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방법 논문

미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)을 이용한 자동화된 미생물 배양 및 적응 진화

4K 조회수

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DOI:

10.3791/62800

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2022년 2월 18일

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1Department of Chemical Engineering, Institute of Biochemical Engineering, Tsinghua University, 2Key Laboratory of Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Tsinghua University, 3Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., 4Biochemical Engineering Research Group, School of Chemical Engineering and Technology, Xi’an Jiaotong University, 5Center for Synthetic & Systems Biology, Tsinghua University, 6School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)을 사용하여 자동화된 미생물 배양 및 적응 진화를 수행하는 방법을 설명합니다. MMC는 미생물을 자동으로 지속적으로 재배 및 하위 재배 할 수 있으며 상대적으로 높은 처리량과 우수한 병렬화로 온라인으로 성장을 모니터링하여 노동 및 시약 소비를 줄일 수 있습니다.

초록

기존의 미생물 재배 방법은 일반적으로 번거로운 작업, 낮은 처리량, 낮은 효율 및 노동 및 시약의 큰 소비를 가지고 있습니다. 더욱이, 최근 개발된 마이크로플레이트 기반의 고처리량 재배 방법은 낮은 용존산소, 불량한 혼합물, 심한 증발 및 열 효과로 인해 미생물 성장 상태 및 실험 병렬화가 불량하다. 작은 부피, 높은 처리량 및 강력한 제어 가능성과 같은 마이크로 액적의 많은 장점으로 인해 액적 기반 미세 유체 기술은 이러한 문제를 극복 할 수 있으며, 이는 고처리량 미생물 재배, 스크리닝 및 진화에 대한 많은 종류의 연구에 사용되었습니다. 그러나 대부분의 선행 연구는 실험실 건설 및 적용 단계에 남아 있습니다. 높은 운영 요구 사항, 높은 건설 어려움 및 자동화 된 통합 기술의 부족과 같은 몇 가지 주요 문제는 미생물 연구에서 액적 미세 유체 기술의 광범위한 적용을 제한합니다. 여기에서는 액적 미세유체 기술을 기반으로 자동화된 미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)이 성공적으로 개발되어 미생물 액적 재배 과정에서 필요한 접종, 재배, 온라인 모니터링, 하위 재배, 분류 및 샘플링과 같은 기능의 통합을 달성했습니다. 본 프로토콜에서는 야생형 대장 균(E. coli) MG1655 및 메탄올-필수 대장균 균주(MeSV2.2)를 예로 들어 MMC를 사용하여 자동화되고 상대적으로 높은 처리량의 미생물 배양 및 적응 진화를 수행하는 방법을 상세히 소개하였다. 이 방법은 작동하기 쉽고 노동력과 시약을 덜 소비하며 실험 처리량이 높고 데이터 병렬성이 우수하여 기존 재배 방법에 비해 큰 장점이 있습니다. 과학 연구자가 관련 미생물 연구를 수행 할 수있는 저렴한 비용, 작동 친화적이며 결과 신뢰할 수있는 실험 플랫폼을 제공합니다.

서론

미생물 재배는 미생물 과학 연구 및 산업 응용을위한 중요한 토대 이며, 미생물 1,2,3의 격리, 식별, 재구성, 스크리닝 및 진화에 널리 사용됩니다. 기존의 미생물 재배 방법은 주로 시험관, 진탕 플라스크 및 고체 플레이트를 재배 용기로 사용하며 진탕 배양기, 분광 광도계, 마이크로 플레이트 판독기 및 미생물 재배, 검출 및 스크리닝을위한 기타 장비와 결합됩니다. 그러나 이러한 방법에는 번거로운 작업, 낮은 처리량, 낮은 효율 및 많은 노동 및 시약 소비와 같은 많은 문제가 있습니다. 최근 몇 년 동안 개발 된 고처리량 재배 방법은 주로 마이크로 플레이트를 기반으로합니다. 그러나 마이크로플레이트는 낮은 수준의 용존 산소, 열악한 혼합 특성, 심한 증발 및 열 효과를 가지며, 이는 종종 불량 한 성장 상태 및 미생물 4,5,6,7의 실험 병렬화로 이어진다; 반면에 자동 재배 및 공정 검출 8,9를 달성하기 위해서는 액체 처리 워크 스테이션 및 마이크로 플레이트 판독기와 같은 값 비싼 장비를 장착해야합니다.

