Echinococcus granulosus의 스트로빌화 된 형태의 일시적인 형질 도입

낭포성 echinococcosis (CE)는 Taeniidae ^1,2 가족 내의 작은 촌충 인 Echinococcus granulosus에 의해 유발되는 가장 중요한 기생충 질병 중 하나입니다. E. granulosus에 대한 면역 진단 및 백신 개발에 대한 광범위한 연구가 수행되었습니다. 그러나 기생충 생물학의 분자 기초에 대한 부적절한 지식은 하이다티드 질병 3,4,5,6의 진단, 관리 및 예방에 큰 한계를 제기합니다.

최근 몇 년 동안, 게놈 시퀀싱 및 전사 방법의 개발로 인해, 여러 연구 그룹 ^7,8,9에 의해 편평충에 대한 광범위한 분자 연구가 수행되었습니다. 그러나 기생충의 세계에서, 기생 편평충의 유전자 전달 기술의 발전은 일부 원생동물^10,11,12를 위해 개발 된 재현성이 높은 일시적인 형질도입 방법과 비교하여 여전히 제한적입니다.

바이러스 전달 시스템의 사용은 지난 20 년 동안 전이유전자 전달 및 유전자 / 단백질 조사를위한 필수 도구로 부상했습니다¹³. 렌티바이러스는 분열 세포와 비분열 세포를 모두 감염시켜 유사분열 후 세포 ^14,15,16을 감염시킬 수 있다. 최근의 증거는 포유동물 세포에서 렌티바이러스 기반 형질도입 시스템을 사용하는 것이 이전의 녹인/녹다운 기술의 한계 대부분을 극복할 수 있는 잠재력을 제공한다는 것을 나타낸다. GFP 발현과 같은 적절한 분자 마커를 갖는 발현 렌티바이러스 벡터의 설계 및 구축은 앞서¹⁶에서 설명되었다. 따라서, 우리는 E. granulosus의 protoscoleces 및 strobilated worms에서 GFP 리포터 유전자의 렌티바이러스 일시적 형질도입을 평가한다.

이 연구는 국립 의학 연구 개발 연구소 및 연구 윤리 검토위원회, No. 958680의 승인을 받았다. 렌티바이러스는 BSL-2 유기체로 분류되고; 따라서, 이 프로토콜의 모든 실험실 배양 절차는 멸균 실험실 관행을 사용하여 수행되었고, NIH 가이드라인에 따라 층류 후드 하에서 수행되었다. 도 1은 상이한 E. 과립 단계에 대한 연구 프로토콜의 개략적인 프리젠테이션을 도시한다.

1. 수국 낭종 수집

1. 도축장에서 일상적으로 도살되는 자연적으로 감염된 양으로부터 간 수다이드 낭종을 수집하십시오.
2. protoscoleces (PSCs)를 흡입하기 전에 멸균 거즈와 70 % 알코올을 사용하여 낭종 표면을 완전히 살균하십시오.
3. 흡인물 20-50 mL의 히다티드 유체를 멸균 50 mL 원뿔형 튜브로 배출합니다.
4. 배수 후 날카로운 칼날로 낭종을 닦아내고 발아층을 멸균 된 50mL 원뿔형 튜브로 옮긴 다음 PSC의 수집을 늘리기 위해 단기간 (~ 2 분) 동안 흔들어 소모합니다. 분자 특성화를 위해 발아층을 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
5. PSCs 3-5x를 포스페이트 완충 식염수 (PBS)로 세척한다.
6. PSCs를 5분 동안 0.1% 에오신으로 관찰하여 광학 현미경으로 PSC 생존율을 확인하였다. 문화에 대해 95 % 이상의 생존 능력을 가진 PSC를 사용하십시오.
7. PSC 침전물을 2 mL의 펩신 (2 mg / mL, pH 2)으로 15-20 분 동안 처리하십시오.
8. 개별 PSC를 분리하려면 PBS에서 PSC 침전물을 재현탁하고 멸균 거즈의 두 층을 통해 새로운 멸균 50mL 원뿔형 튜브로 통과시킵니다.
   참고: 광학 현미경을 사용하여 PSC 퇴적물 50μL에 대한 세 가지 카운트의 평균을 계산합니다. 후속 시험의 경우 추정 값을 사용하여 PSC/μL을 결정합니다. 각각의 히다티드 낭종 단리물은 PCR-시퀀싱¹⁷ 또는 고분해능 용융 곡선 분석(¹⁸)과 같은 분자 방법에 의해 뉴클레오티드 다형성에 기초하여 특성화되어야 한다.

