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방법 논문

폐에 암 전이를 조사하기위한 영구적 인 창

5.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/62761

⸱

2021년 7월 1일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Structural Biology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 2Gruss-Lipper Biophotonics Center, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 3Department of Surgery, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 4Integrated Imaging Program, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Cente, 5Department of Pathology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서, 우리는 폐의 고해상도, 인트라비티 이미징을 가능하게 하는 뮤린 흉부에 대한 영구적으로 깃드는 광학 창의 외과 이식을 위한 프로토콜을 제시합니다. 창의 영속성은 폐에 있는 동적 세포 프로세스의 연구 결과, 특히 보급된 종양 세포의 전이성 진행과 같이 천천히 진화하는 그들에 적합합니다.

초록

암 관련 사망률의 ~90%를 차지하는 전이는 1차 종양에서 뼈, 뇌 및 폐와 같은 이차 부위에 암세포의 전신 확산을 수반합니다. 광범위하게 연구되었지만,이 과정의 기계학적 세부 사항은 제대로 이해되지 않습니다. 컴퓨터 단층 촬영(CT), 양전자 방출 단층 촬영(PET), 자기 공명 영상(MRI)을 포함한 일반적인 이미징 양식은 다양한 정도의 총 시각화를 제공하지만, 각 단계는 개별 종양 세포의 역학을 감지하는 데 필요한 시간적 및 공간 적 해상도가 부족합니다. 이 문제를 해결하기 위해 일반적인 전이성 부위의 인트라비티 이미징에 대해 수많은 기술이 설명되어 왔습니다. 이 사이트의, 폐는 생활을 지탱에 있는 그것의 섬세하고 중요한 역할 때문에 인트라생명 화상 진찰을 위해 접근하는 특히 도전적인 입증되었습니다. 몇몇 접근은 이전에 그대로 폐의 단하나 세포 인트라바이탈 화상 진찰을 위해 기술되었더라도, 모두는 6-12 시간으로 가능한 최대 화상 진찰 기간을 제한하는 고도로 침습적이고 말단 절차를 관련시킵니다. 여기에 설명된 폐(WHRIL)의 고분해능 이미징을 위한 최소 침습성 흉부 광학 창의 영구 이식을 위한 향상된 기술이다. 마이크로 카르타포그래피에 적응된 접근법과 결합된 혁신적인 광학 창은 여러 이미징 세션과 여러 주에 걸쳐 단일 세포 해상도에서 그대로 폐의 직렬 적인 인내 이미징을 용이하게 합니다. 화상 진찰 데이터를 수집할 수 있는 전례없는 시간 기간을 감안할 때, WHRIL는 전이성 진행의 근본적인 동적 기계장치 및 폐 내의 수많은 추가 생물학 프로세스의 가속된 발견을 용이하게 할 수 있습니다.

서론

사망의 ~90%를 담당하는 전이는 암 관련 사망률1의주요 원인이다. 임상관찰된 전이(뼈, 간, 폐, 뇌)2의주요 부위 중, 폐는 생체 내 현미경 검사를 통해 생체 내 이미징에 특히 도전적임을 입증하였다. 이것은 폐가 영구적 인 움직임에 섬세한 기관이기 때문이다. 폐의 지속적인 움직임은 내구 심장 운동에 의해 더 복합, 정확한 이미징에 상당한 장벽을 나타냅니다. 따라서, 고해상도 인트라비티 광학 이미징을 위한 양상에 대한 상대적 접근성으로 인해 폐 내의 암 성장은 종종 신비한 과정3으로간주되었다.

