지역별 인간 만능줄기세포 유래 성상세포 및 뉴런을 이용한 ALS 모델링을 위한 전기생리학적 플랫폼 구축

요약

우리는 척수 인간 유도 만능 유래 성상 세포와 뉴런을 구별하는 방법과 전기 생리 학적 기록을위한 이들의 공동 배양을 설명합니다.

초록

인간 만능 줄기세포 유래 성상세포(hiPSC-A) 및 뉴런(hiPSC-N)은 시험관 내에서 근위축성 측삭 경화증(ALS) 병태생리학을 모델링하기 위한 강력한 도구를 제공합니다. 다중 전극 어레이(MEA) 기록은 대규모 뉴런 집단의 전기장 전위를 기록하고 시간 경과에 따른 네트워크 활동을 분석하는 수단입니다. 척수 성상 세포 표현형을 촉진하는 기술을 사용하여 분화되는 hiPSC-A의 존재가 hiPSC-A없이 배양되거나 설치류 성상 세포가있는 상태에서 배양 된 것과 비교할 때 국소 특이 적 척수 hiPSC- 운동 뉴런 (MN)의 성숙 및 전기 생리 학적 활성을 향상 시킨다는 것이 이전에 입증되었습니다. 여기에 설명된 것은 척수 hiPSC-A를 hiPSC-MN과 공동 배양하고 MEA 기록을 사용하여 전기생리학적 활성을 기록하는 방법입니다. 여기에 설명된 분화 프로토콜은 척수에 지역적으로 특이적인 성상세포 및 뉴런에 특화된 반면, 공동 배양 플랫폼은 피질 hiPSC-A 및 hiPSC-N을 포함한 다른 운명에 특정한 기술로 분화된 성상세포 및 뉴런에 적용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 신경교-뉴런 상호 작용에 대해 알리고 ALS에서 치료 가능성이 있는 약물을 테스트하기 위한 플랫폼을 제공하기 위한 전기생리학적 분석을 제공하는 것을 목표로 합니다.

서론

인간 만능줄기세포 유래 성상교세포(hiPSC-A) 및 뉴런(hiPSC-N)은 시험관 내에서 근위축성 측삭 경화증(ALS) 병태생리학을 모델링하기 위한 강력한 도구이며 약물^{발견 전략을 위한} 번역 패러다임을 제공합니다1. 연구자들은 hiPSC-A와 hiPSC-N의 공동 배양이 두 세포 유형의 형태학적, 분자적, 전기생리학적 및 약리학적 성숙을 향상시켜 복잡한 뉴런 네트워크와 생체 내 대응물과 유사한 성상세포-뉴런 상호작용을 생성한다는 것을 입증했습니다^2,3. 유사한 공동 배양 실험은 성상 세포 매개 신경 독성 ^4,5 및 신경 과흥분성⁶과 같은 ALS 병리학의 특징을 요약할 수 있습니다. 또한 분화 프로토콜의 발전으로 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)는 피질 및 척수 hiPSC-A 및 hiPSC-N ^7,8을 포함한 지역 별 신경 아형으로 분화 될 수 있습니다. 이러한 전략은 ALS에서 피질 및 척추 운동 뉴런 병리를 모델링 할 수있는 잠재력을 제공 할뿐만 아니라 성상 세포 영향 모두에 대한 성상 세포 영향을 제공합니다. 그러나 이를 위해서는 이러한 효과를 결정하기 위한 재현 가능한 기능 분석이 필요합니다.

최근에는 다중 전극 어레이 (MEA) 기록이 뉴런-성상 세포 공동 배양의 전기 생리 학적 특성화에 특히 적합하다는 것이 밝혀졌습니다². 단일 세포 전기생리학적 분석과 달리 이러한 고밀도 전극 어레이는 배양 조건을 방해하고 세포막의 무결성을 보존하지 않고 대규모 뉴런 집단의 세포외 전위를 수동적으로 기록합니다. 이러한 플랫폼은 시간이 지남에 따라 그리고 약리학적 조작에 대한 반응으로 배양물의 세포 및 네트워크 활동을 기록하는 데 특히 유용합니다. 마지막으로, 성상 세포의 존재가 배양 변수 인 경우 MEA 기록은 성상 세포-뉴런 양방향 상호 작용에 대한 기능적 통찰력을 제공 할 수 있습니다 ^2,9.

여기에 제시된 것은 hiPSC를 척수 hiPSC-A 및 hiPSC- 운동 뉴런 (MN)으로 분화하기위한 최적화 된 프로토콜입니다 이전에 검증 된². 척수 hiPSC-A 분화 프로토콜은 각각 세포의 최대 80%, 50% 및 90%에서 S100 칼슘 결합 단백질 B(S100β), 신경교섬유소 산성 단백질(GFAP) 및 호메오박스 B4(HOXB4)에 대해 양성인 성상세포 배양을 일관되게 초래하여 성숙 신경교 및 척수 사양 ^2,10을 나타냅니다. . hiPSC-MN 분화 프로토콜은 콜린 아세틸 트랜스퍼 라제 (ChAT)에 대해 >90 % 양성인 뉴런을 생성하며, 이는 성숙한 알파 운동 뉴런 정체성²을 암시합니다. 또한, 이 프로토콜은 성상세포가 없거나 설치류 성상세포2가 있는 뉴런 배양과 비교할 때 Scholl 분석 및 면역형광 현미경에 의해 향상된 형태학적 복잡성을 갖는 뉴런을 생성하는 것으로 이전에 입증된 hiPSC-A/MN 공동 배양의 생성 기술을^{설명합니다.} 이러한 설명은 척수 hiPSC-A 및 hiPSC-N에 특이적이지만, 독특한 이점은 성상 세포와 뉴런의 초기 독립 배양에 이어 이후 시점에서 공동 배양하는 단계가 다른 특정 영역뿐만 아니라 질병 특이 적 세포로부터의 뉴런-성상 세포 상호 작용의 효과를 연구하도록 번역 될 수 있다는 것입니다 ^7,8 . 마지막으로, 프로토콜은 MEA 플레이트에서 이러한 배양을 성장시키는 방법을 설명하여 공동 배양 조성물의 인자로서의 기능적 활성이 세포 조성 및 배양 조건을 조작하는 능력으로 시간이 지남에 따라 연구될 수 있도록 합니다.

이러한 프로토콜의 목표는 성상 세포-뉴런 상호 작용을 조사하고, 질병 특이적 변화를 조사하고, ALS 분야에서 치료 가능성이 있는 약물을 테스트하기 위한 기능 분석을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜의 가장 어려운 단계에 대한 비디오 지침이 제공됩니다.

프로토콜

1. 세포 배양 배지 준비

1. 표 1에 언급된 조성물을 사용하여 개별 세포 배양 배지를 준비한다.
2. 여과된 500mL 병에 배지를 혼합 및 멸균 여과하고 4°C에서 최대 2주 동안 빛으로부터 보호하여 보관합니다.