미세 유체 기술의 중요한 분야로서, 액적 미세 유체 학은 전통적인 연속 유동 미세 유체 시스템을 기반으로 최근 몇 년 동안 개발되었습니다. 두 개의 비혼화성 액체상(보통 오일-물)을 사용하여 분산된 마이크로액적을 생성하고 이들(10)에서 작동하는 이산 유동 미세유체 기술이다. 마이크로 액적은 작은 부피, 큰 비표면적, 높은 내부 질량 전달 속도, 구획화로 인한 교차 오염이 없으며 강력한 제어 가능성과 액적의 높은 처리량의 장점을 가지고 있기 때문에 미생물의 고처리량 재배, 선별 및 진화에 액적 미세 유체 기술을 적용하는 많은 종류의 연구가있었습니다11 . 그러나 액적 미세 유체 기술을 대중화하고 널리 적용하기위한 일련의 주요 문제가 여전히 있습니다. 첫째, 액적 미세 유체 공학의 작동은 번거롭고 복잡하여 작업자에게 높은 기술 요구 사항을 초래합니다. 둘째, 액적 미세 유체 기술은 광학, 기계 및 전기 구성 요소를 결합하고 생명 공학 응용 시나리오와 관련되어야합니다. 여러 분야의 협력이 없다면 단일 실험실 또는 팀이 효율적인 액적 미세 유체 제어 시스템을 구축하는 것은 어렵습니다. 셋째, 소량의 마이크로액적(피콜리터(pL)에서 마이크로리터(μL)까지)으로 인해, 서브재배, 분류 및 샘플링과 같은 일부 기본적인 미생물 작업을 위한 액적의 정확한 자동 제어 및 실시간 온라인 검출을 실현하는 데 많은 어려움이 소요되며, 통합 장비 시스템(12)을 구축하는 것도 어렵다.

상기 문제점을 해결하기 위하여, 액적 미세유체 기술(13)에 기초한 자동 미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)이 성공적으로 개발되었다. MMC는 액적 인식 모듈, 액적 스펙트럼 감지 모듈, 미세유체 칩 모듈 및 샘플링 모듈의 네 가지 기능 모듈로 구성됩니다. 모든 모듈의 시스템 통합 및 제어를 통해 생성, 재배, 측정 (광학 밀도 (OD) 및 형광), 분리, 융합, 물방울 분류를 포함한 자동화 된 운영 시스템이 정확하게 확립되어 미생물 액적 재배 과정에서 필요한 접종, 재배, 모니터링, 하위 재배, 분류 및 샘플링과 같은 기능의 통합을 달성합니다. MMC는 2-3 μL 부피의 최대 200개의 복제 액적 배양 단위를 보유할 수 있으며, 이는 200개의 진탕 플라스크 배양 단위에 해당한다. 마이크로 액적 재배 시스템은 미생물의 성장 동안 비 오염, 용존 산소, 혼합 및 질량 에너지 교환의 요구 사항을 충족시킬 수 있으며 성장 곡선 측정, 적응 진화, 단일 요인 다단계 분석 및 대사 산물 연구 및 분석 (형광 검출 기준)13,14과 같은 여러 통합 기능을 통해 미생물 연구의 다양한 요구를 충족시킬 수 있습니다.