임상 환경에서는, 컴퓨터 단층 촬영(CT), 양전자 방출 단층 촬영(PET), 자기 공명 영상(MRI)과 같은 이미징 기술은 폐4와같은 온전한 생명 기관 내에서 깊은 시각화를 가능하게 한다. 그러나, 이 양식은 총 기관의 우수한 전망을 제공하지만 (종종 임상 증상의 발병 전에 병리학을 드러내는 것), 그들은 전이의 초기 단계를 통해 진행으로 개별 보급 종양 세포를 검출하는 부적절한 해상도입니다. 따라서 앞서 언급한 양식이 폐에 전이의 징후를 제공할 때, 전이성 포시는 이미 잘 확립되고 확산되고 있다. 종양 미세환경은 암 진행및 전이형성에중추적인 역할을 하기 때문에5,6,생체 내에서 전이성 파종의 초기 단계를 조사하는 데 큰 관심이 있다. 이러한 관심은 1차 종양이 검출되기 전에암세포가 보급된다는 인식이 높아짐에 따라 더욱 높아지고있으며,1차 종양이 검출되기전에도 7,8, 그리고 매크로 전이9로 나아지기 전에 1세포와 휴면 상태에서 수십 년 동안 생존한다는 증거가 증가하고있다.

이전에는 단일 세포 해상도에서 폐의 이미징은 반드시 전 생체 내 또는 각성제제(10,11,12,13)를포함하여 단일 시점으로 분석을 제한하고 있다. 이 준비는 유용한 정보를 제공하는 동안, 그들은 그대로 순환 시스템에 연결된 기관 내의 종양 세포의 역학에 대한 통찰력을 제공하지 않습니다.

이미징의 최근 기술 발전은 최대 12h14,15,16의기간 동안 단세포 해상도에서 그대로 폐의 생명 내 시각화를 가능하게했다. 이것은 기계 환기, 흉곽의 절제술 및 진공 보조 폐 고정을 포함하는 프로토콜을 사용하여 뮤린 모델에서 달성되었습니다. 그러나, 생리학적으로 전형적인 폐의 첫 번째 단일 세포 분해성 영상을 제공했음에도 불구하고, 이 기술은 매우 침습적이고 말단이며, 따라서 인덱스 절차를 넘어 추가 이미징 세션을 배제한다. 따라서 이러한 제한은14,15,16의휴면 및 재개시와 같이 12h 이상 걸리는 전이성 단계의 연구에 적용되지 않습니다. 또한, 이 화상 진찰 접근을 사용하여 관찰된 세포 행동의 패턴은 진공 유도된 압력 차동이 혈류량에 있는 우회를 일으키는 원인이 되기 위하여 확률이 높다는 것을 감안할 때, 신중하게 해석되어야 합니다.

이러한 한계를 극복하기 위해, 폐의 고해상도 이미징을 위한 최소 침습창(WHRIL)이 최근에 개발되어 기계적환기(17)를필요로 하지 않고 며칠에서 몇 주 동안 연쇄 이미징을 용이하게 한다. 이 기술은 정상적인 폐 기능의 보존을 위해 밀봉 된 흉부 구멍이있는 '투명 흉곽'의 생성을 수반합니다. 절차는 잘 용납되어 마우스가 기준 활동 및 함수를 의미있게 변경하지 않고 복구할 수 있도록 합니다. 각 각 이미징 세션에서 정확히 동일한 폐 영역을 안정적으로 지역화하기 위해, 마이크로카르타포그래피로 알려진 기술이 이창(18)에적용되었다. 이 창을 통해 폐의 혈관 침대에 도착하여 내피를 건너 세포 분열을 겪고 미세 전이로 성장함에 따라 세포의 이미지를 캡처 할 수있었습니다.

여기서, 연구 결과는 그것의 재현성과 질을 증가하는 동시에 수술을 단순화하는 WHRIL의 이식을 위한 향상된 수술 프로토콜의 상세한 설명을 제시합니다. 이 프로토콜은 전이의 근본적인 동적 프로세스의 조사를 가능하게 하기 위하여 디자인된 동안, 기술은 폐 생물학과 병리학의 수많은 프로세스의 조사에 대안적으로 적용될 수 있습니다.

