Method Article

미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)을 이용한 자동화된 미생물 배양 및 적응 진화

DOI:

10.3791/62800

⸱

February 18th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Institute of Biochemical Engineering, Tsinghua University, 2Key Laboratory of Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Tsinghua University, 3Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., 4Biochemical Engineering Research Group, School of Chemical Engineering and Technology, Xi’an Jiaotong University, 5Center for Synthetic & Systems Biology, Tsinghua University, 6School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)을 사용하여 자동화된 미생물 배양 및 적응 진화를 수행하는 방법을 설명합니다. MMC는 미생물을 자동으로 지속적으로 재배 및 하위 재배 할 수 있으며 상대적으로 높은 처리량과 우수한 병렬화로 온라인으로 성장을 모니터링하여 노동 및 시약 소비를 줄일 수 있습니다.

Abstract

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기존의 미생물 재배 방법은 일반적으로 번거로운 작업, 낮은 처리량, 낮은 효율 및 노동 및 시약의 큰 소비를 가지고 있습니다. 더욱이, 최근 개발된 마이크로플레이트 기반의 고처리량 재배 방법은 낮은 용존산소, 불량한 혼합물, 심한 증발 및 열 효과로 인해 미생물 성장 상태 및 실험 병렬화가 불량하다. 작은 부피, 높은 처리량 및 강력한 제어 가능성과 같은 마이크로 액적의 많은 장점으로 인해 액적 기반 미세 유체 기술은 이러한 문제를 극복 할 수 있으며, 이는 고처리량 미생물 재배, 스크리닝 및 진화에 대한 많은 종류의 연구에 사용되었습니다. 그러나 대부분의 선행 연구는 실험실 건설 및 적용 단계에 남아 있습니다. 높은 운영 요구 사항, 높은 건설 어려움 및 자동화 된 통합 기술의 부족과 같은 몇 가지 주요 문제는 미생물 연구에서 액적 미세 유체 기술의 광범위한 적용을 제한합니다. 여기에서는 액적 미세유체 기술을 기반으로 자동화된 미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)이 성공적으로 개발되어 미생물 액적 재배 과정에서 필요한 접종, 재배, 온라인 모니터링, 하위 재배, 분류 및 샘플링과 같은 기능의 통합을 달성했습니다. 본 프로토콜에서는 야생형 대장 균(E. coli) MG1655 및 메탄올-필수 대장균 균주(MeSV2.2)를 예로 들어 MMC를 사용하여 자동화되고 상대적으로 높은 처리량의 미생물 배양 및 적응 진화를 수행하는 방법을 상세히 소개하였다. 이 방법은 작동하기 쉽고 노동력과 시약을 덜 소비하며 실험 처리량이 높고 데이터 병렬성이 우수하여 기존 재배 방법에 비해 큰 장점이 있습니다. 과학 연구자가 관련 미생물 연구를 수행 할 수있는 저렴한 비용, 작동 친화적이며 결과 신뢰할 수있는 실험 플랫폼을 제공합니다.

Introduction

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미생물 재배는 미생물 과학 연구 및 산업 응용을위한 중요한 토대 이며, 미생물 1,2,3의 격리, 식별, 재구성, 스크리닝 및 진화에 널리 사용됩니다. 기존의 미생물 재배 방법은 주로 시험관, 진탕 플라스크 및 고체 플레이트를 재배 용기로 사용하며 진탕 배양기, 분광 광도계, 마이크로 플레이트 판독기 및 미생물 재배, 검출 및 스크리닝을위한 기타 장비와 결합됩니다. 그러나 이러한 방법에는 번거로운 작업, 낮은 처리량, 낮은 효율 및 많은 노동 및 시약 소비와 같은 많은 문제가 있습니다. 최근 몇 년 동안 개발 된 고처리량 재배 방법은 주로 마이크로 플레이트를 기반으로합니다. 그러나 마이크로플레이트는 낮은 수준의 용존 산소, 열악한 혼합 특성, 심한 증발 및 열 효과를 가지며, 이는 종종 불량 한 성장 상태 및 미생물 4,5,6,7의 실험 병렬화로 이어진다; 반면에 자동 재배 및 공정 검출