여기서, 프로토콜은 MMC를 사용하여 자동화 및 미생물 배양 및 적응 진화를 수행하는 방법을 자세히 소개한다(도 1). MMC에서의 적응 진화를 입증하기 위해 야생형 대장 균(E. coli) MG1655를 일례로 하여 성장 곡선 측정 및 메탄올-필수 대장균 균주 MeSV2.215를 수득하였다. MMC 용 운영 소프트웨어가 개발되어 작업을 매우 간단하고 명확하게 만듭니다. 전체 과정에서 사용자는 초기 박테리아 용액을 준비하고 MMC의 조건을 설정 한 다음 박테리아 용액 및 관련 시약을 MMC에 주입해야합니다. 그 후, MMC는 액적 생성, 인식 및 번호 매기기, 재배 및 적응 진화와 같은 작업을 자동으로 수행합니다. 또한 높은 시간 분해능을 가진 물방울의 온라인 검출 (OD 및 형광)을 수행하고 소프트웨어에 관련 데이터 (내보낼 수 있음)를 표시합니다. 작업자는 결과에 따라 언제든지 재배 과정을 중단하고 후속 실험을 위해 표적 액적을 추출 할 수 있습니다. MMC는 작동하기 쉽고 노동력과 시약을 덜 소비하며 상대적으로 높은 실험 처리량과 우수한 데이터 병렬 성을 가지며 이는 기존 재배 방법에 비해 상당한 이점을 가지고 있습니다. 연구자들이 관련 미생물 연구를 수행 할 수있는 저렴한 비용, 작동 친화적이고 강력한 실험 플랫폼을 제공합니다.

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프로토콜

1. 계기 및 소프트웨어 설치

  1. 깨끗하고 멸균 된 환경 (예 : 깨끗한 벤치)을 MMC를위한 전용 영구 공간으로 선택하십시오. MMC를 공간에 꾸준히 설치하십시오.
    참고: MMC를 강한 전기장, 자기장 및 강한 방열원의 간섭으로부터 멀리하십시오. 심한 진동이 광학 감지 부품에 영향을 미치지 않도록 하십시오. MMC에 AC220 V, 50 HZ의 전원 공급 장치를 제공하십시오. MMC에 대한 자세한 내용은 자료 표 및 MMC16 웹 사이트를 참조하십시오.
  2. MMC.zip 파일에서 작업 소프트웨어를 설치합니다.
    참고: MMC.zip 파일에 대해서는 작성자에게 문의하십시오.
    1. 전용 폴더를 만들고 zip 파일을 저장하십시오.
    2. 다른 전용 폴더를 "설치 디렉토리"로 만듭니다. MMC.zip의 압축을 풀고 새 폴더에 파일을 저장합니다.
      참고: 컴퓨터 구성이 가장 적합합니다: (1) Windows 7 64비트 운영 체제 이상; (2) CPU: i5 이상; (3) 메모리: 4GB 이상; (4) 하드 디스크: 300GB 이상 (회전 속도가 7200rpm 이상 또는 솔리드 스테이트 디스크).

2. 준비

  1. 주사기 바늘(내경은 0.41mm, 외경은 0.71mm), 퀵 커넥터 A 및 시약 병(그림 2C)을 연결하고, 이를 121°C에서 15분 동안 오토클레이브한다.
    주: 멸균 중에 시약 병의 뚜껑을 약간 풉니다. 사용할 때마다 몇 가지 시약 병을 더 준비 할 수 있습니다.
  2. 0.22 μm 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF) 필터를 사용하여 MMC 오일을 필터링합니다. 미세유동 칩(도 2B)과 MMC 오일을 미리 깨끗한 벤치에 넣고 사용 전에 30분 동안 자외선 조사로 멸균한다.
    참고: 퀵 커넥터 A, 시약 병, MMC 오일 및 미세유체 칩에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
  3. 미세 유체 칩 설치
    1. 작동 챔버의 도어를 열고(그림 2A) 광섬유 프로브를 들어올립니다.
    2. 전기장 구멍을 전기장 바늘에 맞추고 칩을 칩 받침대에 부드럽게 놓습니다. 그런 다음 두 개의 위치 결정 열을 위치 결정 구멍에 삽입하고 광섬유 프로브를 내려 놓습니다(그림 2D).
    3. 칩의 퀵 커넥터 A를 위치 번호(C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3)에 따라 MMC의 해당 포트에 연결합니다. 그런 다음 수술실의 문을 닫으십시오.
  4. 기름 병에 MMC 오일(약 80 mL까지)을 보충하고 사용 전에 폐병에 폐액을 비우십시오.
    참고 : 폐액은 일반적으로 유기 폐기물입니다. 지역 법률 및 폐기 규정을 참조하시기 바랍니다, 실험 설정에 따라 변경에 따라.

