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방법 논문

단일 세포 및 실시간 해상도로 1차 신경 배양에서 신경 세포 생존을 연구하기 위한 확장 가능한 방법

1.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/62759

⸱

2021년 7월 26일

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cortical Circuits in Health and Disease, Centro de Investigación Príncipe Felipe

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서는 실시간으로 또는 고정된 물질에서 세포 해상도를 가진 1차 피질 뉴런의 세포독성 스트레스에 대한 뉴런 생존을 조사하기 위한 간단하고 강력하며 다재다능한 방법론을 제시합니다.

초록

신경 세포 손실은 뇌졸중, 알츠하이머병, 파킨슨병을 포함한 많은 신경 병리학의 핵심입니다. 세포독성 스트레스에 대한 신경세포의 생존 과정을 연구하기 위해 다양한 방법이 개발되었습니다. 대부분의 방법은 단일 세포 분리를 허용하지 않거나 복잡하고 비용이 많이 드는 방법론을 포함하는 생화학적 접근 방식을 기반으로 합니다. 여기에 제시된 것은 신경 세포의 생존을 연구하기 위한 다재다능하고 저렴하며 효과적인 실험 패러다임입니다. 이 방법은 뉴런의 희박한 형광 표지 후 실시간 이미징 및 자동 정량화를 활용합니다. 이를 위해 뉴런을 전기천공하여 형광 마커를 발현하고 비전기천공된 뉴런과 공동 배양하여 세포 밀도를 쉽게 조절하고 생존율을 높입니다.

electroporation에 의한 희소 라벨링을 통해 간단하고 강력한 자동 정량화가 가능합니다. 또한 형광 표지는 특정 분자 경로를 연구하기 위해 관심 유전자의 동시 발현과 결합할 수 있습니다. 여기에서는 뇌졸중 모델을 신경독성 모델, 즉 저렴하고 견고한 수제 저산소 챔버에서 수행된 산소-포도당 결핍(OGD) 분석으로 제시합니다. 마지막으로, 반자동 데이터 처리를 위한 이미지 분석을 위해 IN Cell Analyzer 2200 또는 오픈 소스 ImageJ를 사용하여 두 가지 워크플로를 설명합니다. 이 워크플로우는 다양한 독성 실험 모델에 쉽게 적용할 수 있으며 고처리량 스크리닝을 위해 확장할 수 있습니다. 결론적으로, 설명된 프로토콜은 접근 가능하고 저렴하며 효과적인 신경독성 체외 모델을 제공하며, 이는 라이브 이미징에서 특정 유전자 및 경로의 역할을 테스트하고 고처리량 약물 스크리닝에 적합할 수 있습니다.

서론

신경 질환에 대한 연구에는 유전적, 분자적, 세포 분석이 가능한 실험적 모델이 필요합니다. 1차 피질 뉴런은 뉴런의 생존과 독성을 연구하기 위한 매우 강력한 모델이다 1,2,3,4. 적절한 조건 하에서, 일차 뉴런은 점진적으로 시냅스 접촉을 발달시키고 성숙한 뉴런의 특징을 나타낼 것입니다. 따라서 이 모델은 뉴런의 생리학을 모델링하는 데 있어 불멸화된 세포주보다 더 신뢰할 수 있으며 동물 모델보다 조작에 더 적합합니다. 그러나 세포주와 비교했을 때, 1차 피질 뉴런은 형질주입이 어렵고 상대적으로 취약합니다. 더욱이, 피질 뉴런의 복잡한 형태는 고밀도 배양에서 이미징 및 분석을 복잡하게 만들 수 있습니다. 반대로, 저밀도 1차 신경 세포 배양은 분석하기가 더 쉽지만 더 취약한 경향이 있습니다.

이 모든 것을 고려하여 이 논문은 신경 세포 생존을 모델링하고 조사하기 위한 저렴하고 다재다능하며 확장 가능한 체외 워크플로우를 제시합니다(그림 1). 이 프로토콜의 요점은 i) 살아있는 세포의 희박한 라벨링 및 이미징을 허용하는 형광 마커로 뉴런의 체외 electroporation 방법; ii) 세포 독성의 다양한 모델에서의 다양성; iii) 반자동 또는 자동 분석.

electroporation 시스템(재료 표 참조)은 키트 및 특정 용액 4,5,6을 포함하지 않는 개방적이고 저렴한 절차를 제공합니다. 더욱이, 이 방법은 전기전극된 세포와 전기전극되지 않은 세포를 혼합하여 형질주입된 뉴런의 최적 형질전환 효율 및 밀도를 얻도록 쉽게 적용할 수 있습니다. 나이브(non-electroporated) 뉴런과의 공동 배양은 저밀도 배양에 비해 전기천공된 세포의 생존력을 크게 향상시킵니다. 또한, 전기천공된 뉴런의 조정 가능한 밀도로 희소 라벨링을 가능하게 하여 일관된 수준의 유전자 발현을 유지합니다. 생존 분석에서 전기천공된 뉴런의 3-5%를 목표로 하는 것이 중요합니다.

