린에 반응하여 혈관 확장되는 정상 혈관과 달리 죽상 경화성 혈관은 혈관 면적(또는 부피)의 감소 또는 혈관의 역설적인 혈관 수축으로 나타나는 내피 의존성 혈관 확장 기능 감소를 나타내는 것으로 밝혀졌습니다(그림 5). 흥미롭게도, 스타틴 치료는 내피¹³의 혈관 확장 특성을 개선했다.

그림 1: 죽상경화성 마우스에서 내피 투과성 및 (dys) 기능을 이미지화하는 워크플로우. (A-B) 마우스는 먼저 마취된 다음 알부민 조영제를 주입합니다. (C) 그런 다음 마우스를 MRI 코일로 옮겨 ECG 패드를 사용하여 심장 활동을 모니터링합니다. (D-E) MRI 이미지는 내피 투과성 및 (dys) 기능을 정량화하기 위해 획득된 후 개방형 플랫폼 소프트웨어(BioRender.com 로 생성됨)를 사용하여 분석됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 임상 3 Tesla MRI 스캐너를 사용하여 내피 투과성 및 (장애) 기능을 영상화하기 위한 동물 위치 및 ECG 모니터링. (A-B) 동물은 표면 코일에 엎드려 놓고 흡입 가능한 이소플루란을 사용하여 마취 상태를 유지합니다. 샌드백은 이미징 플랫폼을 안정화하는 데 사용됩니다. (C-D) ECG 패드를 발에 놓고 임상 ECG 모듈에 연결하여 심장 활동을 기록합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 죽상경화성 마우스의 상완두동맥에서 내피 투과성 및 (dys)기능을 정량화하기 위한 MRI 계획 및 이미지 획득. (A) 대동맥근과 경동맥 사이의 해부학적 영역을 식별하기 위해 Scout 이미지를 획득합니다. (B) MR 혈관 조영술은 혈관 구조를 시각화하고 후속 스캔을 계획하는 데 사용됩니다. (C) 룩-로커(Look-Locker) 영상은 상완두동맥(brachiocephalic artery) 수준에서 획득되어 차후의 가돌리늄 향상 영상(LGE)에서 혈액 신호를 무효화하기 위한 적절한 시간 지연을 결정합니다. (D) LGE 이미지는 선박 벽 개선에 대한 시각적 평가를 제공합니다. (E) T1 매핑은 가돌리늄의 농도를 나타내는 혈관 벽 이완 속도를 계산하는 데 사용됩니다. (F) 혈관 벽의 내피 의존성 혈관 확장 특성은 아세틸콜린 투여 후 정량화됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 죽상경화성 마우스의 상완두동맥에서 내피 투과성 및 (dys)기능을 정량화하기 위한 이미지 세분화 및 분석. (A) 혈관 벽은 조영제 흡수 영역/부피를 정량화하기 위해 LGE 이미지에서 수동으로 분할됩니다. (B) 혈관벽은 T1 매핑에서 분할되어 혈관벽 T1 이완율을 계산합니다. (C) MR 혈관 조영술 및 혈류 인코딩 이미지에 분할된 혈관 벽은 최종적으로 변화의 변화를 계산하여 혈관 벽의 혈관 확장 특성을 연구하는 데 사용됩니다.
이완기 내강 면적 (또는 부피) 및 아세틸콜린 투여 후 혈류. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 죽상경화성 마우스에서 내피 투과성 및 (dys)기능(qMETRIC)의 정량적 이미징. (A) LGE 이미지 및 R1 이완 맵은 죽상동맥경화증 진행 중 혈관 벽 내에서 알부민 결합 조영제의 흡수 증가와 스타틴 치료 후 개선을 보여줍니다. 이미징 데이터는 체외에서 알부민 결합 염료인 Evan's blue dye의 축적에 의해 확증됩니다. (B) 아세틸콜린 투여에 대한 반응으로 혈관 벽의 혈관 확장 특성의 변화는 내피 의존성 혈관 확장의 정량화를 가능하게 합니다. 제어 혈관은 혈관 확장되는 반면, 죽상 경화성 혈관은 아세틸콜린에 반응하여 혈관 수축을 일으키는데, 이는 내피 손상을 암시합니다. 스타틴을 사용한 치료는 내피 손상을 개선합니다. 그림에서 "주(wks)"와 "HFD"라는 용어는 각각 "주(weeks)"와 "고지방 다이어트(high-fat diet)"를 나타냅니다. 이 그림은 Phinikaridou, A. et ^al.5에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