2. 성인 벌레를 얻기 위해 E. granulosus의 PSCs의 Biphasic 재배

참고: 분리된 PSC는 층류 캐비닛 클래스 II 하에서 멸균 조건에서 배양되어야 합니다. 다음 단계¹⁹로 진행하기 전에 이phasic 배양 배지의 고체 및 액체 상을 별도로 준비한다.

1. 두 단계로 구성되도록 이phasic 배양 배지를 준비한다.
   1. 고체상의 경우, 소 혈청 10 mL를 25 mL 플라스크에 첨가하고 76°C에서 20-30분 동안 응고되도록 방치한다.
   2. 액상 (변형 CMRL)의 경우, 100 mL의 열 불활성화 태아 송아지 혈청 (FCS), 36 mL의 5 % 효모 추출물, 5.6 mL의 30 % 포도당 (증류수 중), PBS의 5 % 담즙 1.4 mL, 20 mM HEPES 완충액 및 10 mM NaHCO3를 CMRL-1066 배지 260 mL에 섞는다. 마지막으로 페니실린 (100 IU / mL)과 스트렙토 마이신 (100 mg / mL)을 혼합물에 첨가하십시오.
2. 액상 배지 10 mL를 각 25^cm2 배양 플라스크에 첨가한다.
3. 배양 플라스크에 ∼5,000 PSCs를 첨가하고, 플라스크를 CO2 인큐베이터(37°C, 5%_CO2)로 옮긴다.
4. 24-48시간 후, PSCs를 고상(소 혈청)을 갖는 새로운 플라스크로 옮기고 플라스크 당 동일한 신선한 액상 배지 1 mL를 첨가한다. 플라스크를 CO2 인큐베이터(37°C, 5%_CO2 )로 옮_긴다.
5. 매 5-7일마다, 배지의 색깔의 변화 및 분화된 PSCs의 추정된 비율에 기초하여 배지를 신선한 액상 배지로 교체한다.
   참고: 프로토스콜렉스는 배양 후 환경 변화에 빠르게 반응하며, 대부분은 2-3주 이내에 분화를 겪습니다. 영양소의 소비와 프로토스콜렉스의 성장과 발달로 인해 배양액의 pH가 변하고 색상이 주황색과 노란색으로 바뀝니다.

3. E. granulosus의 PSCs의 단식 재배

1. 단식 재배가 형질도입 24-48 시간 전에 이루어 지도록하십시오.
   1. 25^cm2 배양 플라스크에서 ∼5,000 PSCs를 RPMI 및 10% 소 태아 혈청(FBS)으로 배양한다.
   2. 플라스크를 사용할 때까지 CO2 인큐베이터(37°C, 5%_CO2)로 옮긴다.

4. 바이러스 생산 및 준비를위한 세포 배양

참고: 인간 배아 신장 293T (HEK293T) 세포는 Kerman University of Medical Sciences의 병리학 및 줄기 세포 연구 센터로부터 벡터 생산을 위해 수득되었다.

1. 5 × 10개의^5개의 HEK293T 세포를 10% FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 있는 DMEM 5 mL를 함유하는^{25 cm2} 플라스크로 옮깁니다.
2. HEK293T 세포를 5% CO2에서 37°C에서 인큐베이션하고_, 이를 매 48시간마다 완전 배지에 계대시킨다. 마지막으로, 형질도입(²⁰)을 위해 저역 HEK293T 세포를 사용한다.

5. 3세대 렌티바이러스 벡터를 이용한 바이러스의 제조 및 제조

참고: 렌티바이러스 벡터 pCDH513b(전사 벡터) 및 PLPII, PLPI 및 PMD2G(헬퍼 벡터)를 사용하여 GFP 리포터 유전자를 발현하였다. 재료 표 및 보충 그림 S1을 참조하십시오.