3. MMC에서의 성장 곡선 측정

  1. 초기 박테리아 용액 준비
    1. 관련 표준 규정에 따라 Luria-Bertani (LB) 배지 및 오토클레이브를 121 ° C에서 15 분 동안 준비하십시오.
      참고: LB 배지의 성분: NaCl (10 g/L), 효모 추출물 (5 g/L) 및 트립톤 (10 g/L).
    2. 글리세롤 스톡으로부터 대장균 MG1655 균주를 꺼내어 LB 배지 10 mL가 있는 50 mL 진탕 플라스크에서 37°C에서 5-8시간 동안 진탕 인큐베이터(200 rpm)에서 배양한다.
      참고 : 재배 시간은 특정 균주에 따라 다릅니다. 대수 기간 / 단계로 균주를 배양하는 것이 가장 좋습니다.
    3. 배양된 대장균 MG1655 용액을 신선한 배지로 희석하여0.05-0.1의 OD600에 초기 박테리아 용액(약 10 mL 준비)을 얻었다.
  2. 초기화를 클릭하여 MMC를 초기화합니다. 초기화 인터페이스가 나타나면 배양 온도를 37°C로 설정하고 광전 신호 값을 0.6으로 설정합니다(그림 3A). 초기화에는 약 20 분이 소요됩니다.
  3. 초기화하는 동안 UV 램프(파장 254nm)를 켭니다.
  4. 초기 박테리아 용액과 MMC 오일을 시약 병에 주입하십시오.
    1. 깨끗한 벤치에서 멸균 된 시약 병을 꺼내 뚜껑을 조이십시오.
    2. 10 mL 멸균 주사기를 사용하여 측면 튜브의 주사기 바늘에서 3-5 mL의 MMC 오일을 주입하십시오. 시약 병을 천천히 기울이고 회전시켜 오일이 내벽에 완전히 침투하도록하십시오.
    3. 초기 박테리아 용액 약 5 mL를 주입 한 다음 다시 오일 5-7 mL를 주입하여 시약 병을 채 웁니다.
    4. 독립적인 퀵 커넥터 A를 당기고 시약 병의 퀵 커넥터 A를 퀵 커넥터 B에 삽입하여 샘플 주입 작업을 완료합니다(그림 4A).
  5. 초기화가 끝날 때까지 기다린 다음 UV 램프 (파장 254nm)를 끕니다.
  6. 수술실의 문을 열고 시약 병을 금속 욕조에 넣으십시오.
  7. 칩의 C2 커넥터와 시약 병의 빠른 커넥터 A를 당깁니다. 시약 병의 측면 튜브 커넥터를 C2 커넥터에 연결하고 상단 튜브 커넥터를 O2 커넥터에 연결합니다. 그런 다음 수술실의 문을 닫으십시오.
  8. 성장 곡선을 클릭하여 성장 곡선 측정 기능을 선택합니다(그림 3A). 매개 변수 설정 인터페이스에서 숫자를 15로 입력하고 OD 감지 스위치를 켜고 파장을 600nm로 설정합니다. 시작을 클릭하여 드롭릿 생성을 시작합니다. 약 10 분이 소요됩니다.
    참고: 여기서 숫자는 생성될 액적의 수를 나타냅니다. 파장은 검출되는 OD의 파장을 의미한다. 실험 요구 사항에 따라 수 (최대 200) 및 파장 (350-800nm)을 설정합니다.
  9. 메인 인터페이스에 "C2와 O2 사이의 시약 병을 제거한 다음 완료 후 OK 버튼을 클릭하십시오"라는 팝업 창이 나타나면 수술실의 문을 열어 시약 병을 꺼내고 C2 및 O2 커넥터를 연결하십시오.
  10. 문을 닫고 팝업 창에서 확인 버튼을 클릭하여 자동으로 물방울을 재배하고 OD 값을 감지합니다.
    참고: MMC는 액적이 광섬유 프로브를 통과할 때 OD 값을 감지합니다. 따라서 감지 기간은 생성 된 액적의 수에 따라 다릅니다.
  11. 성장 곡선이 고정 단계에 도달하면 데이터 내보내기 단추를 클릭하여 OD 데이터를 내보냅니다. 데이터 저장 경로를 선택하고 재배 기간 동안 기록된 OD 값을 적절한 소프트웨어(예: Microsoft Excel)에 의해 열 수 있는 .csv 형식으로 내보냅니다. 그런 다음 매핑 소프트웨어(예: EXCEL 및 Origin 9.0)를 사용하여 성장 곡선을 플로팅합니다.
    참고: 재배 과정에서 언제든지 데이터 내보내기 를 클릭하여 현재 모든 액적의 OD 데이터를 내보낼 수 있습니다.