희소 라벨링을 사용하면 세포가 잘 분리되어 쉽게 구별할 수 있기 때문에 기본적으로 이미지 분석의 자동화가 용이합니다. 특히, 이 실험 패러다임은 동일한 웰에서 서로 다른 세포질 형광 마커(예: 청록색 형광 단백질, 적색 형광 단백질(RFP), 녹색 형광 단백질(GFP))과 공동 전기천공된 뉴런을 동시에 공동 배양하여 여러 관심 유전자를 테스트하도록 조정될 수 있습니다. 다른 세포독성 분석법(예: 프로피듐 요오드화물 또는 젖산 탈수소효소)과 유사하게, 본원에 기술된 분석법은 신경세포의 사멸이 세포막의 파열을 동반한다는 사실에 기초합니다. 이것은 확산에 의한 세포질 단백질의 방출을 유발하고 결과적으로 GFP 형광의 손실을 유발합니다.

뇌졸중의 체외 모델, 즉 OGD 모델은 신경독성 7,8,9의 예로 제시됩니다. 이 프로토콜은 1차 뉴런을 인공 뇌척수액과 유사하지만 산소와 포도당이 결핍된 염 완충액에 노출시키는 것을 수반합니다. 이 모델은 신경독성 스트레스의 예로 제시되었지만, 동일한 워크플로우로 다양한 세포독성 조건을 테스트할 수 있습니다 8,9. 마지막으로, 희소 라벨링을 통해 자동화된 이미징 분석을 쉽게 개발할 수 있습니다. 여기에서는 더 작은 설정에서 표준 면역형광 및 ImageJ 분석을 기반으로 프로토콜이 확립되었습니다. 다음으로, 이 워크플로우는 중간 및 높은 처리량 모드의 라이브 이미징에서 자동화된 분석을 가능하게 하는 세포 이미징 시스템을 사용하여 조정 및 확장되었습니다. 결론적으로, 이 논문은 실시간 이미징 및 자동화된 정량화를 사용하여 다양한 독성 실험 모델에서 신경 세포 생존을 연구하기 위한 유연하고 저렴하며 확장 가능한 방법론을 제시합니다.

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프로토콜

동물을 사용하는 모든 절차는 연구소의 생명윤리동물위원회의 감독을 받아야 하며 현지 규정에 따라 수행되어야 합니다. 여기에 제시된 절차는 위임된 기관의 승인을 받았으며 스페인과 유럽의 규정을 준수합니다.

1. 1차 신경 세포 배양

참고: 모든 단계는 멸균 상태를 유지하기 위해 멸균 재료와 용액을 사용하여 배양 후드 내부에서 수행됩니다.

  1. 폴리-L-라이신(PLL) 코팅
    1. 커버슬립(CV, 15mm)을 70% 에탄올로 오비탈 셰이커에서 밤새(o/n) 세척합니다.
      참고: 오비탈 셰이커의 속도는 CV를 부드럽게 움직일 수 있을 만큼 충분해야 하지만 CV가 손상되거나 긁히는 것을 방지하기 위해 너무 빠르지 않아야 합니다. 특정 RPM은 셰이커 모델에 따라 다릅니다. CV는 에탄올에 장기간(수개월) 보관할 수 있습니다.
    2. 에탄올을 제거하고 탈이온수로 각각 10분씩 두 번 씻습니다.
    3. CV를 100mm 페트리 접시(약 13CV/플레이트)에서 실온(RT)에서 건조시킵니다. CV가 서로 또는 플레이트의 가장자리에 닿지 않도록 하십시오.
      참고: Dry CV는 RT에서 장기간(수개월) 동안 보관할 수 있습니다.
    4. 5mg/mL PLL 원액을 물에 준비하고 부분 표본을 만들어 -20°C에서 보관합니다. 1x PBS의 원액을 0.1mg/mL의 작업 농도로 희석합니다.
      참고: 최대 1mg/mL PLL의 더 높은 농도를 테스트할 수 있습니다.
    5. CV의 표면을 덮기 위해 PLL의 최소 부피를 추가합니다( 표 1에서 PLL의 최적 부피 참조). 액적 형성을 용이하게 하기 위해 PLL 용액을 적극적으로 추가합니다.
      참고: CV에 뉴런을 도금하는 것은 면역 형광을 위해 필요합니다. 타임 랩스 이미징(예: IN Cell의 경우)의 경우, 타임 랩스 중에 CV가 움직일 수 있기 때문에 세포는 CV 없이 웰 바로 위에 도금됩니다. 이 경우 각 웰의 표면을 덮을 수 있도록 PLL의 최소 부피를 추가합니다.
표면PLL 부피 (mL)
커버슬립 15mm0.2
커버슬립 13mm0.18
96웰 플레이트0.07
24웰 플레이트0.3
6웰 플레이트2
60mm 플레이트4.5

표 1: 표면적에 따른 폴리-L-라이신의 최적 부피.