1. 1일차:
   1. HEK293T 세포²¹을 6-웰 배양 플레이트에서 트립신화한 후, 시드 7 × 10% FBS를 함유하는 신선한 항생제 프리 DMEM으로 웰당 10개의⁴개 세포를 수득하였다.
   2. 인산칼슘 방법에 의한 형질도입을 위해 50%-60% 컨플루언시에서 세포를 사용한다.
2. 2일차:
   1. 실험 2-3 h 전에 세포 배양 배지를 2% FBS를 함유하는 신선한 항생제 무함유 DMEM으로 교체한다.
   2. 1.5mL 튜브에서 7μg/μL pCDH513b(전사 벡터), 4μg/μL PLPII, 4μg/μL PLPI 및 2μg/μL PMD2G(헬퍼 벡터)를 포함한 3세대 렌티바이러스 플라스미드를 혼합합니다.
   3. 상기 혼합물에 HEPES 완충액 (0.28 M NaCl, 0.05 M HEPES, 및 1.5 mM_Na2HPO4; 최적 pH 범위, 7.00-7.28)을 422 μL의 부피로 첨가한다.
   4. 16 μL의 1% Tris-EDTA (TE) 완충액을 상기 혼합물에 첨가한다.
   5. 62 μL의 2.5 mM 염화칼슘을 튜브에 첨가하고 잘 섞는다.
   6. 500 μL의 2x HEPES-완충 식염수 (HBS)를 파스퇴르 피펫을 사용하여 1-2 분 이내에 적하하여 혼합물에 첨가한다. 반불투명 용액이 얻어질 때까지 부드럽게 혼합하고, 혼합물을 실온에서 20분 동안 인큐베이션한다.
   7. 혼합물을 각 접시에 천천히 넣고 느린 원형 동작으로 분배하십시오.
   8. 플레이트를 5%_CO2 인큐베이터에서 37°C에서 인큐베이션하고, 4-6시간 후에 배지를 10% FBS를 함유하는 항생제가 없는 DMEM으로 교체한다.
3. 3일차:
   1. 거꾸로 형광 현미경을 사용하여 성공적인 일시적 형질도입 및 세포 생존율을 확인한다.
4. 4일차:
   1. 배양 배지로부터 바이러스를 수확하여 각 웰의 상청액을 수집하고, 이를 사용 전까지 -70°C에 보관한다.
      참고: 수확된 렌티바이러스는 정확한 트랜스펙션⁽²²)을 위해 농축되고 적정될 수 있다.

6. 바이러스와 함께 E. granulosus 의 다른 단계의 일시적인 형질도입

1. 1일차:
   1. 유전자 전달을 위해 12-웰 배양 플레이트를 사용하십시오. 5 × 10^3-5 × 10^4개의 HEK293T 세포를 내부 참조로서 완전한 DMEM 배지와 함께 삼중으로 배양한다.
   2. RPMI와 10 % FBS에서 150 개의 신선한 PSC를 세 배로 배양하십시오.
   3. 10% 열 불활성화 FBS를 함유하는 DMEM에서 삼중으로 30개의 스트로빌화된 웜을 배양한다.
      참고: 모든 형질도입 배지는 항생제가 없어야 합니다. 이 과정에서 HEK293T 세포, PSC 및 스트로빌화 된 웜에 대해 세 개의 처리되지 않은 대조군 웰을 유지하십시오.
   4. HEK293T 세포와 웜의 여러 단계를 형질감염시키기 위해 1 × 10⁶ 바이러스와 4 μg/mL 형질감염 시약 ( 물질 표 참조)을 혼합하여 준비하십시오.
   5. 혼합물을 각 접시에 천천히 넣고 느린 원형 동작으로 분배하십시오. 플레이트를 CO2 인큐베이터 (37°C, 5%_CO2)에서 4-6 시간 동안 인큐베이션한다. 형질감염 시약의 독성 영향을 최소화하기 위해 각 샘플에 대한 배지를 동일한 완전한 배양 배지로 교체한다.
2. 2일차:
   1. HEK293T 세포, PSC 및 스트로빌화된 웜에 대한 일시적 형질도입의 효율을 높이려면 6.1.4-6.1.5단계를 반복한다.
   2. 모든 플레이트를 세포 배지의 유형에 따라 동일한 배양 조건으로_CO2 인큐베이터에서 24-48시간 동안 인큐베이션한다.
3. 3일차:
   1. 형질도입이 형광 현미경을 사용하여 성공적인지 여부를 확인한다.
      참고: 유전자 전달 절차에서 PCR/qPCR^20,23 또는 웨스턴 블롯팅 ²⁴ 기술과 같은 추가 확인 검정을 사용하는 것을 고려하십시오.

