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방법 논문

유전자 발현 측정을 위한 생물막 내 Pseudomonas aeruginosa 에서 총 RNA 분리

2.7K 조회수

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DOI:

10.3791/62755

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2021년 9월 24일

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1Translational Medicine, Hospital for Sick Children, 2Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, 3Microbiology, Department of Pediatric Laboratory Medicine, Hospital for Sick Children, 4Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Hospital for Sick Children

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 고처리량 염기서열분석을 위해 챔버 슬라이드에서 성장한 녹농 균 생물막에서 RNA를 분리하는 방법을 제시합니다.

초록

녹농균(Pseudomonas aeruginosa )은 낭포성 섬유증(CF) 환자의 기도에 감염을 일으키는 기회감염성 세균 병원체입니다. 녹농균(P. aeruginosa )은 외다당류 매트릭스로 보호되는 생물막을 형성하는 능력으로 알려져 있습니다. 이 매트릭스를 통해 미생물은 항생제 치료를 포함한 외부 요인에 대해 더 탄력적으로 대처할 수 있습니다. 연구를 위한 생물막 성장의 가장 일반적인 방법 중 하나는 마이크로타이터 플레이트 또는 챔버 슬라이드입니다. 이러한 시스템의 장점은 여러 성장 조건을 테스트할 수 있다는 것이지만 RNA 추출을 위해 제한된 양의 생물막을 생성한다는 단점이 있습니다. 이 기사의 목적은 고처리량 염기서열분석을 위해 충분한 품질과 양의 소량의 생물막에서 총 RNA를 추출하는 방법에 대한 자세한 단계별 프로토콜을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜은 이러한 생물막 시스템 내에서 유전자 발현을 연구할 수 있게 해줍니다.

서론

낭포성 섬유증(CF) 환자의 폐 감염 및 보철물 관련 감염과 같은 대부분의 만성 세균 감염은 생물막 내 유기체의 성장을 특징으로 합니다. 생물막(biofilm)1 은 주로 다당류(polysaccharides)2로 구성된 기질(matrix)에 둘러싸인 박테리아 군집이다. 생물막 내의 박테리아는 천천히 성장하고, 대사적으로 휴면 상태일 수 있으며, 혐기성, 저산소 상태일 수 있습니다. 생물막은 항생제 침투 감소, 약물 유출 펌프의 발현 증가, 세포 분열 감소와 같은 요인으로 인해 항생제에 대한 내성이 더 강합니다3. 이러한 이유와 다른 이유로 그들은 큰 연구 관심사입니다.

CF 환자에서 만성 녹농균 감염과 같은 지속적인 감염을 정확하게 연구하기 위해서는 생물막 형성에서 볼 수 있는 성장 조건을 체외에서 정확하게 반영해야 합니다. 일반적인 고처리량 방법은 챔버 슬라이드 또는 마이크로타이터 플레이트에서 성장시키고 컨포칼현미경 4으로 생물막 형성을 모니터링하는 것입니다. 플랑크톤 또는 자유 부유 박테리아 생활 방식에서 생물막 박테리아 생활 방식으로의 전환에서 핵심 조절자는 2차 전달자인 cyclic-di-GMP5인 것으로 알려져 있습니다. 증가된 cyclic-di-GMP 수준은 biofilm 성장을 촉진하는 특정 유전자의 발현을 증가합니다. 작은 비코딩 조절 RNA와 정족수 감지도 생물막 형성 조절에 중요한 역할을 합니다5. 추출된 박테리아 RNA를 염기서열분석(sequencing)하여 생물막 유전자 발현을 측정하는 것은 까다로울 수 있습니다. 예를 들어, 녹농균(P. aeruginosa)은 3개의 외다당류(Psl, Pel 및 알긴산)를 생성하며, 이는 생물막에서 상당한 양으로 생산됩니다 6,7. 이러한 다당류는 RNA 추출 및 정제를 방해하여 낮은 수준의 박테리아 mRNA8을 포함하는 불순한 제제를 유발할 수 있습니다. 시판되는 RNA 추출 키트는 플랑크톤 박테리아 배양물에서 고품질 RNA를 생산할 수 있지만 생물막 배양물에서는 잘 작동하지 않을 수 있습니다 9,10,11. 생물막에서 작동한다고 주장하는 몇 가지 상업용 RNA 추출 키트가 있으며, 그 중 하나는 이 방법과 함께 사용합니다.

