이 문서는 전 생체 내 실험을 위한 새로운 창자 기관 배양 시스템을 사용하여 호스트-미생물군유전체 상호 작용을 분석하기 위한 독특한 방법을 제시합니다.
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방법 논문
호스트-미생물군유병 상호 분석을 위한 장 내 장관 장기 배양 시스템
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이 논문에서
요약
초록
창 자 조직의 구조 호스트와 창 자 microbiota 사이 밀접 하 고 상호 상호 상호 작용을 촉진. 이러한 교차 회담은 지역적이고 체계적인 항상성을 유지하는 데 매우 중요합니다. 창자 microbiota 조성에 변경 (dysbiosis) 인간의 질병의 넓은 배열과 연결. 숙주-미생물군유동성 상호작용을 해부하는 방법은 생리조직 구조(생체내 동물 모델에서 사용할 때)와 실험 인자에 대한 제어 수준(간단한 체외 세포 배양 시스템에서와 같이)의 보존 중 내재된 절충을 포함한다. 이 절충을 해결하기 위해 Yissachar 외는 최근에 장 기관 배양 시스템을 개발했습니다. 이 시스템은 순진한 결장 조직 구조 및 세포 메커니즘을 보존하고 또한 엄격한 실험 제어를 허용, 쉽게 생체 내에서수행 할 수없는 실험을 촉진. 발광 성 변류 (혐기성 또는 호기성 미생물, 쥐 또는 인간, 약물 및 대사 산물의 전체 미생물 샘플 포함)에 다양한 창자 구성 요소 (예 : 상피, 면역 학적 및 뉴런 요소)의 단기 반응을 해부하는 것이 최적입니다. 여기에서는 맞춤형 창자 배양 장치를 사용하여 여러 장 조각의 장기 문화에 최적화된 프로토콜에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 발광 성 변투에 대한 숙주 반응은 조직 섹션 또는 전산 조직 단편의 면역 형광 염색, 처투 내 혼성화 (FISH) 또는 시간 경과 이미징에 의해 시각화 될 수 있습니다. 이 시스템은 차세대 시퀀싱, 유동 세포측정, 다양한 세포 및 생화학 적 분석을 포함한 광범위한 판독을 지원합니다. 전반적으로, 이 3차원 기관 배양 시스템은 크고 온전한 장 조직의 배양을 지원하고 현지 창자 환경에서 숙주 미생물 작용의 고해상도 분석 및 시각화를 위한 광범위한 응용을 가지고 있습니다.
서론
소장은 세포가 상호 작용하고 발광 함량 (microbiota, 음식 등)과 상호 작용하고 통신 할 수있는 특정 구조로 조직 된 광범위한 세포 유형 (상피 세포, 면역 계통 세포, 뉴런 등을 포함하는 매우 복잡한 기관)입니다. 1. 현재, 숙주 -microbiota 상호 작용을 분석할 수 있는 연구 툴박스에는 체외 세포 배양 및 생체 내 동물 모델2를포함한다. 생체 내 동물 모델은 생리조직 구조3을 제공하지만 실험 조절이 불량하고 실험 조건을 조작할 수 있는 능력이 제한적이다. 시험관 내 배양 시스템은, 다른 한편으로는, 미생물4로 보충될 수 있는 1차 세포 또는 세포주를 사용하여실험파라미터를 단단히 통제하지만 세포 복잡성 및 조직 아키텍처가 결여된다. 현대 체외 학적 제는 마우스 또는 인간소스에서파생 된 상피 오르가노이드와 같은 건강하고 병리학적인 인간 조직 샘플의 고급 사용을허용5,6,점막 미세 환경을 모방 샘플
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프로토콜
이 프로토콜은 동물 복지 윤리위원회가 승인한 동물 관리 지침을 따릅니다.
1. 실험 준비
- 창자 장기 배양 장치의 제조 (3 일)
- 3D 프린터를 사용하여 장기 배양 장치에 재사용 가능한 플라스틱 금형을 인쇄합니다(장치에는 24개의 크고 큰 구멍이 있는 6개의 우물이 있고, 장치 커버 뚜껑의 경우)(3D 파일이 부착됨).
참고: 이러한 플라스틱 금형은 수많은 장치의 제조에 사용될 수 있습니다. - 무딘 말단 바늘(22 G & 18G)을 장치 몰드 내의 적절한 위치에 삽입하고 1세트의 장치 및 뚜껑에 대해 폴리디메틸실록산(PDMS) 믹스(1:10 중량 비, 베이스 대 촉매)를 약 20g캐스팅한다.