2. 비 합류 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)의 유지 및 계대 배양

1. 기저막 매트릭스(-80°C에서 분취량으로 보관)를 2-8°C 냉장고에서 밤새 해동시킨다.
2. 기저막 매트릭스를 차가운 인산염 완충 식염수 (PBS) 또는 Dulbecco의 변형 된 독수리 배지 (DMEM)에서 1 : 100 (v / v)으로 희석하십시오.
3. 조직 배양 플레이트(10cm 플레이트의 경우 5mL, 6웰 플레이트의 단일 웰의 경우 2mL)의 바닥을 코팅하기에 충분한 기저막 매트릭스를 추가하고 37°C에서 최소 30분 동안 밤새 또는 실온에서 최소 1시간 동안 배양합니다.
4. 희석된 기저막 매트릭스를 흡인하고 배양 배지와 파종 세포를 추가하기 전에 PBS로 플레이트를 한 번 세척합니다.
5. 매일 판을 검토하여 언제 통과할 준비가 되었는지 확인하고 예상한다. hiPSC의 통로 판은 대부분의 식민지가 충분히 조밀해지면 식민지의 중앙에 흩어져있는 흰색 영역이 표시됩니다. 플레이트가이 시점을 지나서 성숙하지 않도록하십시오. 과도한 분화를 일으켜 세포 다층화, 가장자리에 길쭉한 세포의 과잉, 콜로니 내의 느슨한 조밀성 또는 세포 사멸 증가로 인해 콜로니 중앙에 노란색 영역이 나타납니다.
6. 통과 당일에는 전체 플레이트를 정확하게 덮을 수 있도록 마커로 플레이트의 하단 외부 표면에 그리드 선을 그립니다.
7. 200μL 피펫 팁으로 수동으로 긁어내는 위상차 현미경(10x 배율)을 사용하여 배양 후드에서 분화된 콜로니를 분리합니다.
8. 플레이트를 PBS로 두 번 헹굽니다(10cm 플레이트의 경우 세척당 5mL).
9. 예열된 조직 해리 프로테아제(재료 표) 5mL를 추가하고 콜로니의 가장자리가 반올림되기 시작할 때까지(4-7분) 플레이트에서 콜로니가 들어 올려지기 전에 세포를 37°C에서 배양합니다.
10. 해리 프로테아제를 조심스럽게 흡인하십시오. 콜로니가 제거되지 않도록 주의하면서 PBS로 접시를 두 번 부드럽게 헹굽니다.
11. 5mL의 사전 예열된 hiPSC 배지(표 1)를 배양 플레이트에 추가합니다.
12. 위에서 아래로 앞뒤로 움직여 5mL 피펫 끝으로 전체 플레이트를 긁어 콜로니를 들어 올려 더 작은 세포 응집체로 분해합니다.
13. 플레이트를 90° 돌리고 위의 단계를 반복합니다.
14. 5mL 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 세포 응집체를 부드럽게 분쇄하고 대부분의 세포 응집체가 약 50-100 세포가 될 때까지 현미경으로 주기적으로 응집체의 크기를 확인합니다.
15. 세포 응집체를 사전 코팅된 기저막 매트릭스 플레이트에 시드하고, 추가 hiPSC 배지를 사용하여 원래 플레이트를 세척합니다. 대부분의 세포 응집체를 수집하고 5mL 피펫을 사용하여 새 플레이트로 옮깁니다.
    참고: 프로토콜이 일관되게 적용되는 경우 원래 플레이트에는 통과 전에 배양 표면의 약 50%를 덮는 iPSC 콜로니가 포함되어야 합니다. 이 경우 분할 비율은 하나의 플레이트에서 5 개의 새 플레이트로해야합니다. 그러나, 이는 성장 조건 및 세포주 특이적 성장 속도에 따라 조정될 필요가 있을 수 있다.
16. 새로 파종 된 플레이트를 앞뒤로 흔들어 골재를 고르게 분배합니다.
17. 플레이트를 인큐베이터(37°C 및 5%_CO2)로 옮기고 적절한 세포 접착을 위해 밤새 그대로 두십시오.
18. 10mL의 hiPSC 배지로 매일 완전한 배지 교체를 수행하십시오. 통과 다음 날 과도한 세포 파편이 있는 경우 배지를 교체하기 전에 배지 5mL로 한 번 세척하십시오.
19. 대부분의 iPSC 콜로니의 중앙에 흰색 영역이 나타날 때 다음에 통과하도록 계획하십시오 (2.5 단계). 이것은 각 통과 후 4-6 일 후에 발생합니다.

3. 동결 hiPSC

1. hiPSC 통과를 위해 2.5-2.14단계와 같이 초기 단계를 수행합니다.
2. 세포 응집체를 15mL 튜브에 수집하고 200 x g 에서 2분 동안 회전합니다.
3. 상청액을 흡인하고 펠릿을 냉동 배지에 재현탁한 다음 5mL 피펫을 사용하여 cryotube로 옮깁니다.
   알림: 통과 단계와 유사하게 일반적인 분할 비율은 콜로니의 밀도에 따라 iPSC 플레이트 1개 대 냉동 튜브 5개입니다. 각 극저온관에 대해 총 부피의 동결 배지 1mL를 사용합니다.
4. 냉동 튜브를 냉장 냉동 보존 용기에 넣고 밤새 -80 ° C로 옮깁니다.
5. 24 시간 후에 세포를 액체 질소로 옮깁니다.

4. 해동 hiPSC

1. 10cm 플레이트를 기저막 매트릭스로 코팅하십시오 (2.1-2.3 참조).
2. 액체 질소에서 iPSC cryotube를 제거하고 즉시 37°C 수조에 최대 2분 동안 두어 빠르게 해동합니다. 부분적으로 해동되고 액체로 둘러싸인 작은 얼음 조각이 포함될 때까지 욕조에서 바이알을 흔듭니다.
3. 1000μL 피펫을 사용하여 세포 응집체를 cryotube에서 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 최대 15mL의 사전 예열된 hiPSC 배지를 추가하여 동결 배지에서 디메틸설폭사이드(DMSO)를 희석합니다.
4. 15mL 코니컬 튜브를 200 x g 로 2분 동안 원심분리합니다.
5. 상청액을 흡인하고 5mL 피펫을 사용하여 20μM의 Rho 관련 코일 코일 형성 단백질 세린/트레오닌 키나제 억제제(ROCK-I, 화합물 Y-27632)가 포함된 hiPSC 배지에 세포 펠릿을 재현탁하여 세포 응집체의 추가 분쇄를 방지합니다.
6. 세포 응집체를 5mL 피펫을 사용하여 기저막 매트릭스가 코팅된 10cm 플레이트로 옮깁니다.
   알림: 프로토콜이 일관되게 적용되면 하나의 cryotube의 세포를 단일 10cm 플레이트로 옮길 수 있습니다.
7. 골재를 고르게 분배하기 위해 플레이트를 흔든다.
8. 플레이트를 인큐베이터로 옮기고 적절한 세포 접착을 위해 밤새 방해받지 않고 그대로 두십시오.
9. 해동 다음 날 ROCK-I가 없는 hiPSC 배지 10mL로 완전 배지 변경을 수행합니다.