스캔 / 시퀀스	획득 매개 변수
스카우트 / 파일럿 스캔	3D, 빠른 그라디언트 에코 횡방향: FOV = 50mm x 27mm x 14mm, 매트릭스 = 96 x 52, 평면 해상도 = 0.5mm x 0.5mm, 슬라이스 두께 = 0.5mm, TR/TE = 15/6.1ms, 플립 각도 = 30°, 평균 = 1 코로나: FOV = 200 mm x 102 mm x 14 mm, 매트릭스 = 336 x 173, 평면 해상도 = 0.5 mm x 0.5 mm, 슬라이스 두께 = 0.5 mm, TR/TE = 12/6 ms, 플립 각도 = 30°, 평균 = 1
MRA 스캔	3D 빠른 그래디언트 에코, FOV = 30mm x 30mm x 8mm, 매트릭스 = 200 x 200, 평면 해상도 = 0.15mm x 0.15mm, 슬라이스 두께 = 0.5mm, TR/TE = 15/6.1ms, 플립 각도 = 40°, 평균 = 1
Look-Locker 스캔	2D 빠른 그래디언트 에코, FOV = 30mm x 30mm, 매트릭스 = 80 x 80, 평면 해상도 = 0.38mm x 0.38mm, 슬라이스 두께 = 2mm, TR/TE = 19/8.6ms, 후속 IR 펄스 간 TR = 1000ms, 플립 각도 = 10°, 평균 = 1.
LGE 스캔	3D 빠른 그래디언트 에코, FOV = 30mm x 30mm x 8mm, 매트릭스 = 304 x 304, 평면 해상도 = 0.1mm x 0.1mm, 측정된 슬라이스 두께 = 0.5mm, 슬라이스 = 32, TR/TE = 28/8ms, 후속 IR 펄스 간 TR = 1000ms, 플립 각도 = 30°, 평균 = 1.
T1 매핑 스캔	3D 고속 그래디언트 에코, FOV = 36mm x 22mm x 8mm, 매트릭스 = 192 x 102, 평면 해상도 = 0.18mm x 0.22mm, 측정된 슬라이스 두께 = 0.5mm, 슬라이스 = 16, TR/TE = 9.6/4.9ms, 플립 각도 = 10°, 평균 = 1.
위상차 혈관 조영술 스캔	2D, 빠른 그라디언트 에코, FOV = 40mm x 23mm, 매트릭스 = 132 x 77, 평면 해상도 = 0.3mm x 0.3mm x 1mm, TR/TE = 9.8/4.9ms, 플립 각도 = 30°, 심장 위상 = 14, 평균 = 6, 유속(발-머리 방향) = 30cm/s.

