방법 논문

유세포 분석을 사용한 mTORC1-Hyperactive Cells의 Macropinocytosis에 대한 정량적 평가

DOI:

10.3791/62793

⸱

2021년 8월 2일

 , 
1Pulmonary and Critical Care Medicine, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, 2Metcalf Science Center, Chemistry Department, Boston University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 mTORC1 과활성 세포에 의한 영양소(탄수화물 및 단백질)의 거대세포세포 흡수를 평가하기 위한 실험 도구를 제공합니다. 형광 표지된 덱스트란 및 소 혈청 알부민(BSA)의 흡수를 정량화하기 위한 자세한 단계가 설명되어 있습니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

마크로피노사이토시스(Macropinocytosis)는 단백질과 지질을 포함한 세포 외 물질을 흡수할 수 있도록 고도로 보존된 액틴 의존성 내포세포 과정입니다. 증식하는 세포에서 거대세포증가증은 중요한 거대분자 구성 요소로 처리되는 리소좀에 세포 외 영양소를 전달할 수 있습니다. 최근 연구에서는 유방암, 대장암, 췌장암을 포함한 여러 암이 대식세포증에 의존하는 것을 강조하고 있습니다. Ras 돌연변이는 거대세포증가(macropinocytosis) 시작의 배후에 있는 동인으로 생각되며, mTORC1 신호 경로를 통해 세포 동화 과정의 활성화로 이어집니다. 흥미롭게도, mTORC1은 Ras와 독립적으로 거대세포작용에 의해 활성화될 수도 있습니다. 그러므로, 거대세포이입은 치료적으로 영양분에 대한 접근을 제한함으로써 거대세포형성 종양을 표적으로 삼는 데 활용될 수 있는 대사 취약성을 나타냅니다.

결절성 경화증 복합체(TSC) 및 림프관평활근종증(LAM)에서 mTORC1-과활성화는 거대세포증가증과 대사 재프로그래밍을 향상시킵니다. 여기에서는 포유류 세포의 거대세포작용(macropinocytosis)을 정량적으로 평가하기 위한 유세포 분석 기반 프로토콜에 대해 설명합니다. TSC2 결핍 MEF가 사용되며, 이는 mTORC1의 비정상적인 활성화를 나타내며 TSC2 발현 세포에 비해 거대세포증가증이 증가한 것으로 나타났습니다. 거대세포작용(macropinocytosis)의 약리학적 억제제로 처리된 세포는 유세포분석법으로 분석된 형광 표지된 라이신 고정성, 70kDa 덱스트란 또는 형광 표지된 소 혈청 알부민(BSA)으로 배양됩니다. 현재까지 in vitro 및 in vivo에서 종양 세포의 거대세포증가증을 정량적으로 평가하기 위해 강력한 이미지 기반 기술이 개발되었습니다. 이 분석은 여러 실험 조건에서 거대세포작용에 대한 정량적 평가를 제공하고 기존 이미지 기반 기술을 보완합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macropinocytosis는 세포외 물질의 대량 흡수에 전념하는 내세포 과정으로, 원형질막으로 재활용되거나 리소좀과 융합하여 내부화된 화물을 분해하기 위해 거대피노솜을 형성합니다 1,2. 화물 흡수는 비선택적이지만, 거대세포작용(macropinocytosis)은 Rab GTPases 및 membrane phospholipids 3,4에 의해 엄격하게 조절되는 다단계 과정입니다. 특히 암세포는 단백질, 다당류 및 지질을 포함한 세포 외 영양소를 내재화하기 위해 거대세포증가증(macropinocytosis)을 사용합니다. 암세포의 마크로피노사이토시스(Macropinocytosis)는 특히 영양 스트레스 조건에서 증식을 지원하는 메커니즘으로 Ras 또는 v-Src의 다운스트림에 있는 종양 유전자에 의해 활성화됩니다 5,6. 그러므로, 거대세포작용(macropinocytosis)은 영양분 흡수 경로를 파괴하여 암세포를 표적으로 하는 새로운 치료법을 제시합니다 7,8.