5. hiPSC를 척수 신경 전구 세포 (NPC)로 분화

1. 차별화를 시작하기 전에 기저막 매트릭스 코팅된 6웰 플레이트를 사용할 준비가 되었는지 확인하십시오.
2. 적어도 한 번, 바람직하게는 해동 후 두 번 통과 한 iPSC로 시작하고 적어도 4 개의 10cm 플레이트로 시작하십시오 (5.11 단계의 설명 참조).
3. hiPSC 통과에 대해 2.5-2.14단계와 같이 초기 단계를 수행합니다.
4. 5mL 피펫을 사용하여 최소 2개의 10cm 플레이트에서 15mL 튜브로 세포 응집체를 옮깁니다.
5. 200 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다.
6. 상청액을 흡인하고 10mL 피펫을 사용하여 10mL의 hiPSC 배지로 세포 펠렛을 재현탁한 다음 200 x g 에서 2분 동안 다시 원심분리하여 각 응집체의 세포 간 접착을 느슨하게 합니다.
7. 상청액을 흡인하고 1000μL 피펫을 사용하여 20μM ROCK-I를 함유하는 1mL의 hiPSC 배지에 세포 펠릿을 재현탁시킨다.
8. 1000 μL 피펫으로 위아래로 피펫하여 세포 응집체를 분쇄합니다. 세포 현탁액의 대부분이 단일 세포 또는 <10 세포의 작은 응집체를 포함할 때까지 현미경으로 주기적으로 응집체의 크기를 확인합니다.
9. 혈구계(권장) 또는 자동 세포 카운터로 세포를 계수하고 세포 현탁액의 세포 밀도를 계산합니다.
10. 플레이트는 3.0 x 10 6-웰 플레이트의 각 웰에⁶ 개의 세포를 기저막 매트릭스로 미리 코팅한다. 1000 μL 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 옮깁니다.
    알림: 프로토콜이 일관되게 적용되는 경우 이는 두 개의 10cm 플레이트를 6웰/플레이트의 단일 웰로 혼합한 비율에 해당합니다.
11. 두 개의 10cm 플레이트의 두 번째 배치로 5.3-5.10단계를 반복하고 최종 제품을 두 번째 6웰 플레이트의 기저막 매트릭스 코팅 웰에 플레이트합니다. 1000 μL 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 옮깁니다.
    참고 : 척수 NPC 프로토콜을 이상적으로 완료하려면 4 개의 10cm 플레이트와 동일한 2 개의 웰이 필요합니다. 워크플로를 쉽게 하려면 5.3-5.10단계를 두 개의 플레이트로 구성된 두 개의 배치로 완료하고, 각 플레이트의 최종 제품은 두 개의 개별 6웰 플레이트이고 각 플레이트에는 3.0 x 10⁶ 셀이 포함된 하나의 웰이 있습니다.
12. 생성된 인간 iPSC 단분자층을 컨플루언스가 >90%에 도달할 때까지 20μM ROCK-I를 포함하는 hiPSC 배지에서 유지하며, 일반적으로 다음 날이지만 초기 도금 후 3일 이내에 유지하여 자발적인(비제어) 분화를 방지합니다.
13. 세포 도금 다음 날 분화를 시작할 수 없는 경우 PBS로 세포를 한 번 세척하고 매일 배지를 20μM ROCK-I가 포함된 새로운 hiPSC 배지로 교체합니다. 도금 후 3 일 이내에 합류하지 않으면 >90 %, 셀을 폐기하고 프로토콜을 다시 시작하십시오.
14. >90% 합류점에 도달하면 차별화를 시작합니다. 이는 분화 프로토콜의 시험 관내 1일(DIV1)이다.
15. DIV 1에서, 20 μM ROCK-I를 함유하는 hiPSC 배지를 버리고 PBS로 2회 헹구어 줄기세포 배지에 존재하는 태아 성장 인자 (FGF) 및 형질전환 성장 인자-베타 (TGFβ)를 제거하였다.
16. 배지를 48시간 동안 0.2μM의 LDN193189(LDN) 및 10μM의 SB431542(SB)가 보충된 WiCell 배지(표 1)로 변경합니다.
17. DIV 3에서 PBS로 한 번 세척하고 배지를 LDN(0.5μM) + SB(10μM) + 레티노산(RA; 1μM)이 보충된 WiCell 배지로 48시간 동안 변경합니다.
18. DIV 5에서 PBS로 한 번 세척하고 배지를 WiCell로 변경합니다: 신경 유도 배지(NIM) 베이스(표 1)(50%:50%, v/v)에 LDN(0.5μM) + SB(10μM) + RA(1μM)가 보충된 48시간 동안.
19. DIV 7에서 5.18단계와 동일한 매체로 매체 교환을 수행한다.
20. DIV 8에서 PBS로 한 번 세척하고 48시간 동안 RA(1μM) + 퓨로모르파민(PMN)(1μM) + 재조합 인간 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF)(10ng/mL) + 아스코르브산(ASAC)(0.4μg/mL)이 보충된 WiCell:NIM 염기(50%:50%)로 배지를 변경합니다.
21. DIV 10에서 PBS로 한 번 세척하고 배지를 48시간 동안 5.20단계에서 언급한 대로 보충된 NIM 베이스(100%)로 변경합니다.
22. DIV 11 또는 12에서 통과를 준비하기 위해 25cm2 멸균 배양 플라스크를 기저막 매트릭스로 코팅합니다.
23. 6-웰 플레이트 l의 각 웰로부터 배지를 흡인하고 세포를 PBS로 한번 헹구었다.
24. 각 웰에 0.05% 트립신 2mL를 추가하고 37°C에서 5-15분 동안 배양합니다. 플레이트를 간헐적으로 흔들면 셀 분리에 도움이 될 수 있습니다.
25. 세포가 여전히 현탁 상태에 있지 않은 경우 1000μL 피펫 팁에서 NIM 배지를 원운동으로 세포로 배출하거나(전체 표면을 덮어야 함) 세포 스크레이퍼로 긁어내(선호되지 않음) 기계적으로 분리합니다.
26. 세포를 2웰에서 15mL 튜브로 옮기고 5mL 피펫을 사용하여 사용된 트립신의 양에 적절한 비율로 트립신 억제제를 추가합니다.
27. 200 x g 에서 2분 동안 원심분리하고, 상청액을 흡인하고, 10mL 피펫을 사용하여 10mL의 NIM 염기로 재현탁한다.
28. 200 x g 에서 2분 동안 다시 원심분리하여 세포 간 유착을 느슨하게 합니다.
29. 두 번째 원심분리 단계 후, 상청액을 제거하고, RA (1 μM) + PMN (1 μM) + BDNF (10 ng / mL) + ASAC (0.4 μg / mL) 및 ROCK-I (20 μM)가 보충 된 NIM 배지 (100 %)의 1 mL로 펠릿을 다시 현탁한다. 1000μL 피펫 팁을 사용하여 흐린 현탁액이 얻어질 때까지 세포를 위아래로 약 5회 분쇄합니다.
30. 이 배지의 응집체를 기저막 매트릭스가 코팅된 25^cm2 멸균 배양 플라스크에 다시 시드하여 최종 결과가 나오도록 6 웰 플레이트의 2웰에서 세포를 단일 기저막 매트릭스가 코팅된 25^cm2 멸균 배양 플라스크로 결합시킨다(2:1 계대). 1000 μL 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 옮깁니다.
    참고: 셀은 DIV 13에서 >90% 합류해야 하며 14일차까지 추가 단계가 필요하지 않습니다. 세포가 합류하지 않으면 ROCK-I를 추가로 1 또는 2 일 동안 배지에 보관하십시오.
31. DIV 14에서 배지를 새로운 NIM 배지 + RA (1 μM) + PMN (1 μM) + BDNF (10 ng / mL) + ASAC (0.4 μg / mL)로 변경하십시오.
32. DIV 15에서 배지를 NIM으로 변경합니다: RA(1μM) + PMN(1μM) + ASAC(0.4μg/mL) + 보충제 B(50x) + BDNF(10ng/mL) + 신경교 세포주 유래 신경영양(GDNF)(10ng/mL) + 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1)(10ng/mL) + 섬모 신경영양 인자(CNTF)(10ng/mL)가 포함된 신경 분화 배지(NDM) 베이스(표 1)(50%:50%). 격일로 새로운 미디어로 변경하십시오.
33. DIV 21에서 배지를 5.32단계와 같이 보충된 NDM 베이스(100%)로 변경하고 격일로 새 배지로 교체합니다.
34. DIV 25-30에서 NPC를 모아 얼리거나 터미널 차별화를 위해 10cm 플레이트로 통과시킵니다.
35. T-25 플라스크를 PBS로 헹구고 0.05% 트립신을 첨가합니다.
36. 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
37. 트립신과 세포를 NDM 베이스로 헹구고 15mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 트립신 억제제를 트립신에 적절한 비율로 추가하고 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
38. 세포 펠릿을 운동 뉴런 또는 성상세포 분화 배지(표 1)로 재현탁하고 1000μL 피펫을 사용하여 위아래로 분쇄하여 단일 세포 현탁액(일반적으로 최대 5회)을 얻습니다.
39. 세포를 계수하고 분화 배지 +Rock-I를 사용하여 섹션 6에 설명된 대로 코팅된 10cm 플레이트로 옮겨 hiPSC-MN 및 hiPSC-A를 분화시킵니다.
40. 대안적으로, 성장 인자(5.32-5.33단계에서와 같이) 및 10% DMSO를 갖는 90% NDM 배지로 구성된 동결 배지에서 재현탁하여 배양물을 동결시키고, 유사하게 분쇄한 다음, 동결관으로 옮긴다. 분취량 6 x 10⁶ 냉동 튜브당 NPC.

