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방법 논문

티 임플란트의 혈소판 유래 세포 외 소포 기능화

2.1K 조회수

DOI:

10.3791/62781

2021년 8월 5일

이 논문에서

요약

여기서, 우리는 혈소판 용해 (PL)에서 파생된 세포외 소포(EV)의 분리 및 티타늄(Ti) 임플란트 표면코팅에 대한 이들의 사용에 대한 방법을 제시한다. 우리는 낙하 주조 코팅 방법, 표면에서 의 EV 방출 프로파일, 그리고 티 표면 코팅 된 전기 EV의 생체 내 생체 적합성을 설명합니다.

초록

세포 외 소포 (EV)는 세포 통신에서 중요한 역할을 하는 생물학적 나노 채소입니다. 그들의 함량은 재생 의학에 있는 중대한 잠재력을 제시하는 단백질 과 핵산과 같은 적극적인 생체 분자를 포함합니다. 최근에는 혈소판 리사테(PL)에서 추출한 전기자동차가 PL에 필적하는 골성 능력을 보여주었다. 게다가, 생체 재료는 정형 외과 또는 치과 복원에 자주 사용됩니다. 여기서는 골성 특성을 향상시키기 위해 PL 유래 EV로 Ti 표면을 기능화하는 방법을 제공합니다.

EV는 크기 제외 크로마토그래피에 의해 PL에서 분리되며, 그 후 Ti 표면은 드롭 캐스팅에 의해 PL-EV로 기능화됩니다. 기능화는 락테이트 탈수소효소(LDH) 방출 분석서에 의해 EV 방출 및 생체 적합성에 의해 입증된다.

서론

전기자동차는 모든 세포에 의해 분비되는 멤브레인 소포(30-200 nm)이며 화물을 전달함으로써 세포 간 통신에서 중요한 역할을 한다. 그(것)들은 핵산, 성장 인자, 또는 생리활성 지질1을 포함할 수 있는 액티브한 생체 분자의 각종을 포함합니다. 이러한 이유로, EV치료에서 그들의 잠재적인 사용에 대 한 평가 되었습니다. 정형 외과 및 뼈 재생의 관점에서, 다른 소스에서 전기 테스트 되었습니다. 그 중에서도 혈소판 유래 전기는 낮은 세포독성 프로파일2,3을 유지하면서 줄기 세포에 대한 분화 효과를 유도하는 것으로 나타났다. 따라서, 매일 임상 실습에서 이를 사용하기 위해서는 전기자동차와 생체재료의 결합 가능성을 탐구하기 위한 추가 연구가 필요하다.

티타늄 기반 생체 재료는 기계적 특성, 높은 생체 적합성 및 장기 내구성으로 인해 뼈 치유 임상 개입을위한 발판으로 널리 사용됩니다4. 그럼에도 불구하고, Ti 임플란트는 생물활성 물질이므로 주변 뼈 조직5와 결합할 수 있는 능력이 좋지 않습니다. 이러한 이유로, 티....

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프로토콜

혈소판 리사테(PL)는 IdISBa Biobank가 제공하는 신선한 버피 코트를 사용하여 기관 가이드라인3 에 따라 이전에 설명된 바와 같이 얻어진다. 현재 프로젝트에 대한 그들의 사용은 윤리위원회 (IB 1995/12 BIO)에 의해 승인되었습니다.

1. PL에서 격리된 EV

  1. 더 큰 바디 제거
    1. 실온에서 PL을 해동하십시오.
    2. 원심분리기 PL에서 1,500 x g 에서 4°C에서 15분 동안. 이 셀 파편이 포함된 펠릿을 폐기하십시오.
    3. 상체를 수집하고 4 °C에서 30 분 동안 10,000 x g 에서 2 개의 연속 원심 분리를 수행합니다.
      참고: 펠릿은 마이크로베실과 같은 더 큰 전기에 해당하며,이 경우 폐기됩니다.
    4. 상체를 먼저 0.8 μm 다공성 멤브레인을 통과한 다음 0.2 μm 다공성 멤브레인을 통해 필터링합니다.
      참고: 이러한 단계는 원하지 않는 모든 EV를 제거합니다.
    5. 필터링된 PL을 풀로 풀과 사용 전까지 -20°C에 보관하십시오.
  2. 크기 제외 크로마토그래피
    1. 여과된 PBS와 원하는 유....