결절성 경화증 복합체(TSC) 및 림프관평활근종증(LAM)에서 TSC1 또는 TSC2의 기능 돌연변이 손실은 라파마이신 복합체 1(mTORC1)9의 포유류/기계론적 표적의 과활성화로 이어집니다. 비정상적인 mTORC1 활성화는 포도당 및 글루타민 흡수 및 활용, 향상된 핵산 합성, 지질 합성 및 자가포식을 포함한 광범위한 대사 재프로그래밍을 유도하는 것으로 알려져 있습니다10,11. 이러한 증가된 동화 수요를 보상하기 위해 mTORC1-hyperactive 세포는 거대세포작용(macropinocytosis)을 통해 외인성 영양소의 흡수를 증가시키고 내재화된 화물의 리소좀 분해를 향상시킵니다12. 최근 연구에서는 디아실글리세롤 키나아제 알파(DGKA) 억제제인 리탄세린(ritanserin)이 TSC2 결핍 세포의 증식을 선택적으로 억제하는 약제임을 확인했다13. DGKA는 디아실글리세롤을 포스파티드산(PA)으로 대사하는 지질 키나아제입니다14. PA는 세포막 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 하는 중요한 두 번째 메신저 분자입니다. 놀랍게도, 리탄세린은 TSC2 결핍 세포에서 인지질 대사를 재프로그래밍하여 거대세포작용(macropinocytosis)을 강력하게 억제합니다. 따라서 TSC2 결핍 세포에서 거대세포작용의 영양 흡수 경로를 표적으로 삼는 것은 TSC 및 LAM에서 새로운 치료 접근법을 제공할 수 있습니다.

in vitro 및 in vivo에서 macropinocytic upupulate를 정량화하면 macropinosome 형성 조절에 대한 중요한 통찰력을 제공하고 분자 메커니즘의 발견을 가속화하는 동시에 새로운 치료 접근법을 식별할 수 있습니다 2,6. 현재까지 in vitro 및 in vivo 모두에서 형광 덱스트란의 거대세포세포 흡수를 적절하게 정량화하는 여러 방법론이 개발되었습니다 2,15. 여기에서는 mTORC1-과활성 세포에서 내재화된 덱스트란 및 알부민의 양을 직접 평가하기 위한 유세포 분석 기반 접근법에 대해 설명합니다(그림 1). 이 방법은 여러 실험 조건을 병렬로 분석하는 데 사용할 수 있으며 기존 이미지 기반 접근 방식을 보완합니다.

figure-introduction-1
그림 1. 포유류 세포의 거대세포작용(macropinocytosis) 평가를 위한 워크플로우. 세포는 6웰 플레이트에 파종되고 이후에 관심 화합물로 처리됩니다. 형광 덱스트란 또는 BSA를 60분 동안 첨가하고 얼음처럼 차가운 PBS로 세척하여 흡수를 억제합니다. 세포는 파라포름알데히드를 사용하여 고정하고 형광 강도는 유세포 분석으로 정량화합니다. 세포가 게이트되고 적절한 소프트웨어로 데이터가 분석됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 세포 처리

1일차

  1. 10% FBS가 보충된 DMEM을 사용하여 6웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에서 TSC2 결핍 및 TSC2 발현 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 3회 시드합니다. 세포는 3일차까지 60-70% 융합되어야 합니다.
    1. FITC-덱스트란 또는 TMR-BSA로 염색되지 않는 각 약물 상태에 대한 추가 대조군 웰을 파종합니다.

2일차

  1. 배지를 조심스럽게 흡인하고 실온에서 PBS로 세포를 두 번 헹굽니다.
    1. 비히클(DMSO), 100μM의 포스파티드산(PA), 25μM의 EIPA, 10μM의 리탄세린 또는 PA와 리탄세린의 조합으로 세포를 치료합니다. 1% FBS가 보충된 DMEM을 사용하십시오.
      참고: DMSO 부피는 처리 조건에 사용되는 용매의 최대 부피와 같아야 합니다. 예를 들어, 10μL의 EIPA를 사용하는 경우 차량 조건에서 DMSO의 부피도 10μL가 되어야 합니다.

3일차

  1. 16시간 전처리 후 배지를 위에서 언급한 약물과 0.5mg/mL의 FITC-Dextran 또는 0.5mg/mL의 TMR-BSA를 함유한 무혈청 DMEM으로 교체합니다. 37°C/5% CO2 세포 배양 인큐베이터에서 60분 동안 세포를 배양합니다.
    참고: 형광단의 광표백을 최소화하기 위해 FITC-Dextran 및 TMR-BSA 튜브를 알루미늄 호일로 감싸고 조명을 끈 상태에서 세포 배양 캐비닛에서 실험을 수행해야 합니다.
  2. 배지를 흡입하고 얼음처럼 차가운 PBS로 두 번 세척합니다.
    1. 500μL의 트립신을 사용하여 세포를 분리합니다. 37°C/5% CO2 세포 배양 인큐베이터에 세포를 2-3분 동안 넣습니다.
      참고: 명시야 현미경으로 관찰하여 모든 세포가 분리되었는지 확인하십시오.
    2. 매번 깨끗한 피펫 팁을 사용하여 1% FBS가 보충된 DMEM을 얼음 위에서 사용하여 1.5mL 튜브에 세포를 수집합니다.
    3. 425 x g 에서 4°C에서 2분 동안 원심분리에 의한 펠렛 셀.
    4. 상층액을 흡인합니다.
  3. 50μL의 2% 파라포름알데히드를 사용하여 세포 펠렛을 재현탁합니다.
    주의: 파라포름알데히드는 독성이 강하므로 적절한 흄 후드 아래에서 취급해야 합니다. 포름알데히드가 함유된 폐기물은 기관 지침에 따라 처리해야 합니다.
    1. 실온에서 10분 동안 세포를 배양합니다.
    2. 각 튜브에 얼음처럼 차가운 PBS 1mL를 추가하고 세포 펠렛을 부드럽게 재현탁합니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
  4. 425 x g 에서 4°C에서 2분 동안 원심분리 셀.
  5. 상층액을 흡인합니다.
    1. 세포 펠릿을 300μL의 얼음처럼 차가운 PBS에 재현탁합니다.
    2. 얼음 위의 적절한 FACS 튜브로 세포를 전달합니다.
    3. 유세포 분석을 진행합니다.