  1. 37 °C에서 최소 1 시간 동안 배양하십시오.
    참고: 잠복기는 o/n만큼 길어질 수 있습니다.
  2. CV에서 PLL을 제거합니다. CV를 탈이온수로 각각 10분 동안 두 번 세척합니다. RT에서 CV를 말리십시오.
    알림: PLL 용액은 재사용을 위해 4°C에서 보관할 수 있습니다(최대 3회).
  3. 건조된 CV를 4°C(최대 7-10일)의 페트리 접시에 보관하거나 도금 매체를 사용하여 웰 내부에 넣습니다( 표 2 의 조성 및 표 3의 작업량 참조). 12웰 플레이트의 웰에 도금 매체를 직접 추가합니다(표 3).
    참고: 뉴런은 소 태아 혈청(FBS)의 품질에 매우 민감합니다. 세포가 더 건강해 보이는 배치를 식별하기 위해 FBS의 다양한 배치를 테스트해야 합니다. FBS가 많이 확인되면 많은 양을 확보하여 -80 °C에서 보관하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 다른 유형의 CV 및 플레이트에 맞게 조정할 수 있습니다( 표 3의 다양한 작업량 참조).
도금 매체
MEM (멤)42.5밀리리터
10% 호스 세럼 또는 FBS*5밀리리터
30% 포도당(0,6% 최종 농도)1밀리리터
PS (페니실린, 10000 U/mL; 스트렙토마이신, 10 mg/mL);0.5밀리리터
전기천공법 매체
옵티-MEM
뉴런 배지
Neurobasal 배지48.5밀리리터
나-271밀리리터
글루타맥스 200 mM0.125밀리리터
PS (페니실린, 10000 U/mL; 스트렙토마이신, 10 mg/mL);0.5밀리리터
OGD 매체 (Tasca, et al. 2014)
염화칼슘21밀리미터
케이클5밀리미터
염화나트륨137밀리미터
KH2사서함40.4밀리미터
나2HPO40.3밀리미터
재질 보기 MgCl20.5밀리미터
재질 보기 MgSO40.4밀리미터
헤페스25밀리미터
나HCO34밀리미터

표 2: 사용된 다양한 매체의 구성.

우물과 판의 표면적작업량
96웰 플레이트0.32센티미터20.1밀리리터
24웰 플레이트1.9센티미터20.5밀리리터
12웰 플레이트3.8센티미터21밀리리터
6웰 플레이트9.5센티미터22.5밀리리터
60mm 플레이트21.5센티미터26밀리리터

표 3: 다양한 유형의 판의 표면적과 작업량.

  1. 신경 세포 배양의 준비
    1. 최소 2시간 동안 세포 인큐베이터 내부의 부분적으로 열린 병에 도금 배지, 신경 배지 및 전기천공 배지(표 2의 구성 참조)를 예열(37°C) 및 평형화(5%CO2 대기에서)합니다. 트립신을 RT에서 예열합니다. 1x Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)을 37°C의 수조에서 예열합니다.
    2. electroporation 매개변수를 미리 설정합니다(표 4).
ELECTROPORATION 조건: Poring Pulse
길이V간ND. 비율극성
2 밀리세컨드17550210플러스
ELECTROPORATION 조건: 전달 펄스
길이V간ND. 비율극성
502050540플러스/마이너스

표 4: NEPA21에 대한 전기천공 설정.

