악성 말초 신경 시스 종양 세포에서 Floxed 대립 유전자의 Ex vivo 절제에 의한 종양 발생에서 유전자 기능 정의

요약

여기에서, 우리는 유전자 조작된 마우스 모델 유래 종양 에서 생체내에서 배아 치사되는 유전자 녹아웃을 수행하기 위한 프로토콜을 제시하고, 이어서 녹아웃이 종양 성장, 증식, 생존, 이동, 침윤 및 시험 관내 및 생체내에서 전사체에 미치는 영향을 평가한다.

초록

인간 암의 핵심 단백질을 정확하게 표적으로 삼는 신약 개발은 암 치료제를 근본적으로 변화시키고 있습니다. 그러나 이러한 약물을 사용하기 전에 표적 단백질이 특정 암 유형에서 치료 표적으로 검증되어야합니다. 이 검증은 종종 암의 유전자 조작 마우스 (GEM) 모델에서 후보 치료 표적을 코딩하는 유전자를 녹아웃하고 이것이 종양 성장에 어떤 영향을 미치는지 결정함으로써 수행됩니다. 불행히도, 기존의 녹아웃에서의 배아 치사율과 조건부 녹아웃에서의 모자이크주의와 같은 기술적 인 문제는 종종이 접근법을 제한합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, GEM 모델에서 생성된 악성 말초 신경 시스 종양(MPNSTs)의 단기 배양에 관심 있는 플록싱된 배아 치사 유전자를 절제하기 위한 접근법이 개발되었다.

이 논문은 적절한 유전자형을 갖는 마우스 모델을 확립하고, 이들 동물로부터 단기 종양 배양을 도출한 다음, Cre 재조합효소 및 강화된 녹색 형광 단백질(eGFP)을 발현하는 아데노바이러스 벡터를 사용하여 플록싱된 배아 치사 유전자를 제거하는 방법을 기술한다. 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 아데노바이러스로 형질도입된 세포의 정제 및 유전자 절제가 세포 증식, 생존력, 전사체 및 동위원소 동종이식편 성장에 미치는 영향의 정량화를 상세화한 다음, 상세히 설명한다. 이러한 방법론은 시험관내 및 생체내에서 치료 표적을 확인하고 검증하기 위한 효과적이고 일반화 가능한 접근법을 제공한다. 이러한 접근법은 또한 감소된 시험관내 성장 아티팩트를 갖는 저통과 종양 유래 세포의 재생 가능한 공급원을 제공한다. 이를 통해 표적 유전자의 생물학적 역할은 분비물에 의해 매개되는 이동, 침윤, 전이 및 세포간 통신과 같은 다양한 생물학적 과정에서 연구될 수 있게 한다.

서론

지난 이십 년 전에 인간 암의 치료는 DNA를 손상시키거나 DNA 합성을 억제함으로써 빠르게 증식하는 세포 집단을 광범위하게 표적으로 삼는 방사선 요법 및 화학 요법제에 크게 의존했습니다. 이러한 접근법은 암세포 성장을 억제했지만, 장내 상피 세포 및 모낭 세포와 같은 정상적인 빠르게 증식하는 세포 유형에도 해로운 부작용이있었습니다. 최근에, 암 치료는 개별 환자의 신 생물의 성장에 매우 중요한 신호 전달 경로 내에서 단백질을 정확하게 표적화하는 화학 요법제를 활용하기 시작했습니다. 일반적으로 "정밀 의학"이라고하는이 접근법은 모노클로날 항체 및 소형 분자 억제제의 끊임없이 확장되는 레퍼토리의 개발로 이어졌습니다. 이들 제제는 종양 세포 증식 및 생존을 효과적으로 억제하면서 종래의 화학요법제 및 방사선요법으로 보이는 정상 세포 유형에 대한 해로운 부작용을 회피한다. 인간 암의 치료에 사용되는 모노클로날 항체는 가장 일반적으로 표적 세포 표면 분자, 예컨대 성장 인자 수용체 1 (예를 들어, 막-스패닝 수용체 티로신 키나제의 큰 패밀리) 및 면역 반응 조절제² (예를 들어, 프로그램된 세포 사멸 단백질 1, 프로그램된 사멸-리간드¹)를 표적으로 한다. 소분자 억제제는 세포내 표면 단백질 또는 세포내 위치하는 ....

프로토콜

생쥐와 함께 절차를 수행하기 전에 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용위원회에서 검토하고 승인해야합니다. 이 원고에 설명 된 프로토콜은 사우스 캐롤라이나 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜은 MUSC의 제도적 동물 관리 지침에 따라 적절하게 훈련 된 인력에 의해 수행되었습니다.

1. Erbb4 ^flox 대립유전자에 대해 동형접합성 MPNST를 개발하는 마우스의 생성

1. P0-GGFβ3의 F1 생성을 생성하고; Trp53^+/-; Erbb4^fl/+ P0-GGFβ3을 교미하여 동물; Trp53^+/- 마우스^7과 Erbb4^fl/fl 마우스¹¹. Punnett 사각형 (그림 1)을 사용하여 원하는 P0-GGFβ3으로 충분한 수컷 및 암컷 F1 새끼가 생성되도록하기 위해 번식 계획을 안내하십시오. Trp53....

