대식세포식세포의 중간엽 줄기세포 조절; 수량 및 이미징

요약

여기에 제시된 것은 pH 에 민감한 형광 분자에 공주되는 비협화효모(zymosan) 입자의 대식세포(MΦ) 식세포증의 중간엽 줄기세포(MSC) 중재조절의 동적 이미지를 정량화하고 생성하는 프로토콜이다.

초록

중간 엽 줄기 세포 (MSC)는 전통적으로 그들의 재생 특성에 대 한 공부 되었습니다., 하지만 더 최근에, 그들의 면역 조절 특성 최전선에 있다. 그(것)들은 면역 세포 활동과 상호 작용하고 통제합니다. 이 연구의 초점은 대식세포 활성의 MSC 조절입니다. 대식세포(MΦ) phagocytosis는 감염에 대한 선천적인 면역 계통 반응의 중요한 부분이며, MSC가 이 반응을 조절하는 메커니즘은 적극적인 조사를 받고 있습니다. 여기에 제시된 MΦ phagocytosis의 비편화 된 자모산 입자를 pH 에 민감한 형광 분자에 접합 하는 방법 MSC와 공동 배양 하는 동안. 식세포 활성이 증가하고 표지된 zymosan 입자가 phagolysosome의 산성 환경 내에서 동봉됨에 따라 pH 에 민감한 분자의 형광 강도가 증가합니다. 적절한 발각 및 방출 파장으로, 식세포 활성은 형광 분광계를 사용하여 측정되고 운동 데이터는 70 분 동안 상대 형광 단위의 변화로 제시된다. 이 정량적 데이터를 지원하기 위해, phagocytic 활동의 변화는 동적 이미징을 사용하여 시각화됩니다. 이 방법을 사용한 결과는 공동 배양시 MSC가 순진한 및 IFN-γ 처리MΦ의 비편화 자모산의 MΦ phagocytosis를 향상시킨다는 것을 보여줍니다. 이 데이터는 선천적인 면역 계통의 MSC 규정의 현재 지식에 추가합니다. 이 방법은 근본적인 세포 및 분자 기계장치를 완전히 묘사하기 위하여 미래 조사에 적용될 수 있습니다.

서론

중간 엽 줄기 세포 (MSC)는 결합 조직 세포를 초래하는 전구 세포입니다. MSC는 성인 포유류 조직에 존재하며 골수^1로부터분리 될 수 있습니다. 그들의 면역 조절 특성 때문에, 이들 세포는 널리 연구된다^2. T세포^3,4,5,6의 MSC 조절에 초점을 맞춘 초기 연구는 최근에는 선천성 면역의 주요 세포 성분인 대식세포 세포(MΦ)의 조절에 초점을 맞추고 있으며,^{7, 8,9,10,11,12,13,14의} 증가된 관심을 받고 있습니다.

프로토콜

참고: 모든 중간 제제 및 세포 배양 기술은 라미나르 흐름을 가진 생물 안전 캐비닛을 사용하여 무균 조건하에서 수행됩니다. 설명된 모든 배양 배양 단계는 37°C, 5% CO₂및 95% 습도의 대기를 유지하도록 설계된 인큐베이터를 사용하여 수행됩니다.

1. 세포 배양

1. 성장 매체의 준비
   1. MSC와 LADMAC의 경우 50mL의 FBS와 5mL의 항생제/항마이코틱 믹스를 500mL의 높은 포도당 DMEM에 추가하십시오.
   2. MΦ의 경우, 50mL의 FBS, LADMAC 상태 배지 100mL(섹션 1.2의 단계에 따라 제조됨), 5mL의 100x 항생제 믹스를 500mL의 고혈당 DMEM에 추가한다.
      참고: LADMAC 세포는 MΦ 세포의 성장을 지원하는 데 필요한 식민지 자극 인자(CSF-1)를 생성합니다.
2. LADMAC 조절 매체의 준비
   1. 냉동 육수에서 LADMAC 세포를 종자하려면, 5T75cm cm² 세포 배양 처리 플라스크의 각각 1.1항에서 성장 배지의 19 mL을 추가하고 37 °C로 평형하기 위해 15 분 동안 세포 배양 인큐베이터에 배치.
   2. 한편, 37°C 수조에서 2-3분....