  1. 뇌 해부 및 E15 성교 후 CD-1 마우스 embryos 수확
    1. 진정제 투여 없이 자궁경부 탈구로 임신한 여성을 희생시킨다. 70% 에탄올로 배를 살균하십시오. 날카로운 가위로 복부를 자르고 엽니다.
    2. 자궁을 적출하여 차가운 1x HBSS와 함께 페트리 접시에 넣습니다. 일반적인 집게로 세포 배양 후드 내부의 얼음에 그대로 두십시오.
    3. 집게와 가위를 사용하여 자궁에서 배아를 추출하고 가위를 사용하여 한 번의 절단으로 목을 베십시오.
    4. 머리를 잡고 겸자(예: Dumont fine thumbps)를 안와에 삽입합니다.
    5. 바늘 (30G 바늘 주사기)을 칼날로 사용하여 브레그마를 자르고 머리의 뒤쪽 부분을 뚫습니다.
    6. 절개 부위를 통해 날카로운 집게를 브레그마에 수직으로 삽입하고 앞쪽 부위의 얇은 피부층을 절단합니다. 피질을 손상시키지 않고 두 반구 사이의 세로 균열을 따르도록 집게를 당깁니다.
    7. 작은 집게를 앞쪽에서 뒤쪽까지 45° 각도로 사용하여 머리에서 뇌를 제거합니다.
    8. 실체현미경으로 얼음처럼 차가운 1x HBSS가 있는 3.5cm 페트리 접시로 뇌를 옮깁니다.
  2. 피질 해부
    참고: 신경 세포 배양을 위한 프로토콜은 Dotti와 Banker10에 의해 기술된 절차에서 채택되었다.
    1. 뒤몽 겸자(11cm)를 사용하여 시상을 잡고 바늘을 45° 각도로 기울여 각 반구의 피질과 중뇌를 분리합니다. 피질이 다른 조직의 흔적을 보여주지 않도록 하십시오. 날카로운 집게를 사용하여 수막을 제거하십시오.
      참고: 수막은 뇌를 둘러싸고 있는 얇고 탄력 있는 막을 형성하며 붉은색 때문에 쉽게 알아볼 수 있습니다. 지그재그로 부드럽게 움직이면 수막을 제거하는 데 도움이 됩니다. 배양에 독성이 있으므로 모든 수막이 제거되었는지 확인하십시오.
    2. 깨끗한 피질을 얼음처럼 차가운 3.5x HBSS가 있는 깨끗한 1cm 페트리 접시로 옮기고 얼음 위에 놓습니다.
  3. 세분화
    1. 각 피질을 반으로 자르고 집게 또는 날카로운 바늘 (30G)을 사용하여 다음 단계에서 트립신의 효과를 촉진합니다.
    2. P1000 피펫을 사용하여 15mL 튜브에 실온의 7mL 트립신-EDTA 완충액으로 조각을 옮깁니다(팁의 3-4mm 절단). 피펫 팁에서 분리하기 전에 팁 바닥으로 가라앉을 때까지 기다리십시오. 기울여서 섞습니다.
    3. 37 °C의 수조에서 12분 동안 배양합니다. 4-5분마다 기울여서 섞습니다.
      참고: 배양 시간은 12분에서 15분까지 다양할 수 있습니다.
    4. 조직을 중력에 의해 가라앉히고 트립신을 조심스럽게 제거합니다. 8mL의 1x HBSS로 조직을 두 번 씻고 기울여 부드럽게 저어줍니다. P1 피펫을 사용하되 절단되지 않은 피펫 팁을 사용하여 1x HBSS를 조심스럽게 제거합니다.
    5. 5mL의 도금 매체로 조직을 한 번 씻으십시오. 기울여서 교반합니다. P1000 피펫을 사용하여 도금 매체를 조심스럽게 제거합니다.
    6. 1.5mL의 도금 매체를 추가합니다. P1000 피펫을 사용하여 튜브 바닥에서 매체를 흡인하고 최대 8-12회 동안 벽 위로 부드럽게 방출하여 혼합물을 기계적으로 분해합니다.
    7. 50mL 튜브에 놓인 멸균 셀 스트레이너(70μm)를 통해 필터링합니다. 튜브에 10mL 또는 원하는 부피의 도금 매체를 추가합니다.
    8. 세포 현탁액 5μL를 세포 계수 챔버에 도입하고, 5μL의 트리판 블루(0.4% w/v)를 첨가하고, 세포를 계수합니다.
    9. 15mL 원심분리 튜브에서 전기천공을 위한 원하는 수의 세포(예: 10,6 개 세포)를 갖도록 적절한 부피의 세포 현탁액을 전달하여 세포를 플레이트화합니다(섹션 1.6 참조). 250 × g 에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 섹션 1.6으로 진행합니다.
  4. 도금 셀
    1. 1.5.7단계에서 원심분리된 세포 현탁액의 원하는 밀도를 도금 매체를 포함하는 각 웰에 플레이트화합니다.
      참고: 이 프로토콜에서는 100,000 - 200,000개의 세포/웰을 12웰 플레이트에 파종했습니다. 참고로, 실험 조건당 최소 3개의 CV를 플레이트하여 실험 변동성을 고려합니다. 일반적인 실험 설정에는 CV당 4-5개의 필드를 이미징하는 것이 수반될 수 있습니다(예: 20x 대물렌즈를 사용하는 경우 각 필드의 너비는 ~1.3mm2일 것으로 예상됨).
    2. 세포 배양 후드의 플레이트를 모든 기본 방향으로 움직여 세포를 균일하게 분포시킵니다.
  5. 전기충격법
    참고: 다른 transfection 시스템을 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용된 NEPA21 시스템은 "개방형 시스템"이라는 장점이 있습니다. 프로토콜은 사용자가 수정할 수 있으며, 전기천공에 사용되는 특수 큐벳의 transfection을 위한 특정 시약이 필요하지 않습니다. 이 프로토콜은 5에서 수정되었습니다.
    1. 1.5.9단계부터 계속합니다. 15mL 튜브에 5mL의 전기천공 배지로 세포 펠릿을 재현탁합니다. 튜브를 250 × g에서 5분 동안 원심분리합니다.
    2. 1.7.1단계를 반복합니다. 전기천공법 배지로 재현탁하여 각 전기천공법 큐벳에서 106 cells/mL의 농도를 얻습니다. 큐벳에서 원하는 양의 DNA와 세포를 혼합합니다.
      참고: GFP 발현을 위해 100만 개의 세포당 3μg의 플라스미드가 사용되었습니다. 변동성이 높기 때문에 각 플라스미드에 대한 최적의 농도를 테스트하는 것이 좋습니다. 100만 개 세포당 2 - 24 μg의 플라스미드가 테스트되었습니다. 동일한 큐벳에 다양한 플라스미드를 결합하여 이중 transfection을 수행할 수 있습니다. co-transfection의 경우, 대부분의 GFP 발현 세포가 관심 유전자를 co-expressioning하도록 보장하기 위해 GFP와 비교하여 관심 유전자를 과도하게 transfection(예: 3:1이 테스트해야 하는 최적 비율임)합니다.
    3. 큐벳을 큐벳 챔버에 놓습니다(그림 2). 시작 버튼을 눌러 사전 설정 프로그램을 실행합니다( 표 4의 electroporation 조건 참조). Measurements 프레임에 표시된 전류와 줄의 값을 기록합니다.
      참고: 사용자는 특정 조건을 변경할 수 있습니다. 예를 들어, 전압을 낮추는 것은 형질주입의 효율을 감소시킬 수 있지만 신경세포의 생존을 증가시킬 수 있다.
    4. 챔버에서 큐벳을 꺼냅니다. 전기천공법 직후 500μL의 도금 매체를 큐벳에 추가하고 피펫을 사용하여 큐벳의 샘플을 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
      참고: 매체를 더 빨리 추가할수록 세포 손상을 방지하는 데 도움이 되므로 전기천공법 후 생존율이 높아집니다.
    5. 각 웰에 원하는 수의 전기천공된 셀을 플레이트화합니다.
      참고: 12웰 플레이트에 20,000 - 100,000개의 세포를 플레이트화합니다. 조건에 따라 전기천공된 셀의 5-10%만 살아남을 수 있습니다. 정확한 숫자는 사용자가 테스트하고 조정해야 합니다.
    6. 표준 조건(37°C, 5% CO2, 포화 습도)에서 2-4시간 동안 배양합니다.
      참고: 잠복기가 끝나면 현미경으로 세포를 관찰하십시오. 배양액이 건강하다면 대부분의 세포가 표면에 달라붙어 눈에 보이는 신경돌기 확장이 싹을 틔우기 시작했을 것입니다.
    7. 도금 매체를 뉴런 배지(각각 표 1 및 표 2의 부피 및 조성)로 변경합니다.
  6. 세포 유지
    1. 배지를 새로 고치려면 배지의 절반을 제거하고 배양 7일 후에 동일한 부피의 새로운 사전 평형 배지를 추가합니다.
    2. 배양 10일째에 부피의 절반을 글루타민 보충제가 없는 새로운 신경 배지로 교체합니다( 재료 표 참조). 10일차 이후에는 격일로 이 단계를 반복합니다.
      참고: 배양 10일 후 세포는 스스로 글루타메이트를 생성합니다.

