형광 표지된 엔드 결합 단백질을 사용하여 생체 내의 동적 마이크로투부레를 이미징하기 위한 프로토콜이 제시되었다. 우리는 C. elegans의후방 측측 마이크로투룰 (PLM) 뉴런에서 동적 마이크로 튜브를 라벨, 이미지 및 분석하는 방법을 설명했다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
뉴런에서, microtubule 방향은 일반적으로 혼합 된 방향을 가지고 플러스 엔드 마이크로 투부와 원점축이 축축을 식별하는 주요 평가자되었습니다. 여기서는 C. elegans의 터치 뉴런의 개발 및 재생 중에 마이크로튜블러 역학 및 성장에 라벨, 이미지 및 분석을 하는 방법을 설명합니다. 마이크로 투덜르 팁의 유전적으로 인코딩 된 형광 기자를 사용하여 축축한 마이크로 투벌을 이미지했습니다. 축 절 에 따라 축 축 재생을 시작 하는 microtubule 동작에 로컬 변경 이 프로토콜을 사용 하 여 정량화될 수 있습니다. 이 분석은 다른 뉴런과 유전 적 배경에 적응하여 다양한 세포 프로세스에서 미세 tubule 역학의 조절을 조사할 수 있습니다.
서론
뉴런은 수상월리, 세포 몸, 축축및 시냅스와 같은 특수 구획을 갖춘 정교한 아키텍처를 가지고 있습니다. 신경 세포골격은 마이크로투블러, 마이크로필라멘트 및 신경필라멘트 및 그들의 뚜렷한 조직이 구조적이고 기능적으로 신경 구획을 지원하며,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . 수년에 걸쳐, microtubule 조직은 신경 극성 및 기능의 중요한 결정요인으로 확인되었습니다. 뉴런이 개발 또는 재생 중에 구조적 리모델링을 거치면서, 마이크로튜블러 역학 및 방향은 다양한 뉴런 구획의 정체성, 편광 된 수송, 성장 및 개발을 결정한다7. 따라서 생체 내에서 마이크....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 리포터 변형: 문화 및 유지 보수
참고: PLM 뉴런에서 마이크로튜블 역학 및 방향을 측정하기 위해, 우리는 EBP-2::GFP를 발현하는 웜 스트레인을 사용하여 터치 뉴런 특이성 프로모터 mec-4(juIs338 allele)18,25,26을사용했다. 우리는이 균주(27)에대한 표준 웜 배양 및 유지 보수 방법을 사용합니다.
- 선충 성장 매체(염화 나트륨 3.0g/L, 염화 2.5g/L 펩톤, 20.0 g/L 한천, 10 mg/L 콜레스테롤(10 mg/mL의 스톡 용액에서 희석)를 물과 오토클레이브로 준비한다.
- 1m알 칼슘 염화, 1mM 마그네슘 황산염 및 25.0 mM 칼륨 인산염 단일 베이직 pH 6.0으로 보충하기 전에 10-15 분 동안 혼합물을 간략하게 식힙니다.
- 멸균 디스펜서를 사용하여 혼합물의 약 9mL를 60mm 페트리 접시에 붓고 실온및 멸균 조건에....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
대표적인 예로, 우리는 PLM 뉴런의 정상 상태 및 재생 축록에서 EBP 혜성의 생체 관측에 설명했다. PLM 뉴런은 시냅스와 짧은 후방 과정을 형성하는 긴 전방 과정을 가진 웜의 꼬리 영역에 위치하고 있습니다. PLM 뉴런은 표피에 가까운 전방 후방 방향으로 성장하고 벌레의 부드러운 터치 감각에 대한 책임이 있습니다. 그들의 단순화된 구조, 및 화상 진찰 및 미세 수술에 대한 편의성으로 인해 PLM 뉴런은 마이크로튜블러 세포골격29,축축운송30,31,재생19,32,뉴런 극성24,33,34,행동 및 노화
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
미세 tubule 역학을 이해하는 것은 수년에 걸쳐 사이토스켈레탈 연구 분야에서 중요한 초점이었습니다. 마이크로튜블러는44,45,46,47의연속적인 과정과 함께 핵형성 및재앙을겪는다. 이러한 정보의 대부분은 무료 대 중합관, 형광 튜룰린 등의 마이크로투룰 성장 아스약과 같은 체외 내 삽을 통해얻어졌다. 형광 및 비 형광 마이크로 투벌의 라이브 관찰은 얇은 세포에서 가능하지만, 마이크로 튜블러 역학의 생체 측정은 도전적이다.