이 원고에서는 챔버 슬라이드에서 녹농균 생물막을 성장시키고 고처리량 염기서열분석을 위해 박테리아 mRNA를 추출하는 절차를 설명합니다12,13. CF 환자의 객담 샘플에서 채취한 임상 분리물을 활용하여 이러한 방법이 다양한 성장 특성을 가진 분리물에 사용될 수 있음을 입증합니다. 이전 간행물과 비교하여 이 프로토콜은 박테리아 생물막 유전자 발현 11,14,15,16 연구에서 더 나은 성공을 거둘 수 있도록 자세히 설명되어 있습니다.

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프로토콜

연구 윤리 위원회(Research Ethics Board, REB)는 인간 피험자로부터 가래 샘플을 수집하고 처리하는 데 필요합니다. 이 연구는 Hospital for Sick Children(REB#1000019444)의 승인을 받았습니다. 연구 윤리 위원회(Research Ethics Board, REB)는 인간 피험자로부터 가래 샘플을 수집하고 보관해야 합니다. 이 연구는 Hospital for Sick Children REB#1000058579의 승인을 받았습니다.

1. 생물막 형성

  1. 이 연구에 사용된 CF 환자의 가래 샘플에서 얻은 Pseudomonas aeruginosa를 37°C 인큐베이터에서 밤새 Luria Broth(LB) 한천 플레이트에 재배합니다.
    참고: 적절한 줄무늬 기술은 단일 박테리아 군체를 얻는 데 중요합니다. 플레이트를 회전시키는 동안 줄무늬를 만들면 박테리아 세포가 충분히 희석되어 단일 군체가 자랄 수 있습니다.
    1. 플레이트의 약 1/4이 덮일 때까지 새 LB 플레이트의 상단 끝에서 지그재그 패턴의 접종 루프를 사용하여 박테리아를 줄무늬로 만듭니다.
    2. 플레이트를 약 60° 회전합니다. 새로운 접종 루프를 가져 와서 줄무늬가있는 영역을 통해 한 번 통과시키고 플레이트의 두 번째 깨끗한 영역으로 전달하여 지그재그 패턴을 반복합니다.
    3. 플레이트의 세 번째 영역에 새 루프를 사용하여 1.1.2단계를 반복합니다. 인큐베이터에 넣을 때 뚜껑을 교체하고 플레이트를 뒤집습니다.
  2. 멸균 접종 루프를 사용하여 한천 플레이트(단일 박테리아 균주 포함)에서 단일 박테리아 콜로니를 선택하고 5mL의 멸균 LB 배지로 채워진 배양 튜브를 접종합니다. 매번 새로운 루프를 사용하여 동일한 플레이트에서 5mL의 LB 배지로 채워진 두 개의 추가 배양 튜브를 접종합니다.
  3. 다른 박테리아 균주에 대해 동일한 접종 절차를 반복합니다. 220 RPM으로 흔들면서 37 °C에서 밤새 배양물을 성장시킵니다.
    참고: 단일 박테리아 균주를 포함하는 각 한천 플레이트는 3개의 독립적인 배양 튜브를 접종하는 데 사용됩니다. 3개의 튜브는 하나의 균주에 대해 3회씩 생물학적 복제를 나타내며 별도의 샘플로 처리됩니다. 이는 단일 배양 튜브에서 RNA를 3번 추출하는 것을 수반하는 기술적 복제와 다릅니다.
  4. 50μL의 야간 배양물을 4.95mL의 새로운 LB 배지가 들어 있는 새로운 배양 튜브로 옮겨 익일 배양을 1:100 희석합니다.
  5. 220 RPM에서 흔들면서 3 °C에서 3 시간 동안 또는 OD600 이 0.1 이상이 될 때까지 희석 된 배양물을 더 성장시킵니다. OD600에서 분광 광도계에서 세포 밀도를 측정합니다.
  6. 새로운 1.7mL 마이크로분리 튜브에서 새 LB로 총 1.5mL 부피에서 OD600 을 0.1(초기 로그 단계)로 조정합니다.
  7. 반전으로 부드럽게 섞습니다. 조정된 각 배양액 300μL를 8웰 챔버 슬라이드의 4웰로 옮겨 슬라이드당 2개의 다른 샘플로 끝냅니다(그림 1).
  8. 슬라이드를 방해받지 않고 37°C 인큐베이터에 밤새 24시간 동안 놓습니다. 증발을 방지하려면 작은 플라스틱 트레이에 젖은 종이 타월 위에 슬라이드를 놓습니다.