결과

모든 시간 지점에서 각 그룹에 대한 평균 ± SEM을 계산한 후 데이터는 Y축을 상대형 형광 강도로, X축을 시간으로 선 그래프 형식으로 표시됩니다. 보충 파일 1스프레드시트 형식으로 96웰 플레이트의 운동 판독에서 원시 데이터의 예를 제공합니다.

본 연구에서는, 도 3A에제시된 최적의 결과, 및 표 3에서 제시된 최적 결과는 MSC와의 공동 배양이 대식세포의 교피 활성을 향상시킨다는 것을 보여주고, 2) IFN-y 처리는 대식세포의 활성을 감소시키고, 3) MSC와 공동 배양하여 MΦ phagocytic 활성을 부분적으로 구출시킨다. 최적의 세포 밀도는 이러한 연구에서 중요하며 MΦ가 밀도가 너무 낮게 도금되면 형광 강도의 변화를 감지할 수없습니다(그림 3B). 도 3C는

토론

pH 에 민감한 염료에 컨쥬커드된 생체입자를 이용한 식세포증의 분석은 기존의 형광표지^{입자(12,19,20)에}비해 유리하다는 비교적 새로운 도구이다. 기존의 형광 라벨 입자를 사용하면 엔드 포인트 분석만 가능합니다. 검출은 식세포에 의해 채택되지 않은 입자를 세척하거나 담금질 한 후 형광 현미경 검사및 /또는 분광로메로 수행됩니다. 분광성법에서 유래된 정량적 데이터는 비침범입자를 검출할 수 있는 잠재력을 가지며, 세포내 입자만 정량화하는 이미지 분석은 기존의 형광 현미경^{시스템(14)을}사용하여 지루하고 시간이 많이 소요된다. pH에 민감한 염료형광에 공인된 바이오입자는 식염수와 같은 산성 환경에서만 불필요하며, 따라서 지루한 세척 및 담금질 단계는 불필요합니다^14. 또한 pH 에민감.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
96웰 블랙 폴리스티렌 마이크로플레이트	MilliporeSigma	CLS3603-48EA
0.4% 트리판 블루 솔루션	MilliporeSigma	T8154-20ML
15 mL 및 50 mL 원추형 멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브	ThermoFisher	339653
4-웰 챔버 커버글라스 w/ 비탈착식 웰	ThermoFisher	155382PK
항생제-항진균제(100X)  Gibco	ThermoFisher	15240096
Axiobserver 7 이미징 시스템	Zeiss
소 혈청 알부민 (BSA)	MilliporeSigma	A8806-1G
세포 리프터	MilliporeSigma	CLS3008-100EA
배양 플라스크, 조직 배양 처리, 표면 면적 75  cm2, 경사진 목, 캡 포함, 여과된	MilliporeSigma	C7231-120EA
D1 ORL UVA [D1]	ATCC	CRL-12424	Mouse MSC Cell Line
DMEM, High Glucose	ThermoFisher	11965092
Fetal Bovine Serum, 적격, 열 불활성화	ThermoFisher	16140071
혈구분석기	FisherScientific	02-671-51B
I-11.15	ATCC	CRL-2470	마우스 MΦ 세포주
: LADMAC: 세포주	: ATCC	CRL-2420	LADMAC 세포는 성장인자 콜로니 자극 인자 1(CSF-1)을 분비합니다.
생세포 이미징 솔루션	ThermoFisher	A14291DJ
PBS, pH 7.4	ThermoFisher	10010031
pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate	ThermoFisher	P35365
Recombinant Murine IFN-γ	Preprotech	315-05
Spectramax i3X	분자 장치
멸균 일회용 진공 필터 유닛, 250 mL, 0.2 µ m	ThermoFisher	568-0020
멸균 주사기 필터, 0.2 마이크로미터	ThermoFisher	723-2520
조직 배양 처리 배양 접시, 100 mm x 20 mm	MilliporeSigma	CLS430167-100EA
트립신-EDTA (0.05%), 페놀 레드	ThermoFisher	25300054

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