- 금형을 진공 챔버에 30분 동안 놓고 PDMS 믹스에서 기포를 제거합니다.
- PDMS 중합을 완료하기 위해 하룻밤 동안 55 °C에서 금형을 배양합니다.
- PDMS가 설정되면 금형에서 바늘을 꺼내 서 조심스럽게 플라스틱 금형에서 배양 장치 와 뚜껑을 해제합니다.
- 수술 용 블레이드를 사용하여 우물 윤곽선에서 PDMS 잔류물을 제거합니다. 비독성 실리콘 접착제를 사용하여 PDMS 장치 와 장치 커버를 커버 유리 (75mm x 50m....
- 3D 프린터를 사용하여 장기 배양 장치에 재사용 가능한 플라스틱 금형을 인쇄합니다(장치에는 24개의 크고 큰 구멍이 있는 6개의 우물이 있고, 장치 커버 뚜껑의 경우)(3D 파일이 부착됨).
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결과
창자 기관 배양 시스템은 조직 생존성 ex vivo를 유지합니다. 조직 생존가능성에 대한 평가는 배양 기간 내내 이루어졌다. 결장 조직 단편은 창자 기관 배양 시스템에서 배양되었고 2/12/24 h 배양 에 따라 고정되었습니다. 장 상피 세포 (IEC) 층 무결성은 E-카데린과 사이토케라틴-18 항체를 사용하여 면역 형광 염색에 의해 검증되었다. 마찬가지로, 루멘 내의 대장 상피 및 점액 분비내의 점액이 채워진 잔 세포는 키-67염색(그림 2)에의해 표시된 바와 같이 식민지 토굴에서 IEC를 증식할 뿐만 아니라 검출하였다. 이러한 결과 및 기타9은 장 내 기능 및 구조 전 생체내 기능을 유지한다는 것을 보여준다.
급속한 전사 숙주 반응은 분할된 필라멘트 박테리아를 가진 장 식민지화에 의해 촉발되었다 (SFB). 두 개의 다른 면역 조절 창 자 미생물에.......
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토론
이 문서는 Yissachar 등최근 개발 한 ex vivo 창자 장기 문화에 대한 최적화 된 프로토콜을 설명합니다 (게시된 9 및 게시되지 않은 데이터). 창자 기관 배양 시스템은 발광 흐름을 유지하면서 온전한 장 조각의 멀티플렉스 배양을 지원합니다. 그것은 내- 및 초광도 환경 (자극 복용량, 노출 시간 및 유량을 포함)에 대한 완전한 제어를 제공하고 순진한 장 조직 구조와 세포 복잡성9을보존한다.
프로토콜의 중요한 단계에는 다음이 포함됩니다. (1) 조직 해부는 최소한의 시간에 수행되어야하며, 매우 부드럽게 조직 손상을 최소화해야합니다 (손상된 사이트를 통해 세포 사멸 및 발광 함량의 누출로 이어질 수 있음). (2) 입력 포트를 근위 결장과 연결하고, 출력 포트를 결장의 단부 끝에 연결하여 장치에서 조직 방향을 유지한다. (3) 용기를 장치에 연결한 후 조직이 손상되지 않았.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 창자 기관 문화 시스템 프로토콜을 최적화에 그들의 귀중 한 기여에 대 한 Yissachar 실험실의 과거와 현재 회원 감사. 원고의 비판적 편집에 대한 야엘 로어에게 감사드립니다. 이 작품은 이스라엘 과학 재단 (3114831 보조금 없음), 이스라엘 과학 재단 - 브로드 연구소 공동 프로그램 (8165162 보조금) 및 의료 연구를위한 가스너 기금, 이스라엘에 의해 지원되었다.
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| 다목적 접착제 셀란트 100% 실리콘 | DAP | 688 | |
| 큐빅 진공 탈착기 VDC-21+ 2 선반 | AAAD4021 | ||
| 유리 슬라이드 1 mm 두께의 | 코닝 | 2947-75X50 | |
| 미니 인큐베이터 im-10 | AAH24315K | ||
| MPC 301E 진공 펌프 | VI-412711 | ||
| 플라스틱 퀵 턴 튜브 커플 링 플러그 | Mcmaster | 51525k121 | |
| 플라스틱 퀵 턴 튜브 커플 링 소켓 | Mcmaster | 52525k211 | |
| Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 | 다우 | 폴리디메틸실록산, PDMS | |
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참고문헌
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Pearce, S. C., et al. Intestinal in vitro and ex vivo Models to Study Host-Microbiome Int....
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