2. 생물막 회복

참고: 각 유리 슬라이드에는 8개의 개별 웰이 있습니다. 단일 샘플은17개의 풀링될 생물막이 있는 4개의 웰로 구성됩니다. 이 추출 프로토콜은 한 번에 2개의 웰에서 생물막을 회수하는 1개의 샘플(4웰)에 대한 것입니다. RNA 추출은 비드 박동 단계(bead beating step)와 컬럼 기반 클린업(column-based cleanup)을 포함한 상용 RNA 추출 키트를 사용하여 수행됩니다. 시약 준비에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오.

  1. 층류 후드에서 피펫 팁을 사용하여 4개의 웰 중 2개에서 매체를 천천히 제거합니다. 슬라이드를 45° 각도로 기울이고 웰의 하단 모서리에서 매체를 피펫으로 빼내어 생물막이 분리되는 것을 방지합니다.
  2. 슬라이드를 기울인 상태로 비어있는 두 개의 우물의 하단 모서리에 RNase가 없는 물 300μL를 부드럽게 피펫팅하여 플랑크톤 세포를 씻어냅니다. 2.1단계에 설명된 대로 물을 부드럽게 피펫으로 빼내어 물을 제거합니다. 가능한 한 많은 물을 제거하는 세척 단계를 반복하십시오.
  3. 300μL의 RNA 보호 시약( 재료 표 참조)을 베이스에 생물막이 있는 두 개의 비워진 웰 각각에 추가합니다. 웰이 깨지는 것을 방지하기 위해 챔버 슬라이드를 유리판에 놓은 다음 작은 뉴클레아제가 없는 멸균 금속 주걱으로 2개의 웰에 있는 바이오필름을 긁어 바이오필름 박테리아를 다시 현탁시킵니다. 동일한 샘플에서 손대지 않은 2개의 웰에서 생물막이 회수될 때까지 그대로 두십시오.
    참고: RNA 보호 시약을 추가하면 동일한 샘플의 나머지 두 웰을 처리하는 동시에 스크랩된 웰에서 상온에서 바이오필름 샘플의 안정성을 보장할 수 있습니다. RNA 보호 시약은 세포를 용해하고 뉴클레아제와 감염원을 비활성화하여 RNA를 보존합니다.
  4. 샘플에 대해 나머지 2개의 웰에서 바이오필름을 복구하려면(알림: 하나의 샘플은 4개의 웰로 구성됨) 2.1단계에서 설명한 것과 동일한 방식으로 나머지 2개의 새 웰에서 LB 매체를 제거합니다. 이전과 같이 2.2단계를 반복하여 두 개의 새로운 우물에서 RNase가 없는 물로 플랑크톤 세포를 씻어냅니다.
  5. 2.3 단계가 끝날 때 생성 된 보호 시약에 스크랩 된 생물막이있는 처음 2 개의 웰로 돌아가서 너무 많은 기포가 생성되지 않도록 노력하면서 긁어 낸 우 물에서 300μL의 다시 부유 된 생물막을 혼합하기 위해 천천히 피펫을 낳습니다.
    1. 우물의 모든 내용물을 새로 씻고 비운 우물 중 하나로 옮깁니다. 두 번째로 긁어낸 우물에서 다시 부유한 생물막 300μL를 혼합하여 새로 세척하고 비운 나머지 우물에 옮깁니다.
      참고: 바이오필름으로 새로 세척된 2개의 웰에 새로운 RNA 보호 시약을 추가하는 대신, 보호 시약에 이미 있는 이전에 긁어낸 바이오필름을 새로 세척한 웰로 옮깁니다. 이렇게 하면 결합된 샘플 부피가 상용 RNA 추출 키트에 대한 입력 요구 사항을 충족할 수 있을 만큼 충분히 낮게 유지됩니다. 회로도는 그림 1 을 참조하십시오.
  6. 챔버 슬라이드를 유리판에 놓고 뉴클레아제가 없는 작은 멸균 금속 주걱으로 2개의 새 웰에 있는 바이오필름을 긁어 바이오필름 박테리아를 다시 현탁시켜 2.3단계와 같이 새 웰의 바이오필름을 긁는 것을 반복합니다.
  7. 2개의 새로운 웰에서 다시 부유된 모든 바이오필름을 단일 RNase가 없고 결합력이 낮은 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 결합합니다. 총 ~500 - 600 μL의 부피를 측정합니다.
    참고: 이 두 번째 쌍의 새로운 웰에서 결합된 바이오필름 현탁액에는 샘플의 원래 4개 웰에서 추출한 모든 바이오필름 물질이 포함됩니다.