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결과

이 문서에 제시된 방법을 사용하면 기능성 티타늄 디스크를 사용하여 EV를 얻을 수 있습니다. 전기 자동차는 물리적으로 표면에 결합되어 시간이 지남에 따라 지속적인 방출을 허용합니다. 방출되는 전기자동차의 양은 2일, 6, 10 및 14일에 NTA로 측정할 수 있다. 첫 번째 측정, 2 일에, 약 109 EV가 출시 되는 것을 보여, 6 일에 지속적인 출시 다음 (~108 EV); 10일(~107EV ), 14일차(~107EV ). 이는 시간이 지남에 따라 출시된 EV의 양이 감소했음에도 불구하고 지속적인 릴리스를 확인합니다.

figure-results-1
그림 3

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토론

이 프로토콜은 TI 표면에 EV 기능화에 대한 명확한 지침을 제공하는 것을 목표로합니다. 제시된 방법은 기능화의 물리작용 형인 낙하 주조 전략을 기반으로 한다. Ti 표면에 대한 EV 기능화에 관한 불쌍한 참고 문헌이 존재하지만 Ti10에서 EV를 고정하여 다른 이점을 보여주는 연구는 거의 없습니다. 어쨌든, 탐구된 전략의 몇몇은 생화학적 결합8, 중합체 함정9 또는 드롭 주조10을 포함합니다. 공유 결합을 통한 화학 코팅의 사용은 더 높은 등급의 기능화로 보다 균일한 코팅을 달성할 수 있지만 화학 반응은 EV 구조 및 기능에 해를 끼칠 수 있습니다15. 낙하 주조는 중합체 함정 또는 생화학 적 결합에 비해 쉽고 저렴한 방법입니다.

해결할 수 있는 프로토콜의 한 가지 .......

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 INstituto 드 살루드 카를로스 III, 장관 드 Economía y Competitividad에 의해 투자되었다, ESF 유럽 사회 기금과 ERDF 유럽 지역 개발 기금에 의해 공동 투자 (MS16/00124; CP16/00124; PI17/01605), 디레치오 제너럴 디Investigació, 콘셀러티아 d'Investigació, 지배 발레어 (FPI/2046/2017), 그리고 PROGRAMA 주니어 델 프로젝트 탤런트 플러스, construyendo SALUD, 제네란도 VALOR (주니어01/18), 지속 가능한 관광 에 의해 금융.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0,8 &마이크로; m 주사기 필터Sartorius16592K
1.5 mL 원심분리기 튜브SPL 생명 과학PLC60015
1mL 주사기BD303174
96-웰 배양 플레이트SPL 생명 과학PLC30096
Absolut 에탄올ScharlauET0006005PMilli-Q® 물 AKTA로 20%  에탄올을 준비하는 데 사용됩니다
정수기 시스템GE Healthcare8149-30-0014
Allegra X-15R 원심분리기Beckman Coutler392934SX4750A 스윙 로터
원심분리기 5430 REppendorf5428000210F-45-48-11 로터
원뿔형 튜브, 원뿔형 바닥, 50mlSPL 생명 과학PLC50050
세포 독성 검출 키트(LDH)Roche11644793001
일회용 주사기 10 mlBecton DickinsonBDH307736
DMEM 저포도당 GlutamaxGIBCO21885025
Dulbecco의 PBS (1x)Capricorn ScientificPBS-1A
태아 소 혈청 (FBS) Embrionic 인증GIBCO16000044
Filtropur S 0.2 µ m 주사기 필터Sarstedt83.1826.001
HiPrep  16/60 세포크릴  S-400 HRGE Healthcare28-9356-04프리캐스트 컬럼
인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(hUC-MSC)IdISBa Biobank
Nanodrop 2000 분광 광도계ThermoFisherND-2000
NanoSight NS300 나노입자 추적 분석MalvernNS300λ= 532nm에서 내장 레이저 및 카메라 sCMOS
가 있는 장치니들테루모946077135
질산 69,5%ScharlauAC16071000
Optima L-100 XP 초원심분리기Beckman Coulter8043-30-1124SW-32Ti 로터
페니실린-스트렙토마이신 용액 100XBiowestL0022
pH 테스트 스트립 4.5-10.0SigmaP-4536
혈소판 용해물(PL)IdISBa Biobank혈 후 버려진 버피 코트
폴리프로필렌 원심분리기 통Beckman Coutler326823
Power wave HTBioTek10340763
Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, 인쇄Sarstedt62554502
Sodium hidroxideSharlauSO04251000
티타늄 임플란트 복제품임플란트 미디어, SANA티타늄 등급 IV. 직경 : 6,2 mm. 높이 : 1,95 mm
트립신 -EDTA 1 XBiowestL0930
Tryton X100시그마T8787
. 헌

참고문헌

  1. Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  2. Torreggiani, E., et al. Exosomes: novel effectors of human platelet lysate activ....

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재인쇄 및 허가

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