4. MMC의 적응형 진화

  1. 초기 박테리아 용액 준비
    1. 관련 표준 규정에 따라 MeSV2.2 및 오토클레이브를 위한 특수 액체 매질 및 고체 플레이트를 121°C에서 15분 동안 준비한다.
      참고: 특수 매체의 구성 요소에 대해서는 표 1 및 재료 표를 참조하십시오.
    2. MeSV2.2를 고체 플레이트(직경 = 90 mm)를 사용하여 37°C 항온 배양기에서 72시간 동안 배양한다. 그 다음 독립적인 콜로니를 골라 37°C에서 72시간 동안 진탕 인큐베이터(200 rpm)에서 10 mL의 특수 액체 배지와 함께 50 mL 진탕 플라스크에서 배양한다.
    3. 배양된 MeSV2.2 용액을 배지와 함께0.1-0.2의 OD600에 희석하고(총 부피가 10 mL 이상인지 확인) 진탕 플라스크에서 5시간 동안 계속 배양하여 초기 박테리아 용액을 얻었다.
      참고: MeSV2.2는 메탄올-필수 대장균 균주이다. 특수 액체 배지에는 500 mmol / L 메탄올이 포함되어 있으며, 이는 MeSV2.2에 강한 스트레스이므로 매우 느린 성장을 초래합니다. 여기서 초기 박테리아 용액을 얻는 것은 단계 3.1에서 설명한 것과 다르다는 점에 유의하십시오.
  2. 3.2, 3.3 및 3.5단계에서 설명한 대로 MMC를 초기화합니다.
  3. 두 개의 멸균 된 시약 병을 꺼내십시오.이 중 하나는 초기 박테리아 용액을위한 것이고 다른 하나는 신선한 배지를위한 것입니다. 단계 3.4에서 설명된 바와 같이 초기 박테리아 용액 (5 mL), 신선한 배지 (12-15 mL), 및 MMC 오일을 시약 병에 주입한다.
    참고 : 적응 진화는 여러 하위 재배를 포함하는 장기적인 과정이므로 MMC에 가능한 한 많은 신선한 배지를 저장하십시오. 배지는 실험 실행 중에 보충할 수 없습니다.
  4. 3.6단계에서 설명한 대로 두 개의 시약 병을 MMC에 설치합니다. 하나는 C2와 O2 커넥터 사이에 초기 박테리아 용액을, 다른 하나는 C4와 O4 커넥터 사이의 새 배지에 설치하십시오.
  5. ALE를 클릭하여 적응 진화 기능을 선택합니다(그림 3B). 매개 변수 설정 인터페이스에서 OD 감지 스위치를 켭니다.
  6. 숫자를 50, 파장을 600nm, 농도를 0%, 시간으로 입력, 파라미터를 30h, 반복을 99로 설정합니다. 시작을 클릭하여 드롭릿 생성을 시작합니다. 약 25 분이 소요됩니다.
    참고: 여기서 "농도"는 적응 진화를 위한 화학적 요인의 최대 농도를 의미한다. 다른 액적의 경우, MMC에서 다른 성장 조건을 제공하기 위해 다양한 농도의 화학 인자를 도입하는 것이 실현 가능합니다. 다음 방정식을 사용하여 도입된 농도를 계산합니다.
    figure-protocol-1
    여기서 "C" 는 액적에 도입된 화학적 인자의 농도를 지칭하고; "a"는 C4 및 O4 커넥터 사이의 시약 병 내의 화학적 인자의 농도를 지칭하고; "b"는 C6 및 O6 커넥터 사이의 시약 병 내의 화학적 인자의 농도를 지칭하고; 및 "i"는 이용가능한 농도를 지칭한다. MMC에서 사용할 수있는 여덟 가지 농도가 있습니다. 여기의 화학 인자는 단일 농도 (500 mmol / L 메탄올)를 가지며 배지의 성분 중 하나이기 때문에 화학 인자를 함유 한 시약 병 하나만 여기에 설치되고 농도 는 0 %로 설정됩니다. 유형은 세 가지 유형으로 나뉘어지는 하위 재배 모드를 말합니다 : 시간 모드, OD 값 모드 및 형광 모드. 전자는 일정한 시간 동안 물방울을 재배 한 다음 하위 재배하는 것을 의미하고, 후자의 두 가지는 미리 정의 된 OD 값 / 형광 강도로 물방울을 재배 한 다음 하위 재배하는 것을 의미합니다. 매개 변수는 하위 재배 모드를 선택할 때 필요한 관련 매개 변수를 나타냅니다. 반복은 하위 재배의 수를 나타냅니다.