3. 전체 RNA 분리 및 품질 평가

참고: RNA 추출은 생물막에서 작동한다고 주장하는 상용 RNA 추출 키트를 사용하여 수행됩니다. 개별 구성 요소는 가능한 경우 재료 표에 포함되어 있습니다. 가능한 경우 각 정제 단계의 메커니즘에 대한 설명이 제공됩니다.

  1. 튜브에 총 750μL가 될 만큼 충분한 RNA 보호 시약을 추가합니다. 전체 부피를 0.1 및 0.5mm 비드가 들어 있는 2mL 비드 박동 용해 튜브로 옮깁니다( 재료 표 참조). 비드 비터에서 최대 속도로 2 1/2분 동안 치십시오.
    참고: 0.1mm 및 0.5mm 고밀도 비드와 비드 비터에서의 고속 혼합의 조합은 미생물 세포벽의 철저한 균질화를 보장합니다.
  2. 16,000 x g 에서 1분 동안 원심분리기를 사용하여 비드를 펠릿화합니다. 상층액을 새로운 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 비드의 이동을 최소화하여 3.3단계를 더 쉽게 만듭니다. 부피를 측정합니다.
  3. 동일한 부피의 RNA 용해 완충액(~450 μL)을 넣고 잘 섞습니다. 비드가 이동하지 않고 최대 800μL의 시료를 채취 튜브의 실리카 컬럼으로 옮기고 16,000 x g 에서 30초 동안 원심분리합니다. DNA가 컬럼에 결합되어 있는 동안 RNA가 포함되어 있으므로 플로우 스루(flow-through)를 저장합니다.
    참고: RNA 용해 완충액에는 구아니디늄 티오시아네이트와 세제 N-라우로일사르코신이 세포를 용해하여 세포를 용해합니다. Guanidinium thiocyanate는 또한 nuclease를 비활성화하고 스핀 컬럼에서 발견되는 실리카의 존재 하에서 실리카에 대한 DNA의 결합을 촉진하는 카오스트로픽 제제입니다18. 에탄올이 없기 때문에 실리카 스핀 컬럼19에 RNA가 아닌 DNA가 우선적으로 결합할 수 있습니다. 3.3단계의 목적은 게놈 DNA를 결합하고 제거하는 것입니다. 우리는 플로우 스루 부분에 포함된 RNA를 유지하기를 원합니다.
  4. 더 많은 샘플이 남아 있으면 컬럼을 새 수집 튜브로 옮기고 나머지 샘플과 함께 다시 로드합니다. 16,000 x g 에서 30초 동안 원심분리기. RNA와의 흐름을 유지하고 첫 번째 부분 표본과 결합합니다.
  5. 결합 된 관류 부피를 측정하고 동일한 부피의 100 % 에탄올을 첨가하고 잘 혼합합니다. 최대 800μL의 용액을 수집 튜브의 새로운 두 번째 실리카 스핀 컬럼으로 옮기고 16,000 x g 에서 30초 동안 원심분리합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.
    참고: RNA를 포함하는 카오트로픽 염 용액에 에탄올을 첨가하면 실리카 스핀 컬럼19에 대한 RNA의 결합이 향상됩니다.
  6. 800μL> 용액의 경우 전체 용액이 회전할 때까지 스핀 컬럼과 원심분리기를 다시 로드합니다. 각 스핀 후에 플로우 스루를 버리십시오.
  7. 컬럼에 400μL의 세척 버퍼를 추가하고 16,000 x g에서 30초 동안 원심분리하여 일부 염을 제거합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.
  8. 제조업체의 지침에 따라 DNase I 반응 혼합물을 준비하고 in-column DNase 처리를 수행하여 잔류 DNA를 제거합니다.
  9. 동결건조된 DNase I을 RNase가 없는 물 275μL에 재현탁시켜 1U/μL 용액을 만듭니다. 부드러운 반전으로 섞습니다.
  10. 5 μL의 희석된 DNase I를 제공된 75 μL의 DNase 분해 완충액과 결합합니다. 반전으로 부드럽게 섞습니다.
  11. 준비된 용액 80μL를 컬럼 매트릭스에 직접 추가합니다. 실온에서 20분 동안 배양합니다.
  12. 400μL의 RNA 분취 완충액을 컬럼에 추가하고 16,000 x g 에서 30초 동안 원심분리합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.
  13. 700μL의 RNA 세척 완충액을 컬럼에 추가하고 원심분리를 반복합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.
  14. 400μL의 RNA 세척 완충액을 추가하고 컬럼을 2분 동안 원심분리하여 잔류 완충액을 완전히 제거합니다.
    참고: 컬럼의 불순물을 제거하는 2가지 세척 단계가 있습니다. 분취 완충액에는 잔류 단백질을 제거하기 위해 에탄올과 혼합된 약한 차오트로픽 염이 포함되어 있습니다. 다음으로, 세척 버퍼는 염을 제거하기 위해 에탄올 세척을 수행하는 데 사용됩니다. RNA19,20의 효율적인 용출을 허용하기 위해 남아 있는 에탄올을 제거해야 합니다.
  15. 컬럼을 새로운 저결합 마이크로 원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
  16. RNase가 없는 물 50μL를 컬럼 매트릭스에 직접 첨가하고 5분 동안 배양합니다. RNA를 용리하기 위해 1분 동안 16,000 x g에서 원심분리기.
  17. PCR 억제제를 제거하기 위한 추가 세척을 위해 PCR 억제제 필터를 새 수집 튜브에 넣습니다. 제공된 억제제 분취 용액 600μL를 추가합니다( 재료 표 참조).
  18. 8,000 x g에서 3분 동안 원심분리기를 사용하여 필터를 세척합니다. 세척된 필터를 새로운 저결합 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
  19. 단계 3.13에서 용리된 RNA를 세척된 필터로 옮기고 16,000 x g에서 3분 동안 원심분리합니다.
    참고: RNA는 즉시 사용하거나 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
  20. 고감도 형광 측정 시스템21을 사용하여 RNA의 농도를 결정합니다.
    참고: 이러한 시스템을 사용하면 관심 대상에 특이적인 용액 내 소량의 RNA를 민감하게 정량화할 수 있습니다.
    1. RNA 품질의 척도인 RIN(RNA integrity number)을 제공할 수 있는 자동화된 전기영동 시스템을 사용하여 RNA의 품질을 평가합니다22,23.