6. NPC 문화 해동

1. 세포를 해동하기 전날 폴리오르니틴(PLO)과 라미닌으로 10cm 플레이트를 코팅합니다.
   1. PBS 또는 증류수(_dH2O)에서 100μg/mL로 희석된 PLO 5mL를 플레이트에 추가합니다. 37°C에서 최소 1시간에서 밤새 배양합니다.
   2. PLO 용액을 흡인하고 플레이트를 PBS로 3 회 헹굽니다. (PLO는 제대로 씻지 않으면 독성이 있습니다.)
   3. PBS에 희석 된 라미닌을 PLO 코팅 플레이트에 10 μg / mL 농도로 첨가합니다. 최소 1 시간 동안 37 ° C에서 배양하십시오. 배양 후 헹구지 않고 라미닌 용액을 흡인하여 세포 접착력을 향상시킵니다.
      참고: 플레이트는 미리 PLO로 코팅하고, 물로 3회 세척하고, 멸균 후드에서 건조하고, 4°C에서 보관할 수 있습니다.
2. 각 10cm 세포 배양 플레이트에 대해 6 x 10⁶ 세포/바이알이 들어 있는 NPC 바이알 1개(즉, DIV 25 또는 30)를 해동합니다.
3. 액체 질소에서 NPC 냉동 튜브를 제거하고 즉시 37 ° C 수조에 최대 2 분 동안 두십시오. 액체로 둘러싸인 작은 얼음 조각이 될 때까지 바이알을 흔들어 빠르게 해동하십시오.
4. 1000μL 피펫을 사용하여 세포 응집체를 15mL 원뿔형으로 옮기고 최대 15mL의 사전 예열된 NDM 또는 Dulbecco의 변형 이글스 배지(DMEM)/Ham의 F21 F12 보충제를 추가하여 DMSO를 희석합니다.
5. 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
6. 상청액을 흡인하고 성상세포 또는 MN 분화 배지(표 1) + ROCK-I(20μM)로 세포 펠릿을 재현탁하고 1000μL 피펫을 사용하여 단일 세포 현탁액이 얻어질 때까지(최대 5회) 위아래로 분쇄합니다.
7. 단일 세포 현탁액을 PLO-라미닌 코팅된 10 cm 플레이트로 옮깁니다.
8. 플레이트를 인큐베이터로 옮기고 적절한 세포 접착을 위해 밤새 방해받지 않은 상태로 두십시오.

7. 척수 NPC를 운동 뉴런으로 분화

1. 단계 6.1-6.8에서 언급한 대로 초기 단계를 수행하며, 최종 배지는 MN 분화 배지 + ROCK-I(20μM)입니다.
2. 도금 다음날, ROCK-I가 없는 MN 분화 배지와 배지의 완전한 교환을 수행한 다음, 격일로 배지를 교체한다. 주말에는 금요일에 세포를 먹인 다음 월요일에 다시 세포를 공급하십시오. 세포 파편을 제거하기 위해 필요한 경우 PBS로 세포를 헹굽니다.
3. MN 분화 배지 + 시토신 아라비노사이드(ARA-C)(0.02μM)로 배지를 변경하고 세포 클러스터에 응집된 유사분열 후 MN 전구체 아래에서 신경교세포 커밋 전구세포가 단일 증식 편평한 세포로 나타날 때 48시간 동안 배양합니다.
   참고: 일반적으로 이것은 초기 도금 후 처음 7일 이내에 발생하지만 세포주에 따라 변동성이 있을 수 있습니다.
4. 48시간 후, ARA-C를 함유하는 배지를 흡인하고, PBS로 배양물을 3회 부드럽게 헹구고, 배지를 ARA-C가 없는 신선한 MN 배지로 변경한다.
5. ARA-C로 치료한 후 격일로(또는 월요일, 수요일, 금요일) 진공 흡인기 대신 수동 피펫으로 기존 배지를 제거하여 신경 클러스터의 조기 박리를 방지하여 배지 교환을 수행합니다. 또한 MN 배지를 일주일에 한 번 Laminin 1 μg/mL로 농축하여 배양 플레이트에 대한 신경 부착을 더욱 향상시킵니다.

