비피더스균은 N-글라이칸 절단을 위한 독특한 유전체 능력을 가지고 있습니다. 이러한 효소를 재조합적으로 생산하는 것은 초유와 같은 당단백질이 풍부한 기질에서 생체 활성 N-글리칸을 방출하는 유망한 새로운 도구가 될 것입니다.
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비피더스균은 N-글라이칸 절단을 위한 독특한 유전체 능력을 가지고 있습니다. 이러한 효소를 재조합적으로 생산하는 것은 초유와 같은 당단백질이 풍부한 기질에서 생체 활성 N-글리칸을 방출하는 유망한 새로운 도구가 될 것입니다.
단백질 당화(glycosylation)는 다양하고 일반적인 번역 후 변형(post-translational modification)으로, 단백질 접힘(protein folding), 안정성(stability), 효소 보호(enzymatic protection) 및 생물학적 인식(biological recognition)을 포함한 단백질 기능과 같은 많은 중요한 역할과 관련이 있습니다. 당단백질(예: 락토페린, 락타데린, 면역글로불린)에 부착된 N-글리칸은 숙주에서 소화되지 못하고 대장에 도달하여 특정 유익한 미생물에 의해 섭취됩니다. 따라서 이들은 장내 마이크로바이옴의 유익한 미생물을 선택적으로 자극할 수 있는 차세대 프리바이오틱 화합물로 간주됩니다. 그러나 이러한 새로운 종류의 프리바이오틱스를 분리하려면 새로운 효소가 필요합니다. 여기에서는 당단백질에서 N-글리칸 분리를 개선하기 위해 다양한 비피더스균 균주(유아, 토끼, 닭 및 호박벌에서 분리)에서 새로운 글리코시다아제의 재조합 생산에 대해 설명합니다. 이 연구에서 제시된 방법에는 in vivo 재조합 클로닝 전략에 의한 비피더스박테리아 유전자의 분자 클로닝, 형질전환 성공 제어, 단백질 유도 및 단백질 정제 단계가 포함됩니다.
당화(glycosylation)는 단백질에서 관찰되는 매우 중요한 번역 후 변형(post-translational modification)입니다. 단백질의 약 50% 이상이 진핵생물에서 당화(glycosylated) 형태로 발견됩니다. N- 및 O- 당화 (glycosylation)는 당화 (glycosylation)의 두 가지 주요 유형입니다 1,2. O-결합 글라이칸(O-글리칸)은 N-아세틸갈락토사민을 통해 세린(Ser) 또는 트레오닌(Thr) 아미노산 잔기의 하이드록실기에 공유 결합되어 단백질에 부착됩니다. N-결합 글라이칸(N-glycans)은 복잡한 올리고당으로, N-X-Ser/Thr과 같은 특정 아미노산 서열에서 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)을 통해 단백질의 아스파라긴(Asn) 아미노산 잔류물에 공유 결합되며,N-X-Cys(시스테인)와 같이 (여기서 X는 프롤린을 제외한 모든 아미노산일 수 있음)3,4
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1. 비피더스균 유전자의 분자 클로닝
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서로 다른 기원에서 선택된 글리코실 가수분해효소 구성원 효소가 이 연구에서 표적으로 삼았습니다. 서로 다른 구조를 가진 서로 다른 효소의 공동 적용은 서로 다른 당단백질에서 활성화되도록 진화했기 때문에 더 나은 글리칸 방출을 제공할 수 있다고 가정했습니다. 표적 유전자 및 그 기원의 목록은 표 1에 나열되어 있습니다. 박테리아 균주는 Belgium Co-ordinated Collections of Micro-organisms에서 얻었습니다. 프라이머 세트는 제조업체의 지침에 따라 설계되었습니다(보충 표 1). N-His Kan Vector의 정방향 및 역방향 프라이머는 다음과 같이 설계되었습니다. F: 5'-CAT CAT CAC CAC CAT CAC XXX2 XXX3 XXX4 XXX5 XXX6 XXX7 XXX8 (XXX 2-XXX
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표적 유전자의 분자 클로닝에 사용되는 in vivo 재조합 클로닝 전략은 다른 기존 클로닝 프로토콜에 비해 빠르고 신뢰할 수 있는 결과를 제공합니다. 분자 클로닝을 위한 편리한 방법이 많이 있지만 이 기사에 설명된 방법에는 더 많은 장점이 있습니다. 생체 내 클로닝 시스템은 다른 클로닝 시스템과 달리 PCR 산물의 효소 처리나 정제가 필요하지 않습니다. 또한, 서열 접합 또는 제한 효소의 요구 사항과 관련된 제한은 없습니다. 이 시스템에서는 효소 결찰(enzymatic ligation)이 필요 없이 증폭된 유전자를 세포 및 벡터(키트와 함께 제공됨)와 혼합하여 클로닝을 수행할 수 있습니다. 이것이 생체 내 복제라고 불리는 이유입니다. PCR 산물의 말단과 벡터 사이의 재조합은 세포에서 발생합니다. 이 시스템의 선형 벡터는 양쪽 끝에 18개의 뉴클레오티드 길이의 끈적한 말단을 포함하며 이러한 염기서열은 서로 상보적이지 않습.......