4. 리보솜 RNA 고갈 및 고처리량 염기서열분석

  1. 박테리아 rRNA 고갈 및 RNA 방향성 라이브러리 준비를 위해 토론토 대학교(캐나다 토론토)의 CAGEF(Centre for the Analysis of Genome Evolution and Function) 게놈 센터(https://www.cagef.utoronto.ca/)에 RNA를 제출합니다(재료 표 참조).
    참고: 박테리아 rRNA 고갈은 5S, 16S 및 23S rRNA를 제거 대상으로 합니다24.
  2. 상용 rRNA 박테리아 고갈 키트를 사용하여 rRNA를 고갈시킵니다. 10 ng - 1 μg의 온전한 또는 부분적으로 분해된 총 RNA를 입력하기 위한 프로토콜을 따르십시오.
  3. 각 라이브러리에 서로 다른 인덱스가 부착된 RNA 방향성 라이브러리 준비 키트를 사용하여 RNA 염기서열분석 라이브러리를 구성합니다.
  4. 각 RNA 라이브러리의 등몰량을 풀링하고 100-base paired-end reads25로 고처리량 염기서열분석을 수행합니다.

5. 염기서열분석 판독의 품질 평가

참고 : 무료 오픈 소스 플랫폼인 Galaxy27을 통해 무료로 제공되는 프로그램인 FastQC26을 사용하여 염기서열분석 판독의 품질을 확인하십시오.