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프로토콜

이 프로토콜에 설명된 모든 절차는 알버트 아인슈타인 의과 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 사전 승인을 포함하여 척추 동물 의 사용에 대한 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다.

1. 창의 패시비션

  1. 광학 창프레임(보충 도 2)을효소 활성 세제의 1%(w/v) 용액으로 헹구는 다.
  2. 유리 항아리 내부에는 광학 창 프레임을 70°C에서 30분 동안 수산화 나트륨 용액을 5%(w/v)로 담급니다.
  3. 제거 하고 탈화 된 물로 창 틀을 씻어.
  4. 새로운 유리 항아리 안에는 광학 창 프레임을 7% (w/v) 구연산 용액을 55°C에서 10분 동안 담급니다.
  5. 다시, 제거하고 탈이온 물로 창 프레임을 씻어.
  6. 반복 단계 1.2; 그런 다음, 제거하고 탈온 된 물로 창 틀을 세척합니다.

2. 수술 준비

  1. 후드 또는 라미나르 플로우 캐비닛에서 수술을 수행합니다. 수술 장의 오염을 피하려면 각각 준비, 수술 및 회복을 위해 뚜렷하고 분리 된 영역을 보장하십시오.
  2. 수술에 앞서, 자동 클라브에 있는 모든 수술 기구를 살균하십시오. 후속 절차가 계획되면 뜨거운 비드 멸균기를 사용하여 기기를 다시 멸균하십시오. 이 외과 적 수술에 대 한 팁 전용 기술이 사용 됩니다.
  3. 가열 된 수술 비드 및 비드 살균기에 전원.
  4. 마취 챔버에서 5 % 이소플루란으로 마우스를 마취합니다.
  5. 모발을 제거하려면 왼쪽 가슴 절개 부위에 탈모 크림을 넉넉하게 발라주세요. 20s 이상 후, 촉촉한 티슈 페이퍼를 사용하여 모발과 탈모 크림을 단단히 닦아냅니다. 수술 부위에서 모든 머리카락을 제거하기 위해 필요에 따라 반복하십시오.
  6. 2-0 실크 봉합사를 사용하여 22 G 카테터의 베이스에 매듭을 묶어 2 인치 긴 꼬리를 남깁니다 (그림 1A참조).