표 1: MRI 획득 매개변수

Discussion

혈관 내피 건강을 결정하는 것은 죽상경화성 관련 위험을 진단하고 치료 효과를 모니터링하는 데 잠재적으로 사용할 수 있는 매력적인 이미징 바이오마커입니다. 여기에 설명된 qMETRIC 프로토콜은 포괄적이고 빠르며 임상적으로 적용 가능한 MRI 프로토콜에서 내피 투과성/누출 및 (장애) 기능을 재현 가능하게 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 내피 투과성을 정량화하기 위해 기존 DCE-MRI 프로토콜에 대한 더 간단한 대안 또는 보완 도구를 제공할 수 있습니다. 또한 질병의 영향을 덜 받는 말초 동맥에서 침습적 기술이나 대리 측정을 사용하는 대신 관상 동맥 및 경동맥과 같은 혈관 침대에서 내피(dys) 기능을 직접 평가하기 위한 비침습적 도구를 제공할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 내피 투과성을 측정하면 설치류의 혈관 벽을 정확하게 분할하는 데 중요한 높은 공간 해상도(LGE 이미지의 경우 0.1mm, T1 매핑의 경우 0.22mm)로 대동맥, 대동맥궁, 상완두동맥 및 경동맥을 커버할 수 있습니다. 이미지 분석은 오픈 소스 플랫폼을 사용하여 수행할 수 있으며 복잡한 약동학 모델링이 필요 없이 혈관 벽을 간단하게 분할하기만 하면 됩니다. 중요한 것은 이 프로토콜이 다양한 상용 스캐너에서 사용하도록 조정할 수 있으며 다양한 동물 모델 및 인간에서도 사용하도록 확장할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 임상 스캐너 설정을 사용하는 방법론을 설명하지만, MRI 프로토콜은 고지대 소형 동물 스캐너를 사용할 때도 구현할 수 있습니다. 이러한 스캐너는 종종 반전 복구, T1 매핑 및 혈관 조영 프로토콜을 제공하며, 스캐너 제조업체와 협력하여 사용하거나 프로그래밍할 수 있습니다.

정확하고 재현 가능한 결과를 얻으려면 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계에 특별한 주의를 기울여야 합니다. 첫째, 임상 스캐너에서 작은 동물을 이미징할 때 높은 이미지 품질을 위해 신호 대 잡음비를 최대화하기 위해 적합한 맞춤형 수신기 코일이 필요합니다. 코일에서 동물의 위치를 지정하는 것도 중요하며, 신호 대 잡음비를 개선하기 위해 동물과 코일 사이의 분리 및 공기 충전 공간을 피합니다. 이러한 이유로 관심 있는 해부학적 영역은 코일의 중앙에 배치한 다음 자석의 등심으로 이동하여 최대한의 균질성으로 자기장에 노출시켜야 합니다. 둘째, 안정적이고 강력하며 정확한 ECG 신호는 신뢰할 수 있는 이미징 트리거링/게이팅을 위해 가장 중요합니다. 이는 특정 시점에서 자화의 일관된 여기와 이미지 획득 창의 타이밍을 위해 중요하며, 기능 테스트를 위한 이완기 말기 단계를 포함하는 정확한 시간 분해 이미지를 획득하는 데 중요합니다. 소형 동물 패드 기반 또는 바늘 기반 전극은 임상 스캐너에 비해 차폐가 더 잘 되는 더 높은 자기장 강도 스캐너에서 사용할 때 더 적합한 옵션입니다. 이러한 옵션을 임상 현장 스캐너에서 사용하는 경우, 펄스 시퀀스 동안 ECG 신호를 저하시킬 수 있는 MRI Lamour 주파수에서 공진 회로가 형성되는 것을 방지하기 위해 ECG 케이블을 함께 뒤틀어야 합니다. 또는 패드 크기를 마우스 발에 맞게 조정하고 전도성을 개선하기 위해 테이프로 패드를 추가로 안정화하여 인간 스캔에 사용되는 ECG 모듈과 패드를 사용할 것을 제안합니다. 셋째, 조영제가 혈류를 순환하는 동안 LGE 이미지를 획득할 때 혈관 벽을 묘사하기 위해 혈액 풀을 효율적으로 억제하기 위해 올바른 nulling 시간을 선택하는 것이 중요합니다. Look-locker 시퀀스는 모든 LGE 시퀀스 전에 실행되어야 하며 그에 따라 반전 지연 시간을 조정해야 합니다. 넷째, MOLLI(Modified Look-locker Inversion Recovery) 시퀀스를 사용하여 정확하고 정밀한 T1 매핑을 위해 제안된 이미지 획득 계획을 구현하여 짧고 긴 T1 종을 캡처하기 위해 최소 20ms에서 2000ms에 이르는 반전 지연 범위를 포괄해야 합니다. 마지막으로, MRI 데이터의 세분화는 면적/부피 및 T1 값 계산에서 관찰자 내부 및/또는 관찰자 간 편향을 피하기 위해 엄격하고 엄격한 기준을 적용해야 합니다.