결과

도 4는 P0-GGFβ3을 형질도입할 때 얻어지는 전형적인 결과를 도시한다; Trp53^-/+; Ad5CMV-eGFP 아데노바이러스 또는 Ad5CMV-Cre/eGFP 아데노바이러스를 갖는 Erbb4^fl/fl MPNST 세포(그림 4A). 배양물을 형광 현미경으로 관찰하여 eGFP 발현 세포를 확인하고 위상차 현미경으로 10x (상단) 및 40x (하단)에서 동일한 분야에 존재하는 총 세포 수를 결정합니다. 이어서, eGFP를 발현하는 세포의 백분율은 원하는 경우 계산될 수 있다. 대표적인 FACS 출력 데이터는 보충 그림 S2에 도시되어 있다. FACS 이후, eGFP 발현 세포의 백분율은 현저하게 증가될 것이며, 각 분야의 거의 모든 세포가 eGFP를 발현한다. 형질감염 효율에 따라 Cre 매개 유전자 .......

토론

여기에 제시된 상세한 방법은 MPNST의 GEM 모델을 사용하여 개발되었습니다. 그러나, 관심있는 종양 조직이 개별 세포 내로 분산될 수 있다면, 이들 방법론은 GEMs에서 발생하는 다양한 종양 유형에 대해 쉽게 적응할 수 있다. 플록스된 대립유전자가 i) 종양을 스크리닝하기에 충분한 마우스를 수득하는 것을 어렵게 만들 수 있는 감소된 생존, 또는 ii) 충분한 종양 보유 마우스를 수득하는 것을 어렵게 만들 수 있는 증가된 종양 잠복기를 초래하지 않도록 하는 것이 중요하다. 플록스 대립 유전자가 생존에 영향을 미치지 않으면 두 코호트의 생존은 동등합니다. 종양 잠복기에 아무런 영향을 미치지 않는 경우, 유사한 시간 과정을 가진 두 코호트 모두에서 동등한 수의 종양 보유 마우스가 발생해야합니다.

유사한 접근법이 유도성 조건부 녹아웃 동물^33,34를 생성하기 위해 조건부 녹아웃 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Ad5CMV-eGFP	유전자 전달 벡터 코어, 아이오와 대학교	VVC-U 아이오와-4
Ad5CMVCre-eGFP	유전자 전달 벡터 코어, 아이오와 대학교	VVC-U 아이오와-1174
알렉사 568 2차 항체	Thermo/Fisher	GaR A11036
Bioconductor 오픈 소스 소프트웨어 바이오 인포매틱	바이오 컨덕터	http://www.bioconductor.org	4.4단계에 사용되는 대체 통계 분석 도구
CD31	Abcam	ab28364
Celigo Image Cytometer	Nexcelom Bioscience	N/A
Cell Stripper	Corning	25-056-Cl	킬레이트제 혼합물
DAB 염색 키트	Vector Labs	MP-7800
DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)	DAVID	https://david.ncifcrf.gov	4.5단계
DMEM	Corning	15-013-Cl
DreamTaq 및 Buffer(유전형 분석 PCR)	Thermo/Fisher	EP0701 및 K1072
erbB4 항체	Santa Cruz	sc-284
erbB4 항체	Abcam	ab35374
erbB4에 사용되는 기능 강화 분석 소프트웨어 항체	Millipore	HFR1: 05-1133
FACS Sorter	BD Biosciences	Aria II
Forskolin	Sigma	F6886
GenomeSpace 도구 및 데이터 소스	GenomeSpace	https://genomespace.org/support/tools/	4.5단계를 위한 여러 유형의 오픈 소스 생물 정보학 도구에 대한 일반 리소스
Glutamine	Corning	25-005-
Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool	Gorilla	N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il	4.5단계에 사용되는 기능 강화 분석 소프트웨어
GSEA Gene Set Enrichment Analysis	Broad Institute	N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp	4.5단계에 사용되는 기능 강화 분석 소프트웨어
HSD: Athymic Nude-FOxn1nu 마우스	Envigo (formerly Harlan Labs)	69
Illumina HiSeq2500 (차세대 DNA 시퀀서)	4.2단계에 사용되는	Illumina	Hi Seq 2500
Lasergene: ArrayStar 유전자 발현 및 변이 분석	DNAStar LaserGene 소프트웨어	N/A	소프트웨어 4.4단계에 사용되는 통계 및 정규화 분석
Lasergene: SeqMan NGen 염기서열 정렬 어셈블리	4.3 단계에 사용되는 소프트웨어 정렬 4.3	N/A	소프트웨어 정렬
Matrigel, 저성장 인자 기저막 매트릭스	Corning	354230
NRG1-beta	사내	SLC에서 생성, R & 에서 상업적으로 이용 가능 D 시스템(396-HB-050/CF).
Nuclear Stain Hoeschst 33342	Thermo	62249
Panther 유전자 온톨로지 분류 시스템	Panther	http://pantherdb.org	4.5단계에 사용되는 기능 농축 분석 소프트웨어
Partek(BWA aligner 및 분석기)	Partek, Ver 7		4.3단계에 사용되는 소프트웨어 정렬 및 통계/정규화
Pen/Strep	Corning	30-002-Cl
프라이머 1 : 5′-CAAATGCTCTCTCTCTGTTCTTTGT GTCTG- 3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 2: 250  bp ErbB4 널 곱 및 350  bp Floxed ErbB4 제품;
프라이머 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 2: 250  bp ErbB4 널 곱 및 350  bp Floxed ErbB4 제품;
Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA ACCCAG-3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 3: 350  bp 야생형 ErbB4 제품.
프로피듐 요오드	피셔	51-351-0
프로테옴 프로파일러 포스포-키나아제 어레이	R& D Systems	ARY003B
실시간 glo	Promega	G9712	생물 발광 세포 생존율 분석
ToppGene Suite	ToppGene	https://toppgene.cchmc.org	4.5단계에 사용되는 기능 농축 분석 소프트웨어
Trizol(산-콰니디늄-페놀 및 콜로포름 기반 시약)	Invitrogen	15596026
Tyramide 신호 증폭 키트	퍼킨 엘머	NEL721001EA

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