8. NPC를 척수 성상 세포로 분화

1. 섹션 6에서와 같이 NPC 배양물을 해동하고, 성상세포 분화 배지(표 1)를 사용하여 부피 농도가 1%인 태아 소 혈청(FBS)(NS + 1% FBS) 및 플레이팅용 ROCK-I(20μM)를 첨가하였다.
   참고: 시판되는 혈청 대체물(표 1)은 동일한 희석 인자를 사용하여 FBS를 대체할 수 있습니다.
2. 도금 다음 날, 배양액을 ROCK 억제제가 없는 NS+1% FBS 배지로 교체한 후 격일로 배지를 교체한다. 주말에는 금요일에 세포를 먹인 다음 월요일에 다시 세포를 공급하십시오. 세포 파편을 제거하기 위해 필요한 경우 PBS로 세포를 헹굽니다. 세포가 계속 죽으면 세포 생존을 촉진하기 위해 ROCK-I (10 μM)로 배지를 보충하십시오. 불멸의 세포를 선택할 가능성이 있으므로 ROCK-I를 너무 자주 또는 너무 오래 사용하지 않도록 주의하십시오.
3. 성상 세포가 통과하기 전에 합류하도록하십시오.
   참고: 셀 크기는 시간이 지남에 따라 증가하므로 통과할 정해진 번호가 없습니다. 일반적인 패시징 비율은 1:2 또는 1:3입니다. 생존율이 좋지 않거나 너무 많은 플레이트로 넘어가는 경우 두 개(또는 필요에 따라 그 이상)의 10cm 플레이트를 하나의 10cm 플레이트에 결합하여 밀착성을 유지하십시오.
4. 성상 세포 전구 배양을 통과하려면 플레이트를 PBS로 한 번 씻고 (FBS를 제거하기 위해) 0.05 % 트립신으로 5 분 동안 배양하고 NS 배지 + 1 % FBS (FBS는 트립신을 비활성화 함)에서 세포를 수집 한 다음 300 x g 에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 상청액을 흡인하고, 세포를 NS 배지 + 1% FBS에 재현탁시키고, 이어서 단세포 현탁액으로 분쇄한다. NS + 1% FBS의 세포를 새로운 10cm 플레이트에 분배합니다.
   참고: 성상 세포 배양을 확장하는 것 외에도 플레이트의 반복적 인 계대는 뉴런 운명을 선택한 나머지 전구 세포를 죽이는 목적으로 사용됩니다. 따라서 유사분열 비율이 매우 높지 않더라도 뉴런 오염이 있는 것으로 보이면 플레이트를 1:1 비율로 통과시킬 수 있습니다.
5. 수율을 높이기 위해 분화 과정에 걸쳐 코팅을 다음과 같이 변경하십시오.
   1. 처음에 해동된 NPC 배양균과 초기 도금 후 첫 번째 통로를 PLO/라미닌에 플레이팅합니다.
   2. 미성숙 성상세포를 기저막 매트릭스 코팅판에 플레이팅합니다.
   3. 기저막 매트릭스, PLO/라미닌 코팅 플레이트(일반적으로 뉴런과의 공동 배양용) 또는 코팅되지 않은 플레이트에 더 성숙한 성상세포(즉, 90일 이후)를 플레이트합니다.
6. 60일 성숙 기간 동안 언제든지 성상세포 전구세포를 동결하여 배양을 동기화하거나 이후 실험을 위해 저장합니다. NPC 단계를 넘어 해동 할 때 성상 세포 전구 세포를 PLO / Laminin이 아닌 기저막 매트릭스 코팅 판으로 해동하십시오.
7. DIV 90 및 그 이후, 배지를 NS + 1% FBS에서 NS + 5% FBS로 전환하여 성상세포 생존을 촉진하고 이들의 증식을 감소시킨다.