2. 유세포 분석

  1. FACS 샘플 홀더에 삽입하기 전에 세포를 잠시 와류로 회전시킵니다.
  2. 저속 흐름을 사용하여 그림 2A에서 볼 수 있듯이 적절한 레이저 출력을 사용하여 염색되지 않은 각 샘플(음성 대조군)에서 살아있는 세포를 게이트합니다. 이 단계는 기기마다 다르며 각 실험에 맞게 최적화해야 합니다. 전방 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC) 모두에 대한 전력을 조정하여 살아있는 세포가 파편 또는 세포 클러스터와 구별되도록 합니다.
  3. 자동 게이트 기능을 사용하여 세포 파편과 세포 클러스터를 피하면서 각 샘플에 대한 살아있는 세포 집단을 선택합니다.
    참고: 모든 세포 이벤트(게이팅에 관계없이)는 궁극적으로 세포분석기에 의해 기록됩니다. 따라서 이 단계에서 게이트를 선택하는 것은 중요하지 않습니다.
  4. 적절한 녹색 또는 빨간색 레이저를 사용하여 각 샘플의 형광 강도를 기록합니다.

3. 유세포 분석

  1. 전방 및 측면 산란 매개변수를 사용하는 게이트 셀. 모든 샘플에 동일한 게이트를 적용합니다.
  2. 그림 2B와 같이 각 샘플의 형광에 대한 히스토그램을 생성합니다.
  3. 각 cell gate 내에서 모든 샘플에 대한 평균/중앙값 형광 강도를 계산합니다.
  4. 적절한 통계 분석을 위해 데이터를 내보냅니다.
    참고: 데이터 분석 중에 각 샘플의 평균/중앙값 형광 강도는 염색되지 않은 샘플 값을 빼서 정규화해야 합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

리탄세린은 TSC2 결핍 세포에서 거대세포작용(macropinocytosis)을 억제합니다.
우리는 이전에 TSC2 발현 세포에 비해 TSC2 결핍 세포에서 영양소의 거대세포세포 흡수가 3배 증가한다는 것을 보여주었습니다16. TSC 및 LAM에서 마크로피노사이토시스는 디아실글리세롤 키나아제 알파(DGKA)를 통해 매개됩니다. DGKA의 대사 생성물은 세포막의 중요한 구성 요소인 인산(PA)입니다. 따라서, 우리는 리탄세린에 의한 DGKA의 억제가 TSC2 결핍 세포의 거대세포세포 소포 이동에 영향을 미칠 수 있다는 가설을 세웠다. 외인성 영양소의 거대세포세포 흡수에 대한 리탄세린의 역할을 확인하기 위해 FITC-덱스트란(0.5mg/mL, 70kDa) 또는 TMR-BSA(0.5mg/mL)를 사용한 흡수 분석을 수행했습니다. 7...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 유세포 분석을 사용하여 거대세포작용(macropinocytosis)을 평가하기 위한 정량적 접근법에 대해 설명합니다. 이 방법은 형광 표지된 거대피세포(macropinocytic) 화물 덱스트란 및 알부민을 정확하고 신속하게 측정합니다. 이전 연구에서는 컨포칼 현미경 접근법을 사용하여 암세포의 거대세포세포 지수를 신중하게 특성화했습니다15,20. 이러한 방법은 거대피노좀의 내재화, 크기 및 공간 분포를 정확하게 정량화하지만 각 실험 조건에 대해 여러 이미지를 분석해야 합니다. 대조적으로, 여기에 설명된 기술을 사용하면 여러 실험 조건과 시점을 동시에 평가할 수 있습니다. 또한 유세포 분석 접근법은 내재화된 덱스트란의 절대 정량화를 제공하며, 이는 현재의 현미경 기술에 유리합니다.