  7. 3.8단계에서 설명한 대로 C2와 O2 커넥터 사이에 놓인 시약 병을 분리합니다.
  8. 각 서브 재배 기간 동안 액적의 최대 OD 값이 크게 증가했는지 관찰하십시오. 증가가 발생하고 실험 요구 사항을 충족하는 경우 데이터 내보내기 단추를 클릭하여 3.9단계에서 설명한 대로 OD 데이터를 내보냅니다.
    참고: 여기서 하위 재배 기간은 매개 변수에 따라 다릅니다. 예를 들어, 유형을 시간 및 매개 변수 로 설정하는 경우 하위 재배 기간은 30h입니다. 각 하위 재배 기간 동안, 액적의 최대 OD 값이 있습니다. 적응형 진화가 최대 OD 값의 증가에 의해 실험 요건을 충족하는지 여부를 추정한다(증가는 균주의 실제 재배 과정에 의존하며, 예를 들어, 20% 이상 증가함).
    주의: 저장된 새 매체가 고갈되었는지 여부를 주의하십시오. 배지가 소진된 후에도 상당한 증가가 일어나지 않았다면, 더 잘 자라는 물방울을 추출하고 적응 진화의 새로운 라운드를 수행하십시오.
  9. MMC에서 표적 액적을 추출합니다.
    1. 스크리닝 버튼을 클릭하여 액적 추출 기능을 선택합니다(그림 3C). 수집 옵션을 선택하고 대상 물방울의 수를 클릭 한 다음 확인을 클릭하십시오.
      참고: 액적 스크리닝에는 "수집", "폐기" 및 "종자 용액 추출"이 포함됩니다. "추출 종자 용액"은 서브 재배 작업 후에 남은 액적(13)을 수집하는 것을 의미한다.
    2. 팝업 창이 "CF 퀵 커넥터를 꺼내 EP 튜브에 넣으십시오"라는 메시지가 나타날 때까지 기다립니다. CF 퀵 커넥터를 소프트웨어 프롬프트에 따라 수집을 위해 마이크로 원심분리 튜브에 넣은 다음 확인을 클릭합니다(그림 4D).
    3. 1-2 분 후에 소프트웨어 인터페이스는 "커넥터를 다시 삽입하고 완료되면 확인을 클릭하십시오"라는 새 창을 팝업합니다. 그런 다음 CF 퀵 커넥터를 다시 삽입하고 확인을 클릭하여 MMC가 계속 실행되도록 합니다(그림 4D). 다음 대상 액적이 액적 인식 사이트에 도달하면 4.9.2-4.9.3을 반복하여 수집합니다.
      참고: 모든 표적 물방울이 수집된 후, MMC는 나머지 물방울을 계속 배양합니다. 재배가 필요하지 않은 경우 중지를 클릭하여 작업을 직접 종료하십시오.
    4. 2.5 μL 피펫을 사용하여 액적을 추출하고, 90 mm 아가로스 플레이트에 떨어뜨린 다음, 측면 길이 3 cm의 삼각형 유리 확산 막대로 골고루 퍼뜨린다. 그런 다음 37 °C 항온 배양기에서 72 시간 동안 배양하십시오.
    5. 3-5개의 독립적인 콜로니를 골라서 이를 신선한 배지 10 mL와 함께 50 mL 진탕 플라스크에서 37°C에서 48-72시간 동안 진탕 인큐베이터(200 rpm)에서 개별적으로 배양한다. 후속 실험을 위해 배양된 박테리아 용액을 글리세롤 튜브에 저장하기 위해 관련 표준 규정을 따르십시오.

