ANS는 Ca2+-ATPase 재조합 N-도메인에 바인딩합니다. 형광 스펙트럼은 295 nm의 파장에서 여기시 면에 FRET 와 같은 패턴을 표시합니다. Trp의 NBS 중재 화학 적 변형은 Trp 잔류물과 ANS 사이의 에너지 전송 (FRET)의 부재로 이어지는 N 도메인의 형광을 담금질합니다.
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방법 논문
트립토판-ANS FRET 연구를 위한 재조합 Ca2+-ATPase N-도메인에서 트립토판 잔류물의 화학적 수정
이 논문에서
요약
초록
사르코/폐막성 레티쿨룸 Ca2+-ATPase (SERCA)는 다양한 적합성으로 결정화 된 P 형 ATPase입니다. 그럼에도 불구하고 자세한 기능 정보는 격리된 재조합 도메인으로부터 얻을 수 있습니다. 엔지니어링(Trp552Leu 및 Tyr587Trp) 재조합 뉴클레오티드 결합 도메인(N-domain)은 리간 드렌드 결합 시 형광 응고를 표시합니다. 외외형 불소, 즉 8-anilino-1-naphthalene 설포네이트(ANS)는 아르그, 그의, 알라, 루 및 페 잔류물과의 정전기 및 소수성 상호 작용을 통해 뉴클레오티드 결합 부위에 결합합니다. ANS 결합은 370 nm의 파장(λ)에서 흥분될 때 형광 강도의 증가에 의해 입증된다. 그러나, 295 nm의 λ에서 흥분할 때, 형광 강도의 증가는 N-도메인 본질적인 형광의 담금질에 결합되는 것처럼 보입니다. 형광 스펙트럼은 Föster 공명 에너지 전송 (FRET)과 같은 패턴을 표시하여 Trp-ANS FRET 쌍의 존재를 제안하며, 이는 Tyr587Trp와 ANS 사이의 짧은 거리 (~20 Å)에 의해 지원되는 것으로 보입니다. 이 연구는 N-bromosuccinimide (NBS)에 의해 매개되는 Trp 화학 적 변형 (및 형광 담금질)에 의해 Trp-ANS FRET 쌍의 분석을 설명합니다. 화학적으로 변형된 N-도메인에서 ANS 형광은 370 nm의 λ에서 흥분할 때와 유사한 295 nm의 λ에서 흥분할 때 증가했습니다. 따라서 Trp 잔류물의 NBS 매개 화학 적 변형은 Trp와 ANS 사이의 FRET부재를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. Trp 형광이 없는 경우 ANS 형광의 증가를 관찰해서는 안됩니다. NBS에 의한 단백질에서 Trp 잔류물의 화학적 변형은 결합된 ANS에 가까운 Trp 잔류물 사이 FRET를 검사하는 데 유용할 수 있다. 이 분석은 다른 형광을 사용할 때 유용할 것입니다.
서론
Föster 공명 에너지 전달(FRET)은 단백질 구조 및 기능 연구에서 결합 또는 상호 작용 후 분자 구조 간의 거리를 결정하는 표준 기술이 되었다1,2,3,4. P형 ATPases에서 FRET는 사르코-내도 망상 Ca2+-ATPase(SERCA)2,5,6,7,8,예를 들어, 촉매 주기 동안의 구조적 변동을 FRET7에의해 전체 단백질로 분석하여 분석하는 데 사용되어 왔다.
FRET 기증자는 다양하며, 작은 형광 (외발) 분자에서 형광 단백질9,10에이르기까지 ....
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프로토콜
1. ANS 및 SERCA N 도메인 상호 작용의 결정(실리코)
- 바람직한 단백질 모델링소프트웨어(50)를이용하여 분자 모델링을 통해 단백질(SERCA N-domain)의 3차원(3D) 구조를 생성한다.
- 바람직한 분자 구조소프트웨어(51)를이용하여 뉴클레오티드 결합 부위를 형성하는 아미노산 잔류물을 확인하고, 아르그와 리스잔류물(35)의존재를 결정한다. 이들은 ANS 결합을 위해 요구되고 형광 강도 (양자 수율)를 증가시다.
- 분자 도킹(바람직한 도킹 소프트웨어 사용)52,53,54(FITC)의 상호작용을 결정하기 위해 분자 도킹(1)을 수행하여(이는 뉴클레오티드 결합 부위를 표시하는 Lys515와 공유 결합을 형성함), 및 뉴클레오티드-결합 부위에 아미노산 잔류물을 가진 ANS(도킹1)를실시한다.
- 선호하는 소프트웨어에서 측정 도구를 사용하여 Trp 잔류물과 바운드....