  1. https://usegalaxy.org/ 로 이동합니다. Login or Register(로그인) 또는 Register(등록) 메뉴를 클릭하고 자격 증명으로 로그인하거나 계정을 만듭니다.
  2. 페이지 왼쪽 상단의 도구 메뉴에서 데이터 업로드 링크를 클릭하고 fastq.gz 염기서열분석 파일을 업로드합니다. 파일 이름이 페이지 오른쪽의 기록 패널 아래에 나타날 때까지 기다립니다.
  3. 도구 메뉴에서 FASTQ 품질 관리를 선택하여 프로그램 목록을 표시합니다. FastQC를 선택하면 화면의 중간 패널이 채워집니다.
  4. Short read data from your current history(현재 기록에서 데이터 읽기)의 풀다운 메뉴에서 업로드된 fastq.gz 파일을 선택합니다.
  5. 실행을 선택하여 프로그램을 실행합니다.
  6. History(기록) 패널에서 결과를 확인합니다(표 2).
    참고: Galaxy 사용 방법에 대한 자세한 지침은 https://galaxyproject.org/support/ 의 지원 페이지를 참조하십시오.

6. 염기서열분석 판독 매핑

참고 : RNA-seq 데이터에 대한 어댑터 트리밍 및 읽기 매핑을 위한 기본 파이프라인이 나열되어 있습니다. 어댑터 시퀀스는 Trimmomatic28을 사용하여 읽기에서 트리밍됩니다. 트리밍된 리드는 BWA30 및 Samtools31을 사용하여 NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)29에서 얻은 P. aeruginosa PAO1 참조 게놈(NC_002516.2)에 매핑됩니다. 단순화를 위해 한 쌍의 읽기를 PA_1.fq 및 PA_2.fq라고 합니다. 트리밍할 어댑터 읽기 파일을 adapter.fa라고 합니다. PAO1 참조 시퀀스는 PAO1.fasta라고 합니다. 모든 도구는 오픈 소스이며 UNIX/LINUX 환경에서 실행됩니다. 이러한 명령을 실행하기 위해 UNIX/LINUX의 기본 사항을 숙지하는 것이 좋습니다.

  1. UNIX/LINUX에서 창을 엽니다.
  2. Java, Trimmomatic, BWA 및 Samtools를 설치합니다.
  3. 파일 trimmomatic-0.39.jar 있는 폴더로 이동합니다.
  4. 다음 명령을 입력하여 읽기에서 모든 어댑터 시퀀스를 잘라냅니다.
    Java -jar PA_1.fq PA_2.fq PA_1_paired.fq PA_1_unpaired.fq PA_2_paired.fq PA_2_unpaired.fq ILLUMINACLIP: adapters.fa
    참고: 어댑터 시퀀스만 제거됩니다. 읽기는 품질32에 맞게 조정되지 않았습니다.
  5. PAO1.fasta 참조 파일을 동일한 폴더로 이동합니다.
  6. 다음 명령과 함께 BWA를 사용하여 참조를 인덱싱합니다.
    Bwa 인덱스 PA01.fasta
  7. 다음 4개의 명령을 입력하여 쌍을 이루는 읽기를 참조 게놈에 매핑합니다. 이전 명령이 완료된 후 각 명령을 입력합니다.
    Bwa -mem PA01.fasta PA_1_paired.fq PA2_2_paired.fq > PA_R1R2_map.mem.sam
    Samtools 보기 -S -b PA_R1R2_map.mem.sam > PA_R1R2.bam
    Samtools 정렬 PA_R1R2.bam -o PA_R1R2_sorted.bam
    Samtools 인덱스 PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam
  8. 다음 명령을 입력하여 매핑 통계를 봅니다.
    Samtools 플래그스타트 PA_R1R2_sorted.bam
    참고: 통계의 3번째 줄은 참조 게놈에 매핑되는 판독의 비율을 보고합니다.
  9. 커버리지의 평균 판독 깊이와 너비는 각각 다음 2개의 명령33을 사용하여 계산합니다.
    SamTools 깊이 -a PA_R1R2_sorted.bam | awk '{C++; s+=$3}END{인쇄 s/c}'
    SamTools 깊이 -a PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam | awk '{c++; if($3>0) 총+=1}END{인쇄(총/c)*100}'

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결과

이 방법의 일반적인 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 이전에는 8웰 챔버 슬라이드를 사용하여 녹농균 생물막을 성장시키고 항생제에 노출시킨 후 다른 시점에서 컨포칼 현미경을 통해 검사했습니다12,13. 이 방법은 처리 후 유전자 발현 변화를 연구하기 위해 이 시스템에서 성장한 생물막에서 총 RNA를 직접 추출하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 녹농균(P. aeruginosa)에 최적화되어 있지만 다른 박테리아 종에도 쉽게 적용할 수 있습니다.

rRNA 고갈 및 고처리량 염기서열분석을 위해 소량의 생물막에서 충분한 양의 양질의 RNA를 추출하는 것은 어려울 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 17개의 서로 다른 녹농균 생물막 분리물에서 총 RNA를 31개의 개별 샘플로...