3. 폐 창 수술

  1. 방부제 비누를 사용하여 손을 씻으시면 됩니다.
  2. 새로운 수술에 앞서 새로운 멸균 장갑을 착용하십시오.
  3. 각막 건조와 마우스의 눈에 손상을 방지하기 위해, 양쪽 눈에 안연고를 적용합니다.
  4. 멸균 PBS의 90 μL에 부프레노르핀 10 μL (0.1 mg/kg)을 희석한 다음 수술 전 진통을 보장하기 위해 피하 주입합니다.
  5. 실크 봉합사 묶인 22 G 카테터15로마우스를 삽관한다. 인플레이션 전구를 사용하여 전구 압착 시 양측 가슴이 상승하는 것을 지적하여 성공적인 삽관을 확인하십시오.
  6. 마우스 주물 주위에 2-0 실크 봉합사를 묶어 삽관 카테터를 보호하십시오(그림 1B참조).
  7. 가열 된 수술 스탠드에 마우스를 놓고 왼쪽 흉부를 노출오른쪽 측면 decubitus에 배치합니다.
  8. 인공호흡기를 삽관 카테터에 연결합니다.
  9. 인공호흡기에서 제어되고 안정적인 환기를 보장한 다음 이소플루오란을 3%로 낮춥춥시다. 절차의 개시및 절차의 기간 내내 주기적으로, 발가락 핀치 테스트를 수행하여 마취의 적정성을 평가합니다.
  10. 종이 테이프를 사용하여, 앞팔과 뒷다리를 각각 가열 수술 단계로 고정시합니다. 수술장에 대한 노출을 최대화하기 위해 마우스 등 길이에 테이프를 다른 조각으로 놓습니다(그림 1C참조).
  11. 멸균의 보존을 위해 후드 아래에 있는 모든 수술 기구를 엽니다.
  12. 마우스의 피부에 살균제를 넉넉하게 적용하여 수술 부위를 살균합니다.
  13. 집게를 사용하여 피부를 들어 올리고 ~ 10mm 원형 절개를 하고, 흉골 왼쪽에 ~7mm, 서브코스트 마진보다 ~7mm 우수합니다(도1D).
  14. 주요 선박을 신중하게 식별합니다. 혈관의 분할이 필요한 경우, 배혈을 유지하기 위해 전기 카우터리 펜으로 양쪽 끝에서 소작.
  15. 갈비뼈를 덮어 연조직을 절제합니다.
  16. 집게를 사용하여 6th 또는 7th 립을 상승시킵니다. 무딘 미세 해부 가위의 단일 블레이드를 사용하여, 둥근 측은 폐를 향해, 조심스럽게 내구 공간(도 1E)에들어가기 위해 6th와 7th 갈비뼈 사이의 늑간 근육을 관통한다.
  17. 폐를 붕괴시키고 가슴 벽에서 분리하기 위해 결함에서 압축 공기 통을 섬세하게 배출합니다. iatrogenic 폐 손상을 방지하기 위해 짧은 버스트에 압축 공기를 발사.
  18. 생검 펀치를 절삭 공구 위에놓고(보조 도 1)를배치하고 늑간 절개를 통해 절삭 공구의 베이스를 신중하게 조작한다(도1F).
  19. 흉벽과 평행하게 절단 공구의 베이스를 지향한다. 리브케이지(그림 1G)를통해 5mm 원형 구멍을 뚫습니다.
    참고: 노출된 폐 조직이 손상의 흔적없이 분홍색인지 확인하십시오.
  20. 5-0 실크 봉합사를 사용하여, 구멍에서 지갑 문자열 스티치 ~1mm를 만들고, 둘레, 갈비뼈와 인터레이스(그림1H).
  21. 원형 결함의 가장자리가 창의 홈 내에 정렬되는 것을 창 프레임을 배치합니다(그림 1I참조).
  22. 5-0 실크 봉합사를 단단히 묶어 이식된 창을 단단히 잠급구합니다.
  23. 1 mL 주사기에 청약된 시아노아크레이트 젤 접착제 100 μL을 적재합니다.
  24. ~10-20s(도1J)에압축 공기의 꾸준한 부드러운 스트림을 적용하여 폐를 건조.
  25. 집게를 사용하여 외부 가장자리로 창 프레임을 잡고 부드럽게 들어 올려 창 프레임의 밑면에서 폐를 분리합니다.
  26. 광학 창 프레임의 밑면을 따라 청약 접착제의 얇은 층을 분배(도 1K).
  27. 폐를 팽창시키기 위해 인공호흡기의 양양성 최종 만료 압력(PEEP)을 증가시다.
  28. 10-20s를 보관하고, 광학 창프레임을 폐 조직에 부착하기 위해 부드럽지만 단단한 압력을 가한다(도1L).
  29. 남은 시아노아크라일트 젤 접착제를 직사각형 커버슬립에 5mm 방울을 분배합니다.
  30. 진공 픽업을 사용하여 5mm 커버슬립을 선택합니다. 커버슬립의 밑면을 접착제에 담근 다음, 직사각형 커버슬립의 측면에 대해 3회 과도한 접착제를 긁어 내어 매우 얇은 층만 남아있다(도 1M).
  31. 조심스럽게 광학 창 프레임의 중심에 오목 내부에 맞게 커버 슬립을 배치하고 각도로 폐 조직 위에 개최됩니다. 인공호흡기를 잠깐 고정하여 양압을 생성하고 폐를 하이퍼 팽창시다. 회전 운동을 사용하여 폐 조직과 평행하게 커버슬립을 지향하여 폐 표면과 커버슬립의 지하표면 사이에 직접 적인 예착을 생성합니다. 부드러운 압력을 유지하여 시아노아크레이트 접착제를 설정할 수 있습니다(~25s).
  32. 진공픽업(도 1N)에서커버슬립을 분리하기 위해 집게를 사용합니다.
  33. 5-0 실크 봉합사를 사용하여 지갑 끈 스티치를 다시 만들고, 이번에는 피부 절개의 컷 엣지에서 1mm <. 고정 매듭으로 단단히 묶기 전에 창 프레임의 외부 테두리 아래에 여분의 피부를 넣습니다.
  34. 커버슬립과 윈도우 프레임 사이의 밀착 씰을 보장하려면 금속 유리 인터페이스에서 소량의 액체 시아노아크라이레이트(그림 1O참조)를 분배합니다.
  35. 멸균 바늘을 1 mL 인슐린 주사기에 부착합니다. 시포이드 프로세스 아래에 바늘을 삽입하고, 왼쪽 어깨쪽으로 전진하고, 횡격막을 통해 흉부 구멍에 들어갑니다. 흉부 구멍에서 잔류 공기를 제거하기 위해 주사기에 부드럽게 다시 그립니다 (그림 1P참조).
  36. 마우스에서 테이프를 제거합니다.
  37. 이소플루란을 끕니다.
  38. 마우스가 깨어날 준비가 될 때까지 100 % 산소로 환기를 계속합니다.
  39. 마우스 주위에 2-0 실크 봉합사를 조심스럽게 자르고 마우스를 추방합니다.
  40. 마우스를 깨끗한 케이지로 옮기고 완전히 복구될 때까지 모니터합니다. 호흡에 있는 어려움의 표시가 존재하는 경우에 마우스를 안락사합니다.
  41. 멸균 인산염 완충액(PBS)의 90 μL에서 희석된 부프레노르핀 10μL(0.1 mg/kg)를 피하하여 수술 후 진통을 제공한다.