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Protocol

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1. 계기 및 소프트웨어 설치

  1. 깨끗하고 멸균 된 환경 (예 : 깨끗한 벤치)을 MMC를위한 전용 영구 공간으로 선택하십시오. MMC를 공간에 꾸준히 설치하십시오.
    참고: MMC를 강한 전기장, 자기장 및 강한 방열원의 간섭으로부터 멀리하십시오. 심한 진동이 광학 감지 부품에 영향을 미치지 않도록 하십시오. MMC에 AC220 V, 50 HZ의 전원 공급 장치를 제공하십시오. MMC에 대한 자세한 내용은 자료 표 및 MMC16 웹 사이트를 참조하십시오.
  2. MMC.zip 파일에서 작업 소프트웨어를 설치합니다.
    참고: MMC.zip 파일에 대해서는 작성자에게 문의하십시오.
    1. 전용 폴더를 만들고 zip 파일을 저장하십시오.
    2. 다른 전용 폴더를 "설치 디렉토리"로 만듭니다. MMC.zip의 압축을 풀고 새 폴더에 파일을 저장합니다.
      참고: 컴퓨터 구성이 가장 적합합니다: (1) Windows 7 64비트 운영 체제 이상; (2) CPU: i5 이상; (3) 메모리: 4GB 이상; (4) 하드 디스크: 300GB 이상 (회전 속도가 7200rpm 이상 또는 솔리드 스테이트 디스크).

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Results

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이 프로토콜은 대장균 MG1655 및 MeSV2.2 균주를 예로 사용하여 MMC에서 자동화되고 상대적으로 높은 처리량 전략을 갖는 미생물 배양 및 메탄올 필수 적응 진화를 입증합니다. 성장 곡선 측정은 주로 미생물 재배를 특성화하기 위해 사용되었다. 적응 진화는 자동화된 연속 서브 재배에 의해 수행되었고, 각각의 서브 재배 동안 선택적 압력으로서 고농도의 메탄올을 첨가하였다. 적응 진화가 실현되었는지 여부는 각 서브 재배 기간 동안 액적의 최대 OD 값의 변동 추세를 통해 추정되었다. MMC의 조정 가능한 파라미터 및 정확도 파라미터는 표 2에 나타내었다.

성장 곡선 측정 결과
배양 과정 중에 검출된 15개의 액적의OD600 값을 약 20 h 동안 배양한 후에 MMC로부터 내보냈다(도 5A). 검.......