9. 다중 전극 어레이 플레이트에서 MN과 척수 성상 세포 공동 배양

1. 운동 뉴런과 성상 세포가 같은 날에 사용할 준비가되면 구별하고 플레이팅하고 운동 뉴런의 경우 DIV 60, 성상 세포의 경우 DIV 90으로 숙성시킵니다.
2. 24웰 플라스틱 플레이트(재료 표)로 작업하는 경우 다음과 같이 도금 전날 또는 당일에 MEA 플레이트를 코팅하십시오.
3. PLO를 물 또는 PBS에서 100μg/mL로 희석합니다.
   1. 각 웰에 15-20 μL를 추가하여(피펫 편안함 수준에 따라 다름) 웰 중앙에 액적을 형성하여 전극 영역과 주변 영역을 덮지만 웰 전체는 덮지 않습니다.
   2. 피펫 팁으로 전극이 손상되지 않도록 주의하십시오. 각 웰에서 동일한 표면적을 커버할 수 있도록 웰에서 웰까지의 부피와 일관성을 유지하십시오.
   3. PLO를 37°C에서 최소 1시간(바람직하게는 2시간) 동안 인큐베이션한다.
      알림: 플레이트에 충분한 습도가 없으면 작은 부피가 건조됩니다. 코팅 및 기록 과정에서 충분한 습도를 보장하기 위해 우물을 둘러싼 구획에 물을 추가하십시오.
4. 플라스틱 마이크로 피펫 팁을 사용하여 가능한 한 많은 PLO를 흡인하십시오. 전극을 만지지 않도록주의하십시오. 250μL의 물로 3회 세척한다. 세척을 위해 진공 흡인기를 사용하는 경우 전극 어레이 근처에 팁이 닿지 않도록하십시오. 세 번째 세척 후 필요에 따라 피펫 팁을 사용하여 가능한 한 많은 물을 제거하십시오. 뚜껑을 제거한 상태에서 세포 배양 후드 아래에서 표면을 건조시킵니다.
5. 플레이트 표면이 건조되면 PBS에 10μg/mL로 희석한 라미닌을 추가합니다. 15-20 μL를 사용하여 각 전극 어레이를 덮으십시오. 습도 구획에 물을 추가하고 뚜껑을 교체한 다음 플레이트를 최소 37시간에서 최대 2시간 동안 밤새 배양했습니다.
6. 도금 당일, MN 및 성상 세포 배양물을 PBS로 한 번 헹구고 37 °C에서 트립신 0.05 %를 첨가하여 세포를 들어 올립니다 (5 분). 트립신 억제제가 들어있는 15mL 원추형 튜브에 수집하고 배지 또는베이스로 플레이트를 세척하여 모든 세포가 수집되도록합니다. 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 1000μL 피펫으로 재현탁하여 1mL의 단일 세포 현탁액을 생성합니다. MN 및 성상교세포를 재현탁시킬 때, 20 μM ROCK-I를 첨가하여 공동 배양 배지로 전환한다(표 1).
7. 혈구계를 사용하여 MN과 성상 세포를 병렬로 세십시오. 계수하고 계산하는 동안 세포 현탁액을 캡핑하고 4 ° C의 스티로폼 랙에 넣습니다.
8. 운동 뉴런의 경우 5μL당 5 x 10 4 세포, 성상교세포의 경우 5 μL당 2.5 x 10⁴ 세포의 농도로 배양물을 재현탁하는 데 필요한 부피를 계산합니다. 1mL 세포 현탁액을 300 x g에서 5분 동안 원심분리하고 계산된 부피로 재현탁합니다.
9. 파종할 원하는 웰의 수를 계산하고 각 세포 현탁액의 5μL를 곱합니다. 필요한 양의 뉴런과 성상 세포 현탁액을 1:1 비율로 결합하고 완전히 결합될 때까지(보통 두 번) 피펫팅으로 혼합하되 너무 공격적이지 않도록 합니다.
10. 피펫 팁을 사용하여 MEA 플레이트의 각 웰에서 라미닌을 제거합니다. 10 μL의 최종 조합 세포 현탁액을 각각의 웰로 옮기고, 전극 어레이를 덮는 작은 액적을 형성하여 웰당 5 x 10^4MN 및 2.5 x 10⁴ 성상세포의 세포 밀도를 제공한다.
    참고: 결합된 현탁액의 세포 밀도가 높으면 정확하고 일관된 세포 수를 보장하기 위해 파종 단계 중에 웰 사이에 자주 재현탁해야 합니다.
11. 플레이트를 인큐베이터에 20-30 분 동안 다시 넣으십시오. 세포 방울을 방해하지 않도록주의하고 세포가 플레이트에 초기 부착물을 형성하도록하십시오.
12. 20-30분 후, 각 웰의 벽에 250μL를 피펫팅하여 따뜻한 공동 배양 배지 + ROCK-I를 각 웰에 추가한 다음 반대쪽의 동일한 웰 벽 아래로 250μL를 추가합니다. 접시를 인큐베이터로 되돌립니다.
13. 파종 다음 날 (공동 배양 1 일차) 플레이트를 검사하십시오. 상당한 세포 파편이나 죽은 세포가 있는 경우 배지를 ROCK-I가 포함된 새로운 공동 배양 배지로 교환하십시오. 그렇지 않으면, 파종 후 2일째(공동배양 2일차)에 배지를 ROCK-I가 없는 공동배양 배지로 변경한다. 일주일에 두 번 반 중간 교환 (50 %를 흡인하고 증발을 고려하여 최종 부피의 60 % 추가)을 수행하십시오.
14. 단일 웰 30mm 유리판(재료 표)이 있는 MEA 시스템을 사용하는 경우 플레이트 준비에 2일 이상이 소요될 수 있습니다. 이 작업을 수행하려면 아래 단계를 따르십시오.
15. 이전 MEA 배양에서 0.05% 트립신으로 5-15분 동안 세포와 세포 파편을 들어 올립니다.
16. 트립신을 흡입하고 물로 3 번 헹굽니다.
17. 70 % 에탄올을 첨가하여 소독하고 후드에서 10 분 동안 배양하십시오. 에탄올을 흡입 한 다음 물로 세 번 헹굽니다.
18. 물에 프로테아제 효소가 함유 된 1 % 음이온 세제를 바르십시오. 접시를 뚜껑으로 덮고 열가소성 필름과 알루미늄 호일로 싸서 실온에서 밤새 로커에 두십시오.
19. 세제를 흡입 한 다음 물로 세 번 헹굽니다.
20. 플레이트를 보관할 계획이라면 충분한 양의 물을 추가하십시오. 접시를 뚜껑으로 덮고 열가소성 필름과 알루미늄 호일로 싸서 다음에 사용할 때까지 냉장고에 두십시오.
21. 코팅할 계획이라면 세포 배양 후드 아래에서 표면을 건조시키십시오.
22. 추가 살균이 필요한 경우(예: 이전 감염 또는 최근 사용이 아닌 경우) 이 시점에서만 MEA 플레이트를 후드 아래의 자외선(UV)에 30-60분 동안 노출시키십시오.
    알림: 잦은 자외선을 피하면 전극 손상을 방지할 수 있습니다. 플레이트에 혈청이 있을 때 자외선을 사용하면 작동하지 않는 전극이 생성되므로 세척된 플레이트에만 사용해야 합니다.
23. 플레이트가 완전히 건조되면 1분 동안 플라즈마 청소를 진행하여 MEA 플레이트의 유리 표면을 충전하고 코팅 효과를 향상시킵니다. MEA 플레이트 세척-도금 사이클의 4-5 사이클마다 적어도 한 번씩 플라즈마 청소.
    1. 대안으로, 플라즈마 세척이 불가능하거나 보증되지 않는 경우 MEA 플레이트의 표면을 덮을 수 있는 충분한 양의 FBS 함유 배지를 추가하고 밤새 인큐베이터로 되돌립니다.
24. 위의 섹션 6에서 설명한 대로 PLO/라미닌 코팅을 사용하십시오. 플라즈마 세척 또는 흡인 직후 PLO 용액(PBS 중 100μg)을 첨가하고 FBS 함유 배지를 헹구십시오.
25. 세포를 위와 같이 다음 밀도로 플레이팅한다: 1 x 10 5 hiPSC-A/플레이트 및 5 x 10⁵ hiPSC-MN/플레이트.

10. 다중 전극 어레이 기록

1. 200Hz 고역 통과 및 3kHz 저역 통과 필터가 있는 버터워스 필터를 사용하여 12.5kHz 샘플링 주파수에서 원시 전압 데이터를 추출합니다. 스파이크 인식을 기준선에서 6 표준 편차 ≥전압의 순간 시점으로 설정합니다. 버스트를 100ms 동안 >5개의 스파이크가 있는 활동으로 식별합니다. 전체 활성 전극의 35% 이상이 100ms 이내에 발사되고 네트워크 버스트당 최소 50개의 스파이크가 발생하는 경우 네트워크 활동을 정의합니다.
2. 공동 문화(CC) 1일차 이후에 가능한 한 빨리 녹음을 시작하십시오.
   알림: CC Day 3 이전에는 전기 활동이 거의 기록되지 않습니다.
3. 유사한 밀도로 병렬 배양을 플레이트하고 생화학 분석, 면역세포화학(ICC) 또는 qPCR을 위한 적절한 배양 플레이트 또는 커버슬립에서 복제합니다.
4. 5%에서 37°C ad_CO2 로 설정된 온도로 녹음을 수행합니다. 플레이트를 기계로 옮기고 녹음하기 전에 최소 5분 동안 평형을 이루도록 합니다.
5. 실험 설계에 따라 격일로 또는 매주 1-15분에 걸쳐 기준 활동을 기록합니다. 매체 교환 후 최소 1시간 동안 기록하지 말고 모든 미디어 교환 후 24시간 동안 기다리는 것이 좋습니다.
6. 오염을 방지하려면 멸균 플레이트의 뚜껑을 멸균 후드 외부에서 열어야하는 기록 (즉, 약물 화합물의 적용) 후에 배지를 변경하십시오 (즉, 9.14 단계와 같이 절반 배지 교환). 플레이트가 약물 치료 이후에도 계속 사용될 경우 완전한 배지 교환 및 세척을 수행하여 약물을 씻어냅니다.
7. 분석을 위해 각 조건에 대해 최소 3개의 기술 및 생물학적 복제를 사용합니다. 전기 생리 학적 데이터를 n ≥ 3 회 반복의 수단으로 표현합니다.