이 형질전환 균주를 사용하여 PVM, ALM 및 AVM과 같은 다른 터치 뉴런도 마이크로튜블러 방향을 평가할 수 있습니다. 여기서 설명된 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이시진과 앤드류 치스홀름에게 초기 지원과 연구에 사용된 균주에 감사드립니다. 세균균 균주 OP50은 NIH 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)에 의해 투자 된 Caenorhabditis 유전학 센터 (CGC)에서 상업적으로 이용되었습니다. 우리는 또한 실험 절차의 표준화에 대한 Dharmendra Puri감사합니다. 이 연구는 국립 뇌 연구 센터 (생명 공학부, 인도 정부의 지원), DBT / 웰컴 트러스트 인디아 얼라이언스 초기 경력 보조금 (그랜트 # IA / E / 18/1/504331)에서 S.D., Wellcome Trust-DBT 인도 얼라이언스 중간 보조금 (그랜트 # IA / I/13/1/500874)의 핵심 보조금에 의해 지원됩니다. CRG/2019/002194)에서 A.G.-R까지
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| CZ18975 웜 균주 | Yishi Jin lab | CZ18975 | Anindya Ghosh-Roy |
| Agarose | Sigma | A9539 | 마운팅 웜 |
| 커버슬립 (18mm x 18mm) | Zeiss | 474030-9010-000 | 마운팅 웜 |
| 가열 블록이 있는 드라이 배 | Neolab | 마운팅 웜 | |
| 유리 슬라이드(35mm x 25mm) | 블루 스타 | 마운팅 웜 | |
| 폴리스티렌 비드 용액(최소 계면활성제를 사용한 수성 매질의 4.55 x 10^13 입자/ml) | Polysciences Inc. | 00876 | 마운팅 웜 |
| 테스트 튜브 | 마운팅 웜 | ||
| OP50 박테리아 균주 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | 웜 처리 |
| 60mm 페트리 플레이트 | Praveen Scientific | 20440 | 웜 처리 |
| 흡인기 / 모세관 | VWR | 53432-921 | 웜 처리 |
| 인큐베이터 | Panasonic | MIR554E | 웜 처리 |
| 플래티넘 와이어 | 웜 핸들링 | ||
| 형광 부착물이 있는 실체 현미경 | Leica | M165FC | 웜 처리 |
| 0.3% 염화나트륨 | 시그마 | 71376 | 선충 성장 매체 |
| 0.25% 펩톤 | T M 배지 | 1506 | 선충 성장 배지 |
| 10mg/mL 콜레스테롤 | 시그마 | C8667 | 선충 성장 매체 |
| 1mM 염화칼슘 이수화물 | 시그마 | 223506 | 선충 성장 배지 |
| 1mM 마그네슘 황산염 헵타하이드레이트 | 시그마 | M2773 | 선충 성장 매체 |
| 2% 한천 | T M 매체 | 1202 | 선충 성장 매체 |
| 25mM 단염기성 인산이수소 칼 | 륨 시그마 | P9791 | 선충 성장 배지 |
| 0.1M 일 염기성 인산 이수소 칼 | 시그마 | P9791 | 1X M9 버퍼 |
| 0.04M 염화나트륨 | 시그마 | 71376 | 1X M9 버퍼 |
| 0.1M 염화 암모늄 | Fisher Scientific | 21405 | 1X M9 버퍼 |
| 0.2M 이염기성 인산수소 나트륨 헵타 하이드레이트 | 시그마 | S9390 | 1X M9 버퍼 |
| 유리 병 | Borosil | 완충기 저장 | |
| 488 nm 레이저 | Zeiss | 화상 진찰 | |
| 5X 대물 | Zeiss | 화상 진찰 | |
| 63X 대물 | Zeiss | 화상 진찰 | |
| 사진 | 기 광농도 | 512 델타 | 화상 진찰 |
| 컴퓨터 체계를 | 인텔 ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz | 이미징 | |
| 에피 형광 현미경 | Zeiss | Observer.Z1 | 이미징 |
| 할로겐 램프 | Zeiss | 이미징 | |
| 수은 아크 램프 | Zeiss | 이미징 | |
| 스피닝 디스크 유닛 | Yokogawa | CSU-X1 | 이미징 |
| ZEN2 소프트웨어 | Zeiss | 이미징 | |
| 이미지 J (피지 버전) | 이미지 분석 및 처리 | ||
| Adobe Creative Cloud | Adobe | 이미지 분석 및 처리 | |
| 이미지 분석을 위한 컴퓨터 시스템 | Dell | Intel ® 핵심 &무역; i7-9700 CPU 3.00GHz | 이미지 처리/표현 |
참고문헌
- Bush, M. S., Eagles, P. A. M., Gordon-Weeks, P. R. The neuronal cytoskeleton. Cytoskeleton: A Multi-Volume Treatise. 3, 185-227 (1996).
- Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the Neuronal Microtubule Cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
- Tas, R. P., Kapitein, L. C.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