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결과

이 프로토콜에 설명된 외과 적 수술의 단계는 그림 1에요약되고 도시된다. 간단히, 수술 전에, 마우스는 마취되고 왼쪽 흉부 위에 머리는 제거됩니다. 마우스는 흉부 구멍의 침범 시 생존을 가능하게 하기 위하여 삽관되고 기계적으로 환기됩니다. 갈비뼈를 덮어 놓인 연조직은 절제되고,6번째와 7번째 갈비뼈에 걸쳐 작은 원형 결함이 생성됩니다. 광학 창 프레임은 결함에 삽입되고 그 아래쪽(투명 조리개 외부)은 폐 조직에 부착된다. 그런 다음 창 프레임은 봉합사와 접착제의 조합으로 고정되어 흉부 구멍을 다시 밀봉하고 박리 후 정상적인 호흡을 재개할 수 있습니다. 성공적으로 이식되면 폐는 광학 창(가슴 벽의 일부로 통합됨)을 준수하며, 내구 내 압력 그라데이션이 보존됩니다. 이렇게 하면 마우스의 편안한 생존을 허용하여 프로토콜 허용 량(2주)까지 매일 이미징할 수 있습니다. 그런 다음 다른Windows

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토론

폐와 같은 먼 전이의 사이트에서 고해상도 광학 이미징은 종양 세포 전이의 정교한 역학에 대한 통찰력을 제공합니다. 단일 암 세포의 생체 내 시각화와 숙주 조직과의 상호 작용을 가능하게 함으로써 고해상도 인트라바이탈 이미징은 전이의 근본적인 메커니즘을 이해하는 데 중요한 역할을 입증했습니다.

