우리는 살아있는 세포에 있는 개별 적인 macropinosomes에 있는 pH, 산화 사건 및 단백질 소화를 측정하기 위한 프로토콜을 기술합니다. 이중 불소 경 미세 검사법과 인구 기반 기술에 비해 제공하는 이점에 중점을 둡니까.
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이 논문에서
요약
초록
최근 몇 년 동안, 매크로 피노세포증의 분야는 급속하게 성장하고있다. Macropinocytosis는 선천적인 면역 세포가 유기체 항상성 및 면역을 유지하는 중앙 기계장치로 나타났습니다. 동시에 동종 요법 역할과는 달리 암 및 바이러스 감염을 포함한 다양한 병리를 유발할 수도 있습니다. 다른 내분세포증 모드와 달리, 매크로피노좀의 성숙을 연구하기 위해 개발된 도구는 여전히 저개발 상태입니다. 여기서 이 프로토콜은 조기 및 성숙한 매크로피노좀의 루멘 내에서 레독스 환경을 연구하기 위한 새로 개발된 도구에 대해 설명합니다. pH를 평가하는 비메트릭 형광 현미경 검사를 사용하기 위한 방법론, 반응성 산소 종의 생산 및 살아있는 세포에서 개별 거형의 루멘 내의 분해 용량이 설명되어 있습니다. 단일 세포기관 측정은 인구 기반 접근법으로 종종 손실되는 괄면적 이질성을 드러내는 이점을 제공합니다. 프로브 선택, 계측, 교정 및 단일 세포 대 인구 기반 방법을 포함한 이중 형광비율 현미경검사법의 기본 원리에 중점을 둡히 배치됩니다.
서론
Macropinocytosis는 거시화1,2에게불린 막 결합 세포질 세포체로 세포외 유체의 다량의 uptake를 말합니다. 아메바 디티오스텔라늄 spp와같은 자유 생활 단세포 유기체에 의해 수행되는 매우 보존된 과정입니다. 3,뿐만 아니라 안토조안4 및 메타 조아2. 대부분의 세포에서, macropinocytosis는 유도된 사건입니다. 세포 표면 수용체의 결찰은 주름이라고 불리는 액틴 구동 플라즈마 멤브레인 확장의 돌출을 유도합니다. 일부 제대로 이해 메커니즘에 의해, 그 주름의 일부, 거시형을 형성하기 위해 자신의 말단 팁에서 밀봉 (비록이 방법 종이의 범위를 넘어, 매크로 피노 세포증의 역학에 대한 자세한 검토를 위해, 참조참조 를참조하시기 바랍니다1,2,5,6,....
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프로토콜
1. 세포 준비
- 37°C에서 Raw264.7 셀을 성장시키고 RPMI의 5% CO2 ~ 70% 결합하여 10%의 열 비활성화 세럼으로 보충합니다.
- 분석 하루 전에, 종자 raw264.7 세포의 밀도에 5 x 104 96 웰 플레이트에서 잘 당 세포. 각 우물에 100 μL의 성장 매체가 포함되어 있는지 확인합니다. 96웰 플레이트에 검은 면과 이미징용 유리 바닥이 있는지 확인합니다.
참고 : 여기에서 96 웰 플레이트가 이미징에 사용되었습니다. 96웰 플레이트는 더 큰 이미징 챔버에 비해 소량의 세포및 시약을 사용할 수 있게 합니다. 그러나, 화상 진찰 살아있는 세포를 위해 디자인된 어떤 챔버든지 이용될 수 있고, 시약을 그에 따라 확장될 수 있습니다. - 분석 당일, 우물이 적어도 70 % 컨실수 있는지 확인하십시오.
2. 매크로 피노솜 pH 측정
- 1절에서와 같이 셀을 준비합니다.
- 37°C에서 HBSS 100 μL로 모든 우물을 씻으실 수 있습니다.
- 각각 100 μL의 TMR 라벨 70 kDa dextran 및 0.025 mg/mL의 TMR 라벨70 kDa dextran 및 0.025....
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결과
거형 pH를 측정할 때 산성화의 역학을 측정할 수 없는 기간이 있습니다. 이 기간은 dextran 로딩 상(도 2C 및 도 3C, D의회색 상자)에 해당하며 사용되는 셀 유형에 따라 달라집니다. 로딩 상의 길이는 (i) 세포의 대식세포 활성 및 (ii) 사용되는 계측기의 감도에 따라 달라집니다. 각 실험의 시작 시 이 기간을 조정하여 형광및 TMR 채널 모두에 대해 4:1 이상의 신호:노이즈 비가 달성되는 것을 권장합니다. 처리되지 않은 세포에서, 형광 방출은 거형이 산성화함에 따라 점진적으로 약해져야 하며, TMR 신호는 일정하게 유지되거나 밝아져야 합니다. 매크로피노좀의크기(16,21)에서수축하면 TMR 신호가 밝아질 수 있다. 이는 형광 신호가 유기체.......
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토론
대식세포, 섬유아세포, 심지어 Dictyostelium spp에서 대식세포 섭취의 저처리량 측정과 높은 처리량 측정을 위한 프로토콜의 수가 많지만. 3,7,31,32,33,이러한 동적 구획의 발광 생화학을 측정하기 위한 시도는 거의 이루어지지 않았습니다. 이는 다른 내식 구획을 피하면서 거시적인 구획을 효율적으로 표적으로 삼을 수 있는 프로브의 빈약함 때문일 수 있습니다. 여기에 설명된 기술은 거시피노솜 내의 pH, 산화 이벤트 및 단백질 소화의 동적 측정을 위한 형광 프로브를 표적으로 하는 기술이다.
비측정형 현미경 검사는 내시경 pH가 수십 년 동안 측정된 1차 기술이었습.......
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
우리는 캘거리 대학의 지원에 감사드립니다. 또한 시약, 장비 및 유용한 토론에 대한 로빈 예이츠 박사에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 검은 벽 96 웰 플레이트 | PerkinElmer | 6005430 | |
| CypHer5e, NHS 에스테르 | Cytiva | PA15401 | |
| Dextran-amino 70 kDa | Invitrogen | D1862 | |
| DQ-ovalbumin | Invitrogen | D12053 | |
| FITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1823 | |
| HBSS | Gibco | 14287 | |
| Nigericin | Sigma Aldrich | N7143 | |
| OxyBurst Green-SE | Invitrogen | D2935 | |
| pHrodo Red, SE | Invitrogen | P36600 | |
| Raw264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI medium | Gibco | 11875093 | |
| SP5 컨포칼 현미경 | Leica | - | |
| TRITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1819 | |
| 접시 | Ibidi | 81156 |
참고문헌
- Canton, J. Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. SnapShot: Macropinocytosis. Cell. 169, 766(2017).
- Williams....
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재인쇄 및 허가