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저자는 공개할 내용이 없습니다.
이 연구는 TUBITAK #118z146와 Uluova Süt Ticaret A.Ş(Uluova Milk Trading Co.)의 지원을 받았습니다.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| EconoTaq PLUS 2X Master Mix | Lucigen | 30035-1 | 표적 유전자 증폭(PCR) |
| DNase/RNase-free 증류수 | Invitrogen | 10977035 | 표적 유전자(PCR) 증폭 |
| Safe-Red Loading Dye | abm | G108-R | DNA gel 전기영동 |
| 1 kb Plus DNA Ladder | GoldBio | D011-500 | DNA gel 전기영동 |
| Qubit 단백질 분석 키트 | Invitrogen | Q33211 | DNA 농도 측정 |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | amresco | J106-2KG | 세균 배양 배지 |
| Agarose Invitrogen | 16500-500 | Bacterial culture mediaet al. | |
| Kanamycin Monosulfate | GoldBio | K-120-5 | 박테리아 배양 배지의 항생제 |
| Expresso Rhamnose 클로닝 및 발현 시스템 키트, N-HIS | Lucigen | 49011-1 | 클로닝 키트 |
| Expresso Rhamnose 클로닝 및 발현 시스템 키트, SUMO | Lucigen | 49013-1 | 클로닝 키트 |
| Expresso Rhamnose 클로닝 및 발현 시스템 키트, C-HIS | Lucigen | 49012-1 | 클로닝 키트 |
| 글리세롤 용액 | : Sigma-Aldrich | 15524-1L-R | 글리세롤 스톡 |
| L-Rhamnose 일 수화물 | 준비 Sigma-Aldrich | 83650 | 단백질 발현 유도 |
| 2X Laemmli Sample Buffer | ClearBand | TGS10 | SDS-Page 분석 |
| SureCast 40 % (w / v) 아크릴 아미드 | Invitrogen | HC2040 | SDS - Page 분석 |
| SureCast APS | Invitrogen | HC2005 | SDS-Page analysis |
| SureCast TEMED | Invitrogen | HC2006 | SDS-Page analysis |
| 10X Running Buffer | ClearBand | TGS10 | SDS-Page analysis |
| Triset al. | BioShop | TRS001.1 | SDS-Page 분석 및 세포 용해 |
| 10% SDS | ClearBand | S100 | SDS-Page 분석 |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder | ThermoFisher | 26619 | SDS-Page 분석 |
| 이미다졸 | Sigma-Aldrich | 56750 | 세포 용해 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434-5Kg-R | 세포 용해 |
| 나트륨 인산염 일 염기성 무수 | amresco | 0571-1Kg | 세포 용해를위한 인산 나트륨 완충액 |
| 산 나트륨 인산염 이염 기성 이수화 물질 | Sigma-Aldrich | 04272-1Kg | 세포 용해 |
| 10-kDa-cut-off 원심 필터 | Amicon® - MERCK | UFC9010 | 효소 정제 |
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