2. 저산소 챔버의 건설

  1. 이를 위해 나사 뚜껑이 있는 밀폐 용기 또는 이에 상응하는 밀봉 시스템을 사용하십시오(그림 3A). 플라스틱 용기의 벽에 두 개의 구멍을 뚫고 각 구멍에 플라스틱 튜브를 삽입합니다. 용기가 밀폐되도록 실리콘으로 밀봉합니다(그림 3).
    참고: 여기에서는 나사 뚜껑이 있는 원통형 플라스틱 용기(1리터 크기)를 사용하여 챔버를 구성했습니다. 컨테이너가 실험에 필요한 CV를 수용할 수 있을 만큼 충분히 큰지 확인합니다. 동일한 공간에서 더 많은 CV를 처리하기 위해 플라스틱 플랫폼을 서로 겹쳐 쌓을 수 있습니다(그림 3A).
  2. 버블링 챔버를 준비하려면(3.2 참조) 튜브보다 약간 작은 드릴이 있는 표준 기계 드릴을 사용하여 플라스크 캡에 구멍을 뚫고 구멍을 통해 플라스틱 튜브를 플라스크에 넣습니다. 밀폐 밀봉을 유지하기 위해 파라필름으로 구멍을 밀봉합니다(그림 3B).
  3. 용기와 플라스크에 에탄올 70%를 살균하고 사용하기 전에 1주기에 걸쳐 자외선을 조사합니다.

3. 산소-포도당 결핍(OGD)

참고: OGD에 대한 프로토콜은 Tasca et al.7에서 채택되었습니다.

  1. 이전에 항생제로 보충된 인산염 용액(표 2)으로 OGD 용액을 준비합니다.
    알림: 각 35mm 플레이트에 대해 5mL를 사용하십시오. 100mm 플레이트의 경우 10mL를 사용합니다.
  2. 버블링 챔버 내부에 OGD 용액을 추가하고(그림 3B) 수조(이미 37°C로 예열됨) 내부에 넣습니다. 플라스크를 질소 공급원(N2, 100%)과 연결합니다.
    참고 : OGD 용액에는 HEPES가 버퍼로 포함되어 있기 때문에 CO2가 필요하지 않습니다. OGD 용액이 중탄산염 완충 시스템을 기반으로 하는 경우 5% CO2 및 95% N2 를 사용하여 저산소 용액 및 챔버를 포화시킵니다.
  3. 부드럽게 거품이 나는 질소로 OGD 용액을 포화시킵니다. 용액을 20-30분 동안 약간 거품이 나는 상태로 두십시오.
  4. 즉시 플라스크를 세포 배양 후드로 옮기고 35mm 플레이트에 산소가 없는 OGD 용액 5mL 또는 100mm 배양 플레이트에 10mL를 추가합니다.
  5. 배양된 세포가 있는 CV를 OGD가 있는 플레이트로 이동합니다. 플레이트를 덮지 말고 저산소증 챔버로 옮기고 단단하지만 조심스럽게 닫으십시오.
    참고: 3.4단계 및 3.5단계는 가능한 한 빨리 완료해야 합니다. 인큐베이터 내부의 웰 플레이트에서 제어 CV(Neuronal Medium in normoxia)를 유지합니다. 또는 대조 뉴런을 포도당(10mM)이 보충된 정상 산소 OGD 배지에 노출시켜 저산소증 및 포도당 결핍의 영향을 보다 선택적으로 조사합니다.
  6. 질소 시스템을 저산소증 챔버에 연결하고 튜브가 열려 있는지 확인하십시오. 2-3 bar (예 : 2-3 분, 1 bar = 750 mmHg)의 압력으로 몇 분 동안 N2 로 챔버를 포화시킵니다 (그림 3C).
    참고: 여러 시점 사이에 15분 동안 OGD 솔루션을 다시 버블링하는 것을 잊지 마십시오.
  7. 질소 압력을 1.3-1.5 bar로 낮추고 저산소증 챔버의 두 튜브를 닫습니다(그림 3C). 챔버를 37°C, 5% CO2에서 필요한 시간(예: 60분) 동안 인큐베이터에 그대로 둡니다.
    참고: OGD 기간은 실험 조건 및 연구 목표에 따라 조정이 필요할 수 있습니다. 짧은 배양 시간(예: 30분)은 가벼운 저산소증을 시뮬레이션합니다. 2시간의 OGD는 일반적으로 뉴런에 매우 가혹합니다. 연구를 시작하기 전에 45분에서 90분의 OGD 지속 시간을 테스트하는 것이 좋습니다. 물론, OGD의 지속 기간은 OGD에서 회복된 후 총 생존 및 신경 세포 사멸의 상대적 시작에 영향을 미칩니다. 실시간으로 신경 세포의 사멸을 분석하는 것이 목표인 경우, 보다 효과적인 분석을 위해 OGD에서 회복된 후 몇 시간 후에 세포 사멸을 유발하는 OGD 조건을 달성하는 것을 목표로 합니다.
  8. 챔버를 열고 CV를 원래의 멀티웰 플레이트로 옮겨 회수합니다. 이 단계가 끝나면 두 가지 대안을 고려하십시오: 1) 소규모 실험의 경우 면역형광 및 이미지 분석을 위해 섹션 4로 진행합니다. 2) High Content Screening의 경우 Cell Analyzer(또는 이에 상응하는 플랫폼)에서 분석을 위해 Section 5로 진행합니다.
    참고: 라이브 이미징은 다양한 실험 지점을 실시간으로 모니터링할 수 있기 때문에 보다 유연한 접근 방식을 제공합니다.