여기에 설명된 고해상도 다광자 현미경 검사를 통해 뮤린 폐의 직렬 이미징을 가능하게 하도록 설계된 광학 창의 영구 흉부 이식을 위한 향상된 외과 프로토콜이 설명되어 있다. 이 프로토콜을 사용하여 생성된 창은 잘 용인되고, 흉부 구멍을 성공적으로 재밀봉할 수 있는 능력을 감안할 때, 자발적인 환기에 필요한 내측 압력 그라데이션을 유지할 수 있습니다(뮤린 폐14,15,16,

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공개 사항

저자는 이해 상충을 공개하지 않습니다.

감사의 글

이 작품은 다음과 같은 보조금에 의해 지원되었다: CA216248, CA01330, 몬테피오레의 루스 L. Kirschstein T32 교육 보조금 CA200561, 메타비보 초기 경력 상, 그루스 - 리퍼 바이오 포토닉스 센터와 통합 이미징 프로그램, 제인 A. 아인슈타인 의과 대학의 분석 영상 시설(AIF)에 이미징 지원을 부탁드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
효소 활성 세제 1% (w/v) 용액Alconox IncN/A  수동 및 초음파 세척을 위한 프로테아제 효소가 함유된 농축된 음이온 세제
2 µ m 형광 마이크로스피어InvitrogenF8827
5mm 커버슬립전자 현미경 과학72296-05
수산화나트륨 5%(w/v) 용액Sigma-AldrichS8045
5% IsofluraneHenry Schein, Inc29405
RB-1 절단 바늘이 있는 5-0 꼰 실크Ethicon, Inc.774B
Sigma-Aldrich7%(w/v) 용액251275
8mm 스테인리스 스틸 창틀N/AN/A주문제작, <강한>보충 그림 2
9cm 2-0 실크 넥타이Ethicon, Inc.LA55G
5mm 일회용 생검 펀치Integra  33-35-SH
둔기 마이크로 해부 가위RobozRS-5980
황동 창문 도구 홀더N/AN/A맞춤 제작, 보충 그림 3
부프레노르핀호스피라0409-2012-32
카테리 펜Braintree ScientificGEM 5917
클로르헥시딘 글루코네이트; Becton, Dickinson and Company260100ChloraPrep 단일 스왑스틱 1.75 mL
압축 공기 캔니스터FalconDPSJB-12
시아노아크릴레이트 접착제Henkel 접착제LOC1363589
광섬유 조명기O.C. White CompanyFL3000
비드 살균기CellPoint ScientificGER  5287-120VGerminator 500
Graefe 집게RobozRS-5135
적외선 열 램프Braintree ScientificHL-1
인슐린 주사기Becton Dickinson329424
Isoflurane 기화기SurgiVetVCT302
Jacobson 바늘 홀더 잠금 장치Kalson SurgicalT1-140
긴 면 팁 어플리케이터Medline IndustriesMDS202055
NairChurch & 드와이트 주식회사
네오마이신/폴리믹신 B/바시트라신존슨 & Johnson501373005항생제 연
연고Dechra Veterinary Products17033-211-38
종이 테이프Fisher ScientificS68702
쥐 인공 호흡기Kent ScientificPS-02PhysioSuite
직사각형 커버 유리Corning2980-225
설치류 삽관 스탠드Braintree ScientificRIS 100
소동물 폐 팽창 전구Harvard Apparatus72-9083
스테인레스 스틸 절삭 공구N/AN/A주문제작, Supplementary Figure 1
Sulfamethoxazole and Trimethoprim oralantibiotic Hi-Tech Pharmacal Co.50383-823-16
생쥐용 SurgiSuite 다기능 수술 플랫폼, 온난화Kent ScientificSURGI-M02가열식 수술 플랫폼
기관 카테터Exelint International2674622 G 카테터
진공 픽업 시스템 금속 프로브Ted Pella, Inc.528-112
구연산 40002957고 안과 년

참고문헌

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