Method Article

Echinococcus granulosus의 스트로빌화 된 형태의 일시적인 형질 도입

DOI:

10.3791/62783

⸱

September 16th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Student Research Committee, School of Medicine, Kerman University of Medical Sciences, 2Research Center for Hydatid Disease in Iran, Kerman University of Medical Sciences, 3Department of Parasitology and Mycology, Faculty of Medicine, Kurdistan University of Medical Sciences, 4State Key Laboratory for Zoonotic Diseases, Key Laboratory of Zoonosis Research, Ministry of Education, Institute of Zoonosis, College of Veterinary Medicine, Jilin University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 세 번째 세대 렌티 바이러스 벡터를 사용하여 Echinococcus granulosus 의 다른 발달 단계에서 신속한 일시적인 형질 도입 기술을 설명합니다.

Abstract

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낭포성 echinococcosis 또는 hydatid 질병은 송곳니의 장에 숨어있는 작은 촌충 인 Echinococcus granulosus 에 의해 야기 된 가장 중요한 동물 유행성 기생충 질병 중 하나입니다. 병인과 질병 조절 및 예방의 메커니즘을 이해하기 위해 유전자 연구를 적용해야 할 긴급한 필요성이 있다. 그러나 효과적인 유전자 평가 시스템의 부족은 Echinococcus 종을 포함한 cestode 기생충의 기능적 유전학에 대한 직접적인 해석을 방해합니다. 본 연구는 E. granulosus의 metacestode 및 strobilated 형태에서 렌티바이러스 유전자 일시적 형질도입의 가능성을 입증한다. 프로토스콜렉세스(PSCs)를 수성체 낭종으로부터 분리하고 특정 이족 배양 배지로 옮겨 스트로빌화된 웜으로 발전시켰다. 웜을 형질도입 과정 대조군으로서 HEK293T 세포와 함께 수확된 3세대 렌티바이러스로 형질감염시켰다. 24 h 및 48 h에 걸쳐 스트로빌화 된 웜에서 뚜렷한 형광이 검출되었으며, 이는 E. granulosus에서 일시적인 렌티 바이러스 형질도입을 나타냅니다. 이 연구는 촌충에서 렌티 바이러스 기반 일시적인 형질도입에 대한 첫 번째 시도를 제시하고 편평충 생물학에 대한 실험 연구에서 잠재적 인 영향을 미치는 유망한 결과를 보여줍니다.

Introduction

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낭포성 echinococcosis (CE)는 Taeniidae 1,2 가족 내의 작은 촌충 인 Echinococcus granulosus에 의해 유발되는 가장 중요한 기생충 질병 중 하나입니다. E. granulosus에 대한 면역 진단 및 백신 개발에 대한 광범위한 연구가 수행되었습니다. 그러나 기생충 생물학의 분자 기초에 대한 부적절한 지식은 하이다티드 질병 3,4,5,6의 진단, 관리 및 예방에 큰 한계를 제기합니다.

최근 몇 년 동안, 게놈 시퀀싱 및 전사 방법의 개발로 인해, 여러 연구 그룹 7,8,9에 의해 편평충에 대한 광범위한 분자 연구가 수행되었습니다. 그러나 기생충의 세계에서, 기생 편평충의 유....

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Protocol

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이 연구는 국립 의학 연구 개발 연구소 및 연구 윤리 검토위원회, No. 958680의 승인을 받았다. 렌티바이러스는 BSL-2 유기체로 분류되고; 따라서, 이 프로토콜의 모든 실험실 배양 절차는 멸균 실험실 관행을 사용하여 수행되었고, NIH 가이드라인에 따라 층류 후드 하에서 수행되었다. 도 1은 상이한 E. 과립 단계에 대한 연구 프로토콜의 개략적인 프리젠테이션을 도시한다.

1. 수국 낭종 수집

  1. 도축장에서 일상적으로 도살되는 자연적으로 감염된 양으로부터 간 수다이드 낭종을 수집하십시오.
  2. protoscoleces (PSCs)를 흡입하기 전에 멸균 거즈와 70 % 알코올을 사용하여 낭종 표면을 완전히 살균하십시오.
  3. 흡인물 20-50 mL의 히다티드 유체를 멸균 50 mL 원뿔형 튜브로 배출합니다.
  4. 배수 후 날카로운 칼날로 낭종을 닦아내고 발아층을 멸균 된 50mL 원뿔형 튜브로 옮긴 다음 PSC의 수집을 늘리기 위해 단기간 (~ 2 분) 동안 흔들어 소모합니다. 분자 특성화를 위해 발아층을 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
  5. PSCs 3-5x를 포스페이트....