11. 다중 전극 어레이에 대한 약리학적 분석

1. 실험 질문에 따라 공동 배양의 다른 조합을 사용하십시오 : ALS 뉴런과 대조군 성상 세포, ALS 성상 세포가있는 조절 뉴런, ALS 뉴런 및 성상 세포, 제어 뉴런 및 성상 세포.
2. 뉴런 또는 성상 세포를 표적으로 하는 화합물의 일시적인 전기생리학적 효과를 조사할 때 플레이트 뚜껑을 제거하고 기계 뚜껑을 닫은 상태에서 최소 1분 동안 기준선 활동을 기록합니다.
3. 전기생리학적 기록을 중단하지 않고 기계의 뚜껑을 수동으로 열고 여러 웰을 처리하는 경우 멀티채널 피펫을 사용하여 25μL의 배지를 적절한 약물 비히클(일반적으로 신선한 배지)과 교환합니다. 뚜껑을 수동으로 닫습니다.
4. 추가 1분 동안 기록합니다(또는 배양을 회복해야 하는 중요한 차량 유발 변화가 있는 경우 그 이상).
5. 수동으로 뚜껑을 다시 열고 동일한 차량에서 25μL의 배지를 관심 약물과 교환하십시오. 기기의 뚜껑을 닫고 녹음을 계속합니다.
   참고: 기록 기간과 투여된 약물/비히클의 양은 실험 질문에 따라 다르거나 최적화해야 할 수 있습니다.
6. 분석 목적으로 차량의 추가가 전기 생리 학적 매개 변수에 큰 변화를 유발하지 않는지 확인하십시오. 비히클 추가 후와 비교하여 약물 후 활동의 백분율 변화를 계산하고 조건 간에 비교합니다.
7. 후보 질병 수정 약물과 같은 종단 전기생리학적 효과를 조사하려면 11.2단계에 설명된 기준 활성을 기록합니다. 이를 위해 적절한 비히클에 관심 약물이 포함된 공동 배양 배지 또는 비히클만 포함된 배지를 사용하십시오.
8. 분석 목적을 위해, ALS 또는 약물로 종단적으로 처리된 대조군 공동배양물로부터의 시점 기록을 서로 대조 조건과 비교한다.

결과

hiPSC-MN 및 척수 hiPSC-A의 생성을 위한 척수 패터닝 프로토콜은 그림 1에 요약되어 있습니다. 이 프로토콜에서 hiPSC는 비 합류 콜로니로 유지되고 계대됩니다 (그림 2A). 신경 발생은 LDN193189 및 SB431542의 첨가에 의한 이중 SMAD 억제를 통해 개시 (신경 유도)되며, 각각 골 형태 형성 단백질 (BMP) 및 형질 전환 성장 인자 베타 (TGF-β) 경로를 비활성화합니다. 이 단계에서는 hiPSC를 부착성 매트릭스, 즉 기저막 매트릭스에 플레이팅하여 신경상피와 유사한 2D 배양을 생성하는 단층 기반 방법이 사용됩니다. 형태 학적으로 신경 유도는 큰 핵과 둥근 모양을 가진 iPSC에서 큰 세포질과 원통형으로 단단히 압축 된 신경 상피 (줄기) 세포로의 전환으로 표시됩니다. 이 세포들은 수평과 수직으로 분열하여 다층 상피를 생성합니다 (그림 2B

토론

현재까지, 성상 세포-뉴런 공동 배양의 전기생리학적 기록을 위한 hiPSC- 및 MEA-기반 방법은 간질⁹의 시험관 내 모델링에 대한 보다 광범위한 사용과 대조적으로, ALS⁶ 분야에서 제한적인 적용을 발견하였으며, 여전히 완전한 인간 플랫폼에서는 그렇지 않다. 그러나 이 플랫폼은 신경 과흥분성의 메커니즘, 신경독성에 대한 성상세포의 기여 또는 질병 진행에서 네트워크 활동의 역할과 같은 ALS 연구에서 병태생리학적으로 관련된 질문을 해결할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 또한, 이 플랫폼은 시험관 내에서 9개월 이상 전향적인 전기생리학적 데이터의 수집을 허용하고, 따라서^{치료 잠재력2}을 갖는 화합물을 시험하기 위한 접근법을 제공한다.