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결과
분자 도킹은 정전기뿐만 아니라 소수성 상호 작용을 통해 N-도메인의 뉴클레오티드 결합 부위에 ANS의 결합을나타낸다(도 1). Trp 잔류물과 ANS(뉴클레오티드 결합 부위에 바인딩)사이의 분자 거리(20 Å)는 FRET(도1)의발생을 지원합니다. 설계(engineered) 재조합 N-도메인은 친화성 크로마토그래피(그림2)에의해 고순도에서 얻어졌으며 형광 실험에 적합하였다. ANS-N-도메인 컴플렉스의 형광 스펙트럼은 λ=295 nm(그림3A)에서여기시 FRET와 같은 패턴을 나타냈다. NBS에 의한 Trp 잔류물의 화학적 변형은 N-도메인(도3B)의본질적인 형광을 담금질하도록 이끌었다. 화학적으로 NBS-변형 된 N-도메인에서, 실험 결과는 ANS 형광이 λ=29.......
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토론
ANS-N-도메인 복합체의 형광 스펙트럼은 295nm의 λ에서 흥분할 때 FRET 와 같은 패턴을 나타내며, Trp 잔류물과 ANS 사이의 분자 거리(20 Å)는 FRET(도1)의발생을 지지하는 것으로 보인다. NBS에 의한 Trp 화학 적 변형은 덜 형광 N 도메인(도 3B,스펙트럼 f);을 초래한다; 따라서 에너지 전송은 불가능합니다. ANS 형광 스펙트럼은 295 nm(도 3A 및 C)의λ에서 흥분 할 때 수정되지 않은 N 도메인의 것과 유사합니다.
따라서, 295nm의 λ에서 ANS의 직접 발동은 다른저자(28)가제안한 메커니즘과 합의되는 ATP 결합부위(도 3C)에바인딩될 때 ANS 형광.......
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공개 사항
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 부분적으로 FAI-UASLP 보조금 번호 C19-FAI-05-89.89 및 CONACYT 교부금 번호 316463 (아포요스 라 시엔시아 드 프론테라: 포르탈레시미엔토 y 만테니미엔토 드 인프라에스트루쿠라스 드 Investigación de Usocomún y Capacicn. 저자는 비디오 에디션에서 줄리안 E. 마타 모랄레스의 기술 적 지원에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아크릴 아미드 | 바이오 라드 | 1610107 | SDS-PAGE |
| 과황산 암모늄 | 바이오 라드 | 1610700 | SDS-PAGE |
| 8- 아닐리 노 -1- 나프탈렌 술폰산 | 시그마 -알드리치 | A1028 | 형광 비스 |
| - 아크릴 아미드 | 바이오 라드 | 1610125 | SDS-PAGE |
| N- 브로 모 숙신이 미드 | 시그마 -알드리치 | B81255 | 화학 물질 변형 |
| : N, N- 디메틸 포름 아미드 | J.T. 베이커 | 9213-12 | 원액 준비 |
| : 플루오레세인 이소 티오 시아네이 | 시그마 - 알드리치 | F7250 | 화학 형광 라벨 |
| 형광 큐벳 | Hellma | Z801291 | 형광 분석 |
| 형광 분석기 | Shimadzu | RF 5301PC | 형광 분석 |
| 히트랩&트레이드; FF | GE Healtcare | 11-0004-59 | 단백질 정제 |
| IPTG, 다이옥산 무료 | 미국 Bionalytical | AB00841-00010 | 단백질 발현 |
| 이미다졸 | 시그마-알드리치 | I5513-25G | 단백질 정제 |
| LB 매체 | Fisher Scientific | 10000713 세포 배양 | |
| Pipetman L P10L | Gilson | FA10002M | 형광 |
| 분석 Pipetman L P100L | Gilson | FA10004M | 형광 분석 |
| Pipetman L P200L | Gilson | FA10005M | 형광 분석 |
| Pipetman L P1000L | Gilson | FA10006M | 형광 분석 |
| Pipetman L P5000L | Gilson | FA10007 | 형광 분석 |
| Precision plus std | Bio-Rad | 1610374 | SDS-PAGE |
| 나트륨 도데 실 황산염 | 바이오 라드 | 1610302 | SDS-PAGE |
| 산 나트륨 이염 기성 | J.T. 베이커 | 3828-19 | 완충제 |
| 산 나트륨 일 염기성 | J.T. 베이커 | 3818-01 | 완충 제 |
| 사기 필터 0.2 um | Millipore | GVWP04700 | 용액 여과 |
| Temed | Bio-Rad | 1610801 | SDS 페이지 |
| 트리스 | 바이오 라드 | 1610719 | SDS-PAGE |
참고문헌
- Munishkina, L. A., Fink, A. L. Fluorescence as a method to reveal structures and membrane-interactions of amyloidogenic proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1768 (8), 1862-1885 (2007).
- Dong, X., Thomas, D. D.
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재인쇄 및 허가