DCE-MRI와 달리, 여기에 설명된 절차는 혈관 벽에서 조영제의 세척 및 세척에 대한 운동 데이터를 제공하지 않습니다. 오히려, 알부민 결합 조영제인 gadofosveset를 주입한 후 특정 시점의 내피 투과성에 대한 스냅샷을 제공합니다. 그러나 이러한 시점에서 추출된 정량적 데이터는 내피 투과성과 증가된 내피 간극 너비를 측정하기 위한 황금 표준으로 간주되는 Evan's blue dye와 같은 다른 알부민 염료와 높은 상관관계가 있었습니다. 기계학적으로 볼 때, gadofosveset의 알부민 결합 및 비결합 분획은 모두 내피 접합부의 단절을 통과하여 MRI 신호 강화로 이어질 수 있을 만큼 충분히 작습니다. 또한, 결합되지 않은 분획은 혈관 벽에 들어간 후 플라크 내 알부민에 결합하여 신호 향상을 초래할 수도 있습니다. 혈관 벽의 이완성은 gadofosveset을 임상 용량으로 주입할 때 r₁≈17 mmol/L/s인 것으로 관찰되었습니다. 이 값은 자유 분획 (r₁≈6.6 mmol / L / ^s)과 비교하여 알부민 결합 분획 (r₁≈25 mmol / L / s)에 대해보고 된 값에 더 가깝습니다 ^5,29.

이 이미징 방법의 향후 응용 분야에는 다양한 동물 모델 및 기타 동맥 세그먼트에 대한 기초 과학 연구와 기존 또는 새로운 제약 제제에 대한 생물학적 반응을 평가하기 위한 이 방법의 사용이 포함됩니다. 연구는 각각 기계론적 및 결과 데이터를 수집하기 위해 횡단면 또는 종단적으로 수행할 수 있습니다. 간단한 워크플로우를 통해 이 접근 방식을 접근 가능하고 인간에게도 임상적으로 적용할 수 있습니다. 인간의 경동맥 및 말초 동맥을 영상화하기 위한 이 방법의 적용이 더 임박했지만, 관상동맥을 영상화하기 위한 이 방법의 적용은 현재 개발되고 있는 이미지 획득, 재구성 및 동작 보정의 추가적인 발전을 필요로 합니다^30,31.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
아세틸콜린	시그마 Aldrich	A6625- 100G, 16.6 mg/kg
마취 장비	일반 마취 서비스	일반 마취 서비스
순환 가열 펌프	ThermoFisher Scientific, 미국	BOM : 152510101
ECG 전도성 젤 (Nuprep)	Waever and Company, 미국	10-30-T
ECG 모니터링 모듈	Invivo, 미국	REF 0700-1002
Gadofosveset trisordium (Vasovist/ Ablavar)	Lantheus Medical Imaging Inc, North Billerica, MA, USA	0.03 mmol/kg
고지방 다이어트	특별 다이어트 서비스, Witham, 영국	드에서 21% 지방, 0.15%(wt/wt) 콜레스테롤
유도 상자	Vet Tech Solutions LTD
인슐린 주사기	BD Biosciences	0.5 mL, 29 G
OsirixX 소프트웨어	OsiriX 재단, 제네바, 스위스		오픈 소스 플랫폼
Philips Achieva MRI 스캐너 (3 Tesla)	Philips Healthcare, Best, The Netherlands	임상 그라디언트 시스템 (30 mT m-1, 200 mT m-1 ms-1)
Single– 루프 표면 현미경 수신기 코일	필립스 함부르크	직경 = 23mm	맞춤형 제작