여기에서, 우리는 세 번째 세대 렌티바이러스 벡터를 사용하여 E. granulosus에서 신속하고 효율적인 일시적 형질도입 기술을 기술한다. PSCs를 이phasic 배지에서 배양하여 앞서 기술한 바와 같이 스트로빌화된 웜을 수득하였다(25,26). Protoscolece는 시험관 내에서 6 주 후에 스트로빌 화 된 웜으로 발전합니다. E. granulosus의 상이한 단계는 질내 PSC (도 2A), 질내 PSC (도 2B), 및 첫 번째 및 세 번째 proglottid 형성 (도 2C-E)을 갖는 스트로빌화된 웜을 포함하는 이phasic 배양 배지에서 관찰되었다. 프로토콜렉세스 및 단식 및 이phasic 배양물로부터 수득된 스트로빌화된 웜을 각각 GFP 발현 렌티바이러스로 형질감염시켰다(도 3). 자기 형광 효과를 피하기 위해, 현미경 관찰은 샘플의 세 그룹 모두에서 배경 형광과 비교되었고, 이 배경 수준 이상의 모든 샘플은 형질감염된 것으로 간주되었다.

우리는 현장 조명을 조정하고 셔터를 낮추어 각 처리에 대한 제어 샘플에서 가능한 자기 형광 방출을 방지했습니다. 이어서, 렌티바이러스 벡터-처리된 샘플을 검사하였고, 여기서 검정장에 대한 녹색 발광은 효과적인 일시적 형질도입으로 간주되었다. HEK293T 세포-일시적 형질도입 과정 대조군-발현된 GFP를 명확하게 발현시킨다 (도 3D). 성인 웜은 tegumental 층에서 GFP를 가장 뚜렷하게 표현했습니다 (그림 3F); 그러나, PSCs는 48 h 후에 GFP 발현의 다소 더 낮은 수준을 입증하였다. PSC 주변의 일부 낭종 유체 잔류 물 및 / 또는 발아층 파편은 형질 감염된 샘플의 배경에서 약간의 형광을 일으켰습니다. HEK293T 세포 및 스트로빌화된 웜에서의 형광의 강도는 24 h 및 48 h 후에 증가하였다 (PSCs에서 경미한 변화가 관찰되었다).

그림 1: 연구 프로토콜의 개략적인 프레젠테이션. 약어: PSC = protoscoleces. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 : 이phasic 배양 배지에서 Echinococcus granulosus의 다른 단계. (A) 질내 PSC, (B) 질내 PSC, (C, D) 스트로빌 화 과정에서 웜, (E) 세 번째 프로글로티드 형성을 가진 스트로빌 화 웜, (F) 배양 배지에서 스트로빌레이션의 다른 단계의 웜. 배율 막대 = 200μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3: 광과 형광 현미경에서 Echinococcus granulosus 및 대조군 세포주의 상이한 단계의 일시적인 형질도입 . (A,D) 형질도입 과정 대조군으로서의 HEK293T 세포, (B, E) 프로토스콜렉세스, 및 (C, F) 스트로빌화된 웜. (G, H, I) 혼합 빛과 꽃차례 현미경. 배율 막대 = 50μm, 100μm 및 500μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 S1: pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro cDNA 클로닝 및 발현 벡터의 맵. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.