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Results

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여기에서, 우리는 세 번째 세대 렌티바이러스 벡터를 사용하여 E. granulosus에서 신속하고 효율적인 일시적 형질도입 기술을 기술한다. PSCs를 이phasic 배지에서 배양하여 앞서 기술한 바와 같이 스트로빌화된 웜을 수득하였다(25,26). Protoscolece는 시험관 내에서 6 주 후에 스트로빌 화 된 웜으로 발전합니다. E. granulosus의 상이한 단계는 질내 PSC (도 2A), 질내 PSC (도 2B), 및 첫 번째 및 세 번째 proglottid 형성 (도 2C-E)을 갖는 스트로빌화된 웜을 포함하는 이phasic 배양 배지에서 관찰되었다.

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Discussion

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선충류와 Platyhelminthes 생물학의 분자 기초를 이해하는 것은 동물 유행성 기생충의 병원성을 이해하는 데 중요합니다27. 효과적인 유전자 평가 시스템의 부족은 Echinococcus 종12,27을 포함한 cestode 기생충의 기능적 유전학의 직접적인 해석에 큰 장애물입니다. 본 연구는 E. granulosus transient transduction에서 lentivirus의 우수한 잠재력을 입증한다.

렌티바이러스 형질도입은 사용의 단순성 및 일시적 형질도입의 속도를 안정한 세포주의 강력한 발현과 결합하여 포유동물 세포(28)에 전이유전자를 전달한다. 이 연구의 주요 목표는 렌티 바이러스 벡터 형질도입 과정을 설명하는 것이 었으며, 이는 향후 Ech.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 간행물에서보고 된 연구는 엘리트 연구원 보조금위원회가이란 테헤란의 국립 의학 연구 개발 연구소 (NIMAD)의 수상 번호 958680으로 지원되었습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12-웰 배양 플레이트SPL Life Sciences30012
25 cm2 배양 플라스크SPL Life Sciences70325
6-웰 배양 플레이트SPL Life Sciences30006
칼슘 클로라이드Sigma-AldrichC4901-500G작업 농도: 2.5  mM
CMRL 1066 매체Thermo Fisher Scientific11530037
CO2 인큐베이터memmertICO150
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270-1KG
DMEMLife Technology12100046
Dog bile안락사된 개에서 분리하고 0.2 &mu로 살균; m 주사기 필터
Eosin YSigma-AldrichE4009-5G는 작업 제외 테스트를 위해 Eosin의 0.1%를 준비합니다
Fetal Bovine Serum (FBS)DNAbiotechDB9723-100ml열 비활성화  의  FBS (30분에 40분 > C)
태아 송아지 세럼 (FCS)DNAbiotechDB9724-100ml열 비활성화  의  FCS (30분에 40분 ° C)
HEK293TBONbiotechBN_0012.1.14인간 배아 신장 293T
HEPES 완충 식염수(HBS)Sigma-Aldrich51558-50ML2x 농축액
반전 형광 현미경OLYMPUSIX51
페니실린시그마-알드리치P3032-10MU작업 농도: 100 IU/mL
펩신로슈10108057001작업 농도: 2 mg/mL, pH 2
인산염 완충 식염수(PBS)DNAbiotechDB0011이 시약은 D.W
폴리브레네(트랜스펙션 시약)Sigma-AldrichTR-1003-G
BioIdeaBI-1006-05
중탄산나트륨(NaHCO3)Sigma-AldrichS5761-1KG
스트렙토 마이신시그마 - 알드리치S9137-25G작업 농도 : 100 & g/mL
3세대 렌티바이러스 플라스미드(pCDH513b)SBI 시스템 생명과학(BioCat GmbH)CD513B-1-SBI전달 벡터(이란 마슈하드에 소재한 이란 교육문화연구센터(ACECR)의 분자 의학 연구부에서 상업적으로 획득)
3세대 렌티바이러스 플라스미드(pLPI 및 pLPII)인비트로겐(Life Technologies)K4975-00헬퍼 벡터(이란 마슈하드에 소재한 이란 교육문화연구센터(ACECR)의 분자 의학 연구부에서 상업적으로 획득)
3세대 렌티바이러스 플라스미드(pMD2G)AddgenePlasmid 12259헬퍼 벡터(이란 마슈하드에 소재한 이란 교육문화연구센터(ACECR)의 분자 의학 연구부에서 상업적으로 획득)
트리스/EDTA 버퍼(TE)DNAbiotechDB9713-100ml
TrypsinSigma-AldrichT9935-50MG1x 작업 용액 (pH 7.4– 7.6)
. 세포 RPMI 매체에서 1분 이내에 용해됩니다.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 315(2017).
  2. Borhani, M., et al. Echinococcoses in Iran, Turkey, and Pakistan: Old diseases in the new millennium. ....

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Echinococcus GranulosusTransient TransductionLentiviral VectorsStrobilated WormsHydatid DiseaseProtoscoleces IsolationBiphasic CultureGene TransferFluorescence MicroscopyTapeworm Genetics

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