4. 표준 면역형광 및 ImageJ에 의한 분석

참고: 회복 시간은 조건에 따라 1시간에서 24시간까지 달라질 수 있습니다.

  1. 10분 동안 1x PBS로 뉴런을 세척합니다.
    참고: 이미지를 진행하고 분석하는 방법에는 여러 가지가 있으므로 이 단계는 선택 사항입니다.
  2. RT에서 10분 동안 4% 파라포름알데히드로 뉴런을 고정합니다. 10분 동안 1x PBS로 세 번 씻습니다.
    참고: 파라포름알데히드는 독성이 있으므로 화학 물질 후드 아래에서 작업하십시오.
  3. 0.1% Triton X-100을 함유한 1x PBS를 10분 동안 첨가하여 뉴런을 투과시킵니다. 1x PBS로 세포를 빠르게 세척하십시오. 세탁할 때마다 10분 동안 세탁 단계를 두 번 반복합니다.
  4. CV에 350μL의 차단 용액(2% 소 혈청 알부민을 함유한 1x PBS)을 추가하고 최소 30분 동안 그대로 둡니다. 1차 항체(AB) 스톡(5× g 에서 30초 동안)을 스핀하고 필요한 희석액(예: 1:600에서 anti-GFP)으로 차단 용액과 혼합합니다.
    1. 커버슬립을 가습된 챔버(습도를 유지하고 증발을 방지하기 위해 물에 적신 티슈가 있는 상자)의 파라필름으로 옮깁니다. CV의 크기에 따라 각 CV에 1차 항체 희석액 60 또는 80 μL를 조심스럽게 추가하고 세포가 항체와 접촉하도록 합니다. CV를 4°C에서 배양합니다.
      참고: 전체 CV 표면을 덮을 수 있도록 CV 표면에 물방울을 형성해야 합니다. CV에 항체 용액을 피펫팅하는 동안 세포를 방해하지 마십시오. 배양 시간은 RT에서 2시간으로 단축될 수 있습니다.
  5. 파라필름 위에서 10분 동안 1x PBS로 CV를 세척합니다. 세탁 단계를 두 번 반복합니다.
  6. 2차 AB, 예: Alexa 488(1:500) 및 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI, 1:2,000)을 차단 용액에 희석합니다. CV의 크기에 따라 2차 AB 용액의 60-80μL 액적을 셀에 추가합니다. RT에서 어둠 속에서 1시간 동안 CV를 배양합니다. 1x PBS로 뉴런에서 2차 AB 및 DAPI를 10분 동안 세척하고 이 단계를 두 번 반복합니다.
  7. 면역형광 분석을 위해 CV를 장착 매체( 재료 표 참조)에 장착하고 건조 후 4°C의 어두운 곳에 보관합니다.
  8. 이미지 캡처 및 분석.
    참고: 도립 현미경을 사용하여 20x에서 이미지를 촬영했습니다(그림 4A, 재료 표 참조).
    1. 오픈 소스 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석하고 GFP 채널에 대한 마스크를 얻습니다(그림 4C).
      참고: 장비 가용성 및 실험 형식에 따라 뉴런을 이미징하고 분석하는 여러 가지 방법이 있습니다. 다음 워크플로우는 기본 예시로 제공되며, 여기서 목적은 이미지에 존재하는 개별 GFP 발현 뉴런의 소마를 식별하는 것입니다. 임계값 및 입자 크기와 같이 여기에 제시된 특정 값은 특정 실험 조건에 따라 사용자가 테스트해야 합니다. 또한 다른 필터 및 처리 단계가 추가될 수 있습니다. 예를 들어, ImageJ 필터 Subtract Background 및 Despeckle 은 종종 처리 시작 시 이미지를 정리하는 데 도움이 됩니다. 특정 실험 조건에 대한 워크플로우를 최적화하려면 이미지 분석에 대한 사전 경험과 정량적 이미지 분석의 기본 개념에 대한 지식이 필요합니다. 이미지 분석에 대한 자세한 가이드는 현재 프로토콜의 범위를 벗어나므로 다음 리소스를 권장합니다. ImageJ 사용자 가이드, https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/; 예제와 자습서는 https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.htm; MBF ImageJ 번들, https://imagej.net/mbf/index.htm.
    2. segmentation의 경우, 뉴런의 가장 밝은 영역인 soma를 분리하는 데 필요한 매개변수가 있는 Intensity segmentation을 선택합니다.: Menu | 이미지 | 조정 | 임계값 | 최소 임계값 설정 (예: 100) | 적용을 클릭합니다.
    3. 4.8.2에서 임계값을 반복합니다. 모든 이미지에 뉴런의 somas에 대한 마스크(즉, 분할된 이미지)를 볼 수 있습니다(그림 4E).
    4. 각 이미지에서 남아 있는 셀의 수를 얻고 결과를 스프레드시트로 내보내 계산을 수행하려면 Menu(메뉴) | 분석 | 입자를 분석하고 필요한 매개변수 값(예: 크기: 50-무한대 픽셀; 진원도: 0.5-1.00). t = 0 h에서 계수된 세포의 수가 식별된 총 세포 수라고 가정하고 다른 시점에서 살아남은 세포의 백분율을 계산합니다.
      참고: 크기 임계값이 낮을수록 소마보다 작은 물체를 필터링하는 데 유용합니다(예: 60-80μm2).
    5. ImageJ의 매크로 기록 기능을 사용하여 분석을 자동화하고 반복합니다. 플러그인 | 매크로 | 레코드 | Create를 클릭하여 매크로를 생성합니다.