거대세포작용(macropi...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LAM 재단 경력 개발 상. 그림 1 은 BioRender.com 를 사용하여 만든 것입니다. 비판적 읽기는 Hilaire C. Lam이 수행했습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEMGibco11965-092성장 매체
EIPA (아밀로라이드)Sigma AldrichA3085Macropinocytosis 억제제
FBSR & D SystemsS11150소 태아 혈청
FITC-덱스트란인비트로겐D1822형광 다당류(70kDa)
파라폴마데히드피어스28906고정제
PBSGibco10010-023인산염 완충액 식염
수 페니실린/스트렙토마이신시그마 알드리치P4458-100ML세포 배양 항생제
포스파티드산Avanti840101P난자
RitanserinTocris1955DGKA 억제제
TMR-BSAInvitrogenA23016형광 알부민
TrypsinSigma Aldrich25300-054해리제

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yoshida, S., Pacitto, R., Inoki, K., Swanson, J. Macropinocytosis, mTORC1 and cellular growth control. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (7), 1227-1239 (2018).
  2. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
  3. Maxson, M. E., Sarantis, H., Volchuk, A., Brumell, J. H., Grinstein, S. Rab5 regulates macropinocytosis by recruiting the inositol 5-phosphatases OCRL/Inpp5b that hydrolyze PtdIns(4,5)P2. Journal of Cell Science. , (2021).
  4. Bohdanowicz, M., et al. Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes. Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1712(2013).
  5. Ramirez, C., Hauser, A. D., Vucic, E. A., Bar-Sagi, D. Plasma membrane V-ATPase controls oncogenic RAS-induced macropinocytosis. Nature. 576 (7787), 477-481 (2019).
  6. Kamphorst, J. J., et al. Human pancreatic cancer tumors are nutrient poor and tumor cells actively scavenge extracellular protein. Cancer Research. 75 (3), 544-553 (2015).
  7. Kim, S. M., et al. Targeting cancer metabolism by simultaneously disrupting parallel nutrient access pathways. Journal of Clinical Investigation. 126 (11), 4088-4102 (2016).
  8. Selwan, E. M., Finicle, B. T., Kim, S. M., Edinger, A. L. Attacking the supply wagons to starve cancer cells to death. FEBS Letters. 590 (7), 885-907 (2016).
  9. Henske, E. P., Jozwiak, S., Kingswood, J. C., Sampson, J. R., Thiele, E. A. Tuberous sclerosis complex. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16035(2016).
  10. Duvel, K., et al. Activation of a metabolic gene regulatory network downstream of mTOR complex 1. Molecular Cell. 39 (2), 171-183 (2010).
  11. Sancak, Y., et al. The Rag GTPases bind raptor and mediate amino acid signaling to mTORC1. Science. 320 (5882), 1496-1501 (2008).
  12. Choo, A. Y., et al. Glucose addiction of TSC null cells is caused by failed mTORC1-dependent balancing of metabolic demand with supply. Molecular Cell. 38 (4), 487-499 (2010).
  13. Kovalenko, A., et al. Therapeutic targeting of DGKA-mediated macropinocytosis leads to phospholipid reprogramming in Tuberous Sclerosis Complex. Cancer Research. , (2021).
  14. Swanson, J. A. Phorbol esters stimulate macropinocytosis and solute flow through macrophages. Journal of Cell Science. 94, Pt 1 135-142 (1989).
  15. Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).
  16. Filippakis, H., et al. Vps34-mediated macropinocytosis in Tuberous Sclerosis Complex 2-deficient cells supports tumorigenesis. Scientific Reports. 8 (1), 14161(2018).
  17. Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biol Int. 39 (5), 531-539 (2015).
  18. Jachimska, B., Wasilewska, M., Adamczyk, Z. Characterization of globular protein solutions by dynamic light scattering, electrophoretic mobility, and viscosity measurements. Langmuir. 24 (13), 6866-6872 (2008).
  19. Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation. Biophysical Journal. 87 (6), 4259-4270 (2004).
  20. Lee, S. W., Alas, B., Commisso, C. Detection and Quantification of Macropinosomes in Pancreatic Tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, 171-181 (2019).
  21. Williams, T. D., Kay, R. R. The physiological regulation of macropinocytosis during Dictyostelium growth and development. Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).
  22. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
  23. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (7), 3327-3331 (1978).
  24. Murphy, R. F. Analysis and isolation of endocytic vesicles by flow cytometry and sorting: demonstration of three kinetically distinct compartments involved in fluid-phase endocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (24), 8523-8526 (1985).
  25. Williams, T., Kay, R. R. High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (139), e58434(2018).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

TSC2 MEFRas
동영상 곧 제공

관련 논문