5. MMC의 청소

  1. 실험이 완료되면 중지를 클릭하여 모든 작업을 중지 합니다. 그런 다음 정리 를 클릭하여 칩과 튜브를 청소하십시오. 약 15 분이 소요됩니다.

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결과

이 프로토콜은 대장균 MG1655 및 MeSV2.2 균주를 예로 사용하여 MMC에서 자동화되고 상대적으로 높은 처리량 전략을 갖는 미생물 배양 및 메탄올 필수 적응 진화를 입증합니다. 성장 곡선 측정은 주로 미생물 재배를 특성화하기 위해 사용되었다. 적응 진화는 자동화된 연속 서브 재배에 의해 수행되었고, 각각의 서브 재배 동안 선택적 압력으로서 고농도의 메탄올을 첨가하였다. 적응 진화가 실현되었는지 여부는 각 서브 재배 기간 동안 액적의 최대 OD 값의 변동 추세를 통해 추정되었다. MMC의 조정 가능한 파라미터 및 정확도 파라미터는 표 2에 나타내었다.

성장 곡선 측정 결과
배양 과정 중에 검출된 15개의 액적의OD600 값을 약 20 h 동안 배양한 후에 MMC로부터 내보냈다(도 5A). 검...

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토론

이 프로토콜은 미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)을 사용하여 자동화된 미생물 배양 및 장기 적응 진화를 수행하는 방법을 제시합니다. MMC는 소형화, 자동화 및 고처리량 미생물 배양 시스템입니다. 기존의 미생물 고처리량 배양 방법 및 장비와 비교하여 MMC는 낮은 노동력 및 시약 소비, 간단한 조작, 온라인 검출 (OD 및 형광), 고분해능 데이터 수집 및 우수한 병렬화와 같은 많은 장점을 가지고 있습니다. MMC는 또한 일반적으로 pL 및 nL 액적을 사용하는 기존의 액적 미세 유체 기술과 다른 몇 가지 특별한 장점을 가지고 있습니다. pL 및 nL 물방울을 사용한 이전에 보고된 대부분의 시스템은 재배 성능이 좋지 않으며 검출 가능한 파라미터가 거의 없습니다(일반적으로 형광만 해당)18,19,20,21.<...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 중국의 국가 핵심 연구 개발 프로그램 (2018YFA0901500), 중국 국립 자연 과학 재단 (21627812)의 국가 핵심 과학 기기 및 장비 프로젝트 및 칭화 대학 이니셔티브 과학 연구 프로그램 (20161080108)의 지원을 받았다. 또한 메탄올 필수 대장균 균주 버전 2.2(MeSV2.2)의 제공을 위해 Julia A. Vorholt 교수(미생물학 연구소, 생물학과, 취리히 취리히, 취리히 8093, 스위스)에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.22 &무; m PVDF 필터 멤브레인Merck Millipore Ltd.SLGPR33RBMMC 오일
4 °를 살균하십시오. C 냉장고HaierBCD-289BSW시약 보관용
AgarBecton, Dickinson and Company214010솔리드 플레이트 준비용
CaCl2· 2H2OSinopharm 화학 시약 베이징 Co., Ltd.20011160MeSV2.2를 위한 특별한 매체의 분대.
클린 벤치Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.DL-CJ-INDII무균 작동 및 UV 살균
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