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토론

총 RNA는 17개의 서로 다른 박테리아 생물막 샘플에서 3배로 성공적으로 추출되어 총 51개의 샘플을 생성합니다. 49개의 RNA 라이브러리가 풀링되고 성공적으로 염기서열 분석됩니다. 전반적으로, 이는 샘플의 절반 이상이 함량이 낮고 최적이 아닌 품질인 것으로 간주됨에도 불구하고 96%의 성공률로 품질 기준을 입증합니다(34,35,36,37).

중요성
이 RNA 추출 프로토콜은 챔버 슬라이드에서 성장한 제한된 양의 생물막에서 RNA를 추출하는 방법에 대한 자세한 설명이 독특합니다. 8-웰 챔버 슬라이드에서 생물막의 성장은 컨포칼 현미경 12,13,42에 의...

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공개 사항

저자는 선언할 공개 사항이 없습니다.

감사의 글

저자 기여: P.W., Y.Y. 및 V.W가 연구 개념화에 참여했습니다. K.G., L.J., A.M. 및 P.W.는 실험실 프로토콜을 최적화했습니다. K.G.를 위한 기금은 BioTalent Canada를 통한 Student Work Placement Program 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939BA생체 분자의 자동 전기영
Agilent RNA 6000 pico kitAgilent5067-1513을 생성하는 고감도 RNA 전기영동 칩
Zymo ResearchD7001-1-50핵산 정제 키트의 일부로 판매되는 구아니디늄 티오시아네이트 및 N-라우로일사코신 기반 용해 완충액
DNA/RNA Prep BufferZymo ResearchD7010-2-10DNA 및 RNA DNA/RNA 정제에 사용되는 구아니딘 HCl 및 에탄올 완충액
ShieldZymo ResearchR1100-50DNA 및 RNA 보존/보호 시약
DNA/RNA 세척 완충액Zymo ResearchD7010-3-6DNA 및 RNA 정제에 사용되는 염 및 에탄올 완충액
DNBSEQ G-400RSMGIG-400RS고처리량 염기서열분석기
MGIEasy RNA 방향성 라이브러리 준비 세트MGI1000006386총 RNA에서 MGI 고처리량 염기서열분석 플랫폼용 라이브러리를 생성합니다.
Mini-Beadbeater-96BioSpec1001고에너지, 고처리량 세포 분열
NEBNext rRNA Depletion Kit (박테리아)New England BiolabsE7850X박테리아 rRNA의 효율적이고 특이적 고갈(5S, 16S, 23S)
Nunc Lab-Tek II 챔버 슬라이드 시스템Thermo Fisher Scientific154534탈착식 웰이 있는 8웰 챔버 슬라이드
Qubit 형광측정기Thermo Fisher ScientificQ33238DNA, RNA 및 단백질용 형광측정기
Qubit RNA HS 어세이 키트Thermo Fisher ScientificQ32852RNA 농도 측정을 위한 고감도 형광 분석
Spin-Away 필터Zymo ResearchC1006-50-F게놈 DNA의 결합 또는 제거에 주로 사용되는 실리카 기반 스핀 컬럼
멸균 접종 루프, 1 uLSarstedt86.1567.050미생물 조작을 위한 멸균 일회용 접종 루프
ZR BashingBead Lysis 튜브Zymo ResearchS6003-50생물학적 시료 균질화를 위한 0.1mm 및 0.5mm bead lysis 매트릭스를 포함하는 2mL 튜브
Zymo Spin IIICG 컬럼 ZymoResearchC1006-50-GDNA 및 RNA 정제를 위한 실리카 기반 스핀 컬럼
Zymo-Spin III-HRC 필터Zymo ResearchC1058-50폴리페놀 화합물, 휴믹/풀빅산, 탄닌, 멜라닌 등과 같은 억제제를 제거합니다.
자이모바이오믹스 DNA/RNA 미니프렙 키트자이모 리서치R2002DNA 및 RNA 이중 추출 키트
자이모바이오믹스 HRC 준비 솔루션자이모 리서치D4300-7-30PCR 억제제를 제거하기 위해 자이모-스핀 III-HRC 필터와 함께 사용
동 RIN DNA/RNA 용해 완충액

참고문헌

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