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Discussion

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이 프로토콜은 미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)을 사용하여 자동화된 미생물 배양 및 장기 적응 진화를 수행하는 방법을 제시합니다. MMC는 소형화, 자동화 및 고처리량 미생물 배양 시스템입니다. 기존의 미생물 고처리량 배양 방법 및 장비와 비교하여 MMC는 낮은 노동력 및 시약 소비, 간단한 조작, 온라인 검출 (OD 및 형광), 고분해능 데이터 수집 및 우수한 병렬화와 같은 많은 장점을 가지고 있습니다. MMC는 또한 일반적으로 pL 및 nL 액적을 사용하는 기존의 액적 미세 유체 기술과 다른 몇 가지 특별한 장점을 가지고 있습니다. pL 및 nL 물방울을 사용한 이전에 보고된 대부분의 시스템은 재배 성능이 좋지 않으며 검출 가능한 파라미터가 거의 없습니다(일반적으로 형광만 해당)18,19,20,21.<.......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 중국의 국가 핵심 연구 개발 프로그램 (2018YFA0901500), 중국 국립 자연 과학 재단 (21627812)의 국가 핵심 과학 기기 및 장비 프로젝트 및 칭화 대학 이니셔티브 과학 연구 프로그램 (20161080108)의 지원을 받았다. 또한 메탄올 필수 대장균 균주 버전 2.2(MeSV2.2)의 제공을 위해 Julia A. Vorholt 교수(미생물학 연구소, 생물학과, 취리히 취리히, 취리히 8093, 스위스)에게 감사드립니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 &무; m PVDF 필터 멤브레인Merck Millipore Ltd.SLGPR33RBMMC 오일
4 °를 살균하십시오. C 냉장고HaierBCD-289BSW시약 보관용
AgarBecton, Dickinson and Company214010솔리드 플레이트 준비용
CaCl2· 2H2OSinopharm 화학 시약 베이징 Co., Ltd.20011160MeSV2.2를 위한 특별한 매체의 분대.
클린 벤치Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.DL-CJ-INDII무균 작동 및 UV 살균
CoCl2·용; 6H2OSinopharm 화학 시약 베이징 Co., 주식 회사.10007216MeSV2.2용 특수 매체의 구성 요소입니다.
컴퓨터레노버E450소프트웨어 설치 및 MMC 제어
항온 인큐베이터상하이 qixin 과학 기기 co., LTDLRH 250사용하여 미생물 배<
sub>4· 5H2OSinopharm 화학 시약 베이징 Co., 주식10008218MeSV2.2를 위한 특별한 매체의 분대.
전자 저울OHAUSAR 3130시약 계량용
EP 튜브Thermo Fisher1.5 mL액적 수집용
FeCl3· 6H2OSinopharm 화학 시약 베이징 Co., 주식 회사.10011928MeSV2.2를 위한 특별한 매체의 분대.
동결 튜브Thermo Fisher2.0 mL균주 보존용
글루코네이트 Sigma-AldrichS2054MeSV2.2용 특수 매체의 구성 요소.
글리세롤GENERAL-REAGENTG66258A스트레인 보존용
고압 증기 살균 포트SANYO 전기MLS3020오토클레이브 살균용
이소프로필-&베타;-d-thiogalactopyranoside (IPTG)Biotopped420322MeSV2.2용 특수 매체의 구성 요소.
Kanamycin sulfateSolarbioK8020MeSV2.2 용 특수 매체의 구성 요소.
KH2PO4MACKLINP815661MeSV2.2용 특수 매체의 구성 요소입니다.
메탄올MACKLINM813895MeSV2.2를 위한 특별한 매체의 분대.
MgSO4· 7H2OBIOBYING1305715 MeSV2.2용 특수 매체의 구성 요소입니다.
미생물 미세방울 배양 시스템(MMC)Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.  MMC-I성장 곡선 결정 및 적응 진화를 수행합니다. http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Microfluidic chipLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.를 참조하십시오.MMC-ALE-OD다양한 액적 작업용. http://www.tmaxtree.com/en/ MMC
오일Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.를 참조하십시오.MMC-M/S-OD액적 미세유체공학을 위한 유상. http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2Sinopharm 화학 시약 Beijing Co., Ltd.를 참조하십시오.20026118MeSV2.2를 위한 특별한 매체의 분대.
NaClGENERAL-REAGENTG81793JLB 매체의 구성 요소
Na2HPO4· 12H2O일반 시약MeSV2.2용 특수 매체의 구성 요소.
NH4ClSinopharm 화학 시약 베이징 Co., Ltd.10001518MeSV2.2를 위한 특별한 매체의 분대.
페트리 접시Corning Incorporated90 mm고체 매체
피펫Eppendorf2.5 &mu의 준비를 위해; L, 10 &뮤; L, 100μ L, 1000μ L액체 취급
용 퀵 커넥터 ALuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.&엠대시;각 조인트의 연결용. http://www.tmaxtree.com/en/
시약 병Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.를 참조하십시오.MMC-PCB박테리아 용액 및 시약의 샘플링 및 저장. http://www.tmaxtree.com/en/
쉐이크 플라스크Union-Biotech50mL미생물 배양
쉐이킹 인큐베이터Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.를 참조하십시오.SKY-210 2B쉐이크 플라스크
스트렙토 마이신 설페이SolarbioS8290MeSV2.2 용 특수 매체의 구성 요소에서
주사기JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD10 mL액체를 뽑아 시약병에 주입
주사기 바늘OUBEL Hardware Store22G내경은 0.41mm, 외경은 0.71mm입니다.
트립톤옥소이드 주식회사LP0042LB 매체
초저온 냉장고SANYO 초저MDF-U4086S변형률 보존 (-80 > C)
UV– Vis 분광 광도계General Electric CompanyUltrospec 3100 proOD 값 측정용
비타민 B1SolarbioSV8080MeSV2.2용 특수 매체 구성 요소.
효모 추출물Oxoid Ltd.LP0021LB 매체
ZnSO4·의 구성 요소; 7H2OSinopharm 화학 시약 베이징 Co., 주식10024018MeSV2.2를 위한 특별한 매체의 분대.
고체 매체 CuSO를 회사 G10267B 용 트 미생물 배양을 위해.의 구성 요소 회사

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
  2. Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms.

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