5. IN Cell Analyzer 2200을 사용한 실시간 분석

  1. 셀 분석기에 12웰 플레이트를 삽입하고 CO2 시스템을 연결한 후 온도를 37°C로 설정합니다.
    참고: 이 단계는 이 플랫폼에서 쉽게 확장할 수 있으며, 96웰 플레이트에 도금된 뉴런에서 유사한 실험을 수행할 수 있습니다.
  2. 20x 대물렌즈를 선택하고, 웰당 5개의 필드를 무작위로 선택하고(이 예에서는 웰의 2.33% 커버), 각 형광 채널(이 경우 플루오레세인 이소티오시아네이트[FITC])에 대해 자동으로 초점을 맞춥니다. 획득 매개변수를 선택합니다(30시간 동안 16분 타임랩스). 시작을 누르고 기다립니다.
    참고: 이미징 필드의 수는 조사자에 의해 결정되어야 하며 단일 웰 내부의 가변성을 설명하기에 충분해야 합니다.
  3. IN Cell Developertoolbox v1.9를 사용하여 분석을 위한 적절한 워크플로를 설정할 수 있습니다.
  4. 뉴런 이미지(FITC 채널)를 분석하여 뉴런의 소마에 대한 마스크를 생성합니다(그림 4).
    참고: 목표는 이미지에 존재하는 개별 뉴런의 소마를 식별하는 것입니다. 이 분석은 ImageJ에 대한 섹션 4에 설명된 단계와 동일한 단계를 따릅니다. 워크플로우 및 일반적인 고려 사항에 대해서는 섹션 4를 참조하십시오. intensity threshold는 뉴런의 가장 밝은 영역인 soma를 선택하기 위해 결정됩니다.
    1. 세분화의 경우 필요한 매개변수(이 경우 최소 임계값 20005.40)가 있는 Intensity segmentation(강도 세분화)을 선택합니다.
    2. 후처리의 경우 Sieve 옵션을 선택하여 미리 결정된 값(여기서는 189픽셀(~80μm2))보다 큰 영역을 가진 대상을 유지합니다.
    3. Sum 매개 변수를 선택하여 마스크에서 식별된 모든 뉴런(살아남은 뉴런)을 각 필드와 시간 경과의 각 시점에 있는 웰의 모든 필드에 대해 계산하고 합산합니다.
    4. 결과를 스프레드시트로 내보냅니다. t = 0 h에서 계수된 세포의 수가 식별된 총 세포라고 간주하고 다른 시점에서 살아남은 세포의 백분율을 계산합니다. 조건 간의 비교를 용이하게 하기 위해 세포의 50%가 죽는 시간을 계산합니다.
      참고: 세분화 및 후처리 단계에 대한 매개변수는 식별할 구조에 따라 다른 형광 채널에 대해 사용자가 조정해야 합니다.

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결과

이 프로토콜은 뇌졸중의 체외 모델을 확립하는 것을 목표로 합니다. 적절한 뉴런 밀도를 얻는 것이 중요하며, 이를 통해 개별 전기천공된 뉴런을 인식하여 개별적으로 분석할 수 있습니다. 도금 후 신경 세포 배양 단계도 중요합니다. 배양에서 뉴런의 성숙은 점진적으로 진행됩니다. 성장 인자, 신경돌기 성장, 연결성 및 전기 생리학적 활동에 대한 의존도는 단계에 따라 크게 달라집니다. 시험관 내 4-6일의 이러한 특정 조건에서 신경돌기는 잘 확장되어 있지만 뉴런은 여전히 매우 미성숙하고 성장 인자에 크게 의존하며 상대적으로 낮은 전기생리학적 활성을 가지고 있습니다. 이 단계에서 OGD는 배아 발달에 더 가까운 조건을 시뮬레이션할 수 있습니다. 수지상 가시와 맑은 시냅스 클러스터는 시험관11에서 8-10일까지 관찰할 수 있습니다. 이러한 실험 조건 하에서 시험관 내 14일째에 피질 뉴런은 성숙하고 연결성 및 전기생리학적 활동의 완전한...