문헌에서 발견되는 hiPSC-N 및 hiPSC-A의 생성을 위한 프로토콜은 다른 요인들...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10cm 멸균 배양 플레이트	Falcon	353003
25 cm2 멸균 배양 플라스크	Falcon	353136
2-Mercaptoethanol (β-ME)	Thermofisher	21985023	Working concentration 110 µ M
500 mL 0.2 &마이크로; m CA 필터 시스템	Corning	430769
5 mL 피펫	Falcon	357543
6 웰 멸균 배양 플레이트	Falcon	3046
Amphotericine B	Gibco	15290018	작업 농도 2.0 μ 프로
테아제 효소가 함유된 g/mL 음이온 세제 - Terg-A-Zyme	Sigma-Aldrich	Z273287	작업 농도 1% m/v
아스코르브산(ASAC)	Sigma	A4403	100mg을 250mL의 dH2O에 용해하면 0.4mg/ml 스톡을 얻을 수 있습니다. 0.22 µ를 통한 멸균 필터; m 필터, 부분 표본 및 -80에서 동결 ºC. 사용을 위해 1:1000에서 희석합니다. (작업 농도 0.4 & micro; g/mL)입니다.
Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W)	Axion	OPT-24
Axion Edge MEA 플랫폼	Axion	Maestro Edge
Basement Membrane matrix - Matrigel	Corning	354277	프로토콜 내 상세
정보 탁상용 현미경(멸균 세포 배양 후드)	Zeiss	415510-1100-000	Primo Vert
Bicuculline	Sigma Aldrich	14340	작업집중10 μ M
섬모 neurotrophic factor (CNTF)	Peprotech	450-13	100 µ를 용해하십시오; g를 멸균 PBS 1mL에 넣은 다음 멸균 0.1% BSA-PBS 9mL를 10 &마이크로에 첨가합니다. g/mL입니다. -80에서 부분 표본 및 동결 ºC. 1:1000에서 희석하여 사용합니다. (작업 농도 10ng/mL).
AirGas/Harris	9296NC		용 CO2 탱크 및 레귤레이터
			디졸브 250 &마이크로; 2.0387 mL의 DMSO에서 g를 사용하여 250 µ를 얻습니다. M 재고. -80에서 분취 및 동결 ºC. 사용을 위해 1:2000을 희석합니다. (작업 농도 125 nM).
시안키살린  (CNQX)	시그마 알드리치	C239	작업 집중도 50 μ M
Dihydrokainic acid (DHK)	Tocris	111	작업 농도 50 μ M 및 300 μ M
DMEM/F12	Thermofisher	113300	작업 농도 1x
필수 8 중간 + 필수 8 보충제	Thermofisher	A1517001	필수 8 (10x)   보충제 10 mL와 필수 8 성장 배지 (1x)를 결합합니다
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermofisher	16140071	작업 농도 1x
Glial 세포주 유래 신경 영양 (GDNF)	Peprotech	450-10	100 &마이크로를 용해하십시오; g를 PBS 1mL에서 100 &마이크로로; g/mL를 선택한 다음 9mL의 멸균 0.1% BSA-PBS를 10 µ에 첨가합니다. g/mL입니다. -80에서 부분 표본 및 동결 ºC. 1:1000에서 희석하여 사용합니다. (작업 농도 10ng/mL).
Hemocytometer	Election Microscopy Sciences	63510-20
Heparin	Millipore-sigma	H3149-100KU	PBS 100mL에 200mg을 용해하면 2mg/mL의 원액을 얻을 수 있습니다. 15 mL 및 500 µ로 스톡을 분주합니다. L 튜브. 사용을 위해 1:1000으로 희석하십시오. (작업 농도 2 & 마이크로; g/mL)입니다.
습도 조절식 세포 배양 인큐베이터	ThermoFisher	370	37로 설정 º C, 5 % CO2
인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF-1)	R & D 시스템	291-G1-200	디졸브 200 & 마이크로; g를 PBS 2 mL에서 100 &마이크로로; g/mL, 그런 다음 10 &마이크로를 만들기 위해 0.1%BSA-PBS의 18mL를 추가합니다. g/mL 재고 및 -80 ºC. -80에서 부분 표본 및 동결 ºC. 10 µ 희석; 1의 g/mL 재고: 1000 사용. (작업 농도 10ng/mL).
Kainc acid	Abcam	ab144490	작업 농도 5 μ M
녹아웃 세럼 대체품(KSR)	Thermofisher	10828	작업 농도 1x
Laminin	Thermofisher	23017-015	원액 1 mg/mL, 작업 농도 10 &마이크로; g/mL (코팅), 1 & 마이크로; g/mL (세포 매체)
LDN193189	Stemgent	04-0074	LDN 2mg을 500 마이크로로 용해합니다. 10mM 스톡을 얻기 위한 클로로포름의 L. 이것을 분취하고 -80 ºC에서 동결합니다. 사용을 위해 먼저 스톡 1-10을 DMSO [1mM]로 희석한 다음 1mM의 1:5000을 원하는 매체에 희석하여 0.2 µ를 얻습니다. M 작업 용액
L-Glutamine	Thermofisher	25030	작업 농도 100x
MEA 유리판	다중 채널 시스템	60MEA200/30iR-Ti-gr
다중 채널 Pipet P200	Gilson	PJ22224
Neurobasal	Thermofisher	21103049	작업 농도 1x
비필수 아미노산(NEAA)	Thermofisher	11140050	작업 농도 100x
Pencillin/Streptomycin	Thermofisher	15140122	작업 농도 100x
폴리오르니틴(PLO)	Sigma-Aldrich	P3655	100mg을 ddW 1mL에 용해시켜 100mg/mL 원액을 얻습니다. 주식을 100 µ로 분취하십시오. L 튜브. (작업농도 100 &Micro; g/mL)
염화칼륨(KCl)	NA		작업 농도100mM
푸르모르파민(PMN)	밀리포어-시그마	540223	9.6mL의 DMSO에 5mg을 용해하여 1mM 용액을 얻습니다. -80에서 부분 표본 및 동결 ºC. 사용을 위해 1:1000으로 희석합니다. (작업 농도 1 &Micro; M)을 사용합니다.
재조합 인간-뇌 유래 신경영양인자(BDNF)	Peprotech	450-02	원심분리기 재구성 전 잠깐. 100 & 마이크로를 용해하십시오. g를 1 mL의 PBS에서 100 &마이크로로; g/mL를 선택한 다음 9mL의 멸균 0.1% BSA-PBS를 10 µ에 첨가합니다. g/mL입니다. -80에서 부분 표본 및 동결 ºC. 1:1000에서 희석하여 사용합니다. (작업 농도 10ng/mL).
레티노산(RA)	Sigma	R2625	100mg을 DMSO 3.3mL에 용해시켜 100mM의 원액을 얻습니다. 주식 부분 표본 100 µ L/튜브 및 -80 ºC에서 동결. 200 & 마이크로를 취하십시오. 100mM 스톡을 L로 만들고 10배(DMSO 1.8mL 추가)를 희석하여 10mM 스톡을 만듭니다. 부분 표본 50 &마이크로; L/튜브  -80 ºC에 보관하십시오. 사용을 위해 1:10000에 희석합니다. (작업 농도 2 & 마이크로; M)을 사용합니다.
ROCK-I는	Peprotech	1293823	1480 µ에 5mg을 용해시킵니다. 10mM 스톡을 얻기 위해 dH2O의 L, -80 ºC에서 분취 및 동결. 사용을 위해 1:500에서 희석합니다. (작업농도 20 &마이크로; M)을 사용합니다.
SB431542	Sigma	S4317	5mg을 1.3mL의 DMSO에 용해시켜 10mM의 원액을 얻습니다. -80에서 분취 및 동결 ºC. 사용을 위해 1:1000에서 희석합니다. (작동 con 10 & micro; M)
멸균 세포 배양 후드	Baker Company	SG-600
보충제 B - B27 보충제	Thermofisher	21985023	작업 농도 50x
보충제 N - N2 보충제	Thermofisher	17502048	작업 농도 100x
탁상용 세포 배양 원심 분리기	ThermoFisher		75004261 Sorvall Legend X1R
열가소성  필름 - Parafilm		PARAFILM P7793
조직 해리 프로테아제 - Dispase	StemCell Technologies	7923	작업 농도 1x
트립신 억제제	Sigma	T6522-1G	100mL ddH2O에 1g을 용해하여 10mg/mL 스톡을 얻습니다. 분취량으로 4 ºC에 보관하십시오. 사용을 위해 트립신 부피를 1:10으로 희석합니다. (작동 농도 1 mg/mL).
트립신-EDTA (0.05 %)	써모 피셔	2530054	작업 농도 1x
수조	ThermoFisher	2332	Isotemp