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토론

이 프로토콜은 체외 스트로크를 모델링하는 효과적인 방법을 보여줍니다. 이 목표를 달성하기 위해 우리는 전기천공법 시스템 NEPA215를 사용하여 피질 뉴런의 희소 라벨링을 제안했습니다. 이것은 키트 또는 특정 장치를 사용하는 다른 시스템에 비해 최소한의 운영 비용으로 프로토콜을 사용자 정의할 수 있는 개방형 시스템입니다. 순진한 뉴런과 전기천공된 뉴런의 혼합 배양은 저밀도 뉴런 배양에 비해 더 많은 유연성과 견고성을 허용합니다. 이를 통해 다양한 유전자, 구성 요소 및 단백질의 영향을 연구할 수 있으며 쉽게 확장할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 뇌졸중4에서 세포 내 신호전달에서 피질 뉴런에 의해 발현되는 신경자극 인자인 Nrg1의 역할을 결정하기 위해 유사한 접근법을 사용했습니다. 또한, 전기천공된 세포는 연구의 목적에 따라 희박하고 조정 가능한 수의 형광 세포를 ...

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

신경 배양에 대한 전문 지식을 공유해 주신 Carlos Dotti에게 감사드립니다. 또한 유럽 FEDERER 기금의 지원을 받는 CIPF(Centro de Investigación Principe Felipe)의 Cytomics Core Facility의 Alicia Martínez-Romero에게도 감사드립니다. 이 프로젝트는 스페인 경제경쟁력부(SAF2017-89020-R)의 지원을 받아 시약, 재료, YDC 및 PF의 급여를 지원하며, PF는 RyC-2014-16410 보조금으로도 지원됩니다. CGN 및 PF는 발렌시아나 총독부의 Conselleria de Sanitat와 AGM(ACIF/2019/015)의 지원을 받습니다. 앙겔라 로드리게스 프리에토(Ángela Rodríguez Prieto)는 스페인 과학혁신대학부(Spanish Ministry of Science, Innovation and Universities)의 지원을 받고 있으며, 보조금은 PRE2018-083562입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10cm 페트리 접시FISHER SCIENTIFIC, SL1130-9283
3.5 cm 페트리 접시Sterilin
75 cm2 플라스크Corning430641U
B-27Life Technologies17504-044
세포 배양 플레이트Corning incorporation Costar®3513
세포 인큐베이터Thermo Electron Corporation모델 371
세포 여과기 70 µ mFalcon352350
콜드 라이트Schott223488KL 1500 LCD
커버 슬립 (15mm)Marienfeld111530
CU500 큐벳 챔버Nepa Gene
CU600 큐벳 스탠드 홀더Nepa Gene
DAPISigma-Aldrich Quimica, SLD9542-10MG1:2000
DMSOPanreacA3672
Dumont Fine ForcepsFST11254-20
Dumont Fine ForcepsFST11252-00
EC-002S NEPA Electroporation Cuvettes, 2mm gapNepa Gene
Filter 스트레이너Falcon352350
Fine Scissors-Sharp-BluntFST14028-10
파인 가위-ToughCut rFST14058-09
GFP 치킨 IgYAves LabsGFP-10101:600
포도시그마68769-100ml
GlutaMAX-I 보충제 200 mM 100 mLFisher Scientific35050-061
HBSSThermofisher14175-095https://www.thermofisher.com/es/es/home/technical-resources/media-formulation.156.html
Hepes 1 MThermoFisher15630-080
말 혈청Invitrogen26050088
MEMThermofisher11095080https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11095080#/11095080
현미경 슬라이드 (폴리리신)VWR631-0107크기 : 25 x 75 x 1mm
Mowiol 4-88시그마-알드리치 퀴미카, SL81381-250G
바늘 노란색, 30 게이지BD Microlance™ 3304000
NEPA21 전기포레이터Nepa Gene
Neubauer 챔버Blau 브랜드717805
Neurobasal MediumThermoFisher21103-49
Opti-MEMInvitrogen31985-062
Parafilm콜-파머PM996
파라포름알데히드(PFA), 95%시그마-알드리치 퀴미카, S.L.158127-500G사용 솔루션: 4%
PEIPolysciences23966-1
Plasmid for GFPpCMV-GFP-ires-Cre, 설명: Fazzari et al., Nature, 2010
Poly-L-LysineSIGMAP2636
PS ( Penicillin, Streptomycin)ThermoFisher15140122
Serrate typsFST11152-10
실체 현미경WORLD PRECISION INSTRUMENTS
주사기BD Plastipak 1ml303176
Triton X-100Sigma-Aldrich Quimica, S. L.MDL 번호: MFCD00128254비이온
트립신-EDTAThermoFisher25300054
튜브 15 mLFisher05-539-4
튜브 50 mLVWR21008-242
Tupperware--나사 뚜껑이 있는 밀폐형 tupperware. SP Berner - 테이퍼 1 L Redondo con Rosca. 이에 상응하는 밀폐형 타파웨어는 모든 슈퍼마켓에서 구입할 수 있습니다.
수조SHELDON LABORATORY MODEL 12241641951
당

참고문헌

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  4. Navarro-González, C., Huerga-Gómez, A., Fazzari, P. Nrg1 intracellular signaling is neuroprotective upon stroke. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 3930186(2019).
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  14. Fazzari, P., Mortimer, N., Yabut, O., Vogt, D., Pla, R. Cortical distribution of GABAergic interneurons is determined by migration time and brain size. Development. 147 (14), 185033(2020).

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