Method Article

광학적으로 기화된 퍼플루오로카본 나노방울의 제형 및 음향 변조

DOI:

10.3791/62814

⸱

July 16th, 2021

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering and School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

광학적으로 활성화 된 퍼플 루오로 카본 나노 방울은 혈관 시스템 외부의 이미징 응용 분야에서 가능성을 보여줍니다. 이 기사에서는 이러한 입자를 합성하고, 폴리아크릴아미드 팬텀을 가교결합하고, 액적을 음향적으로 변조하여 신호를 향상시키는 방법을 보여줍니다.

Abstract

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마이크로 버블은 초음파에서 가장 일반적으로 사용되는 영상 조영제입니다. 그러나 크기 때문에 혈관 구획으로 제한됩니다. 이러한 마이크로버블은 혈관을 유출할 수 있을 만큼 충분히 작은 과불화탄소 나노방울(PFCnD)로 응축되거나 공식화될 수 있으며 표적 부위에서 음향적으로 촉발될 수 있습니다. 이들 나노입자는 근적외선 유기 염료 또는 나노입자(예를 들어, 황화구리 나노입자 또는 금 나노입자/나노로드)와 같은 광흡수제를 포함함으로써 더욱 향상될 수 있다. 광학적으로 태그가 지정된 PFCnD는 광학 액적 기화(ODV)로 알려진 공정에서 레이저 조사를 통해 기화될 수 있습니다. 이 활성화 과정은 진단 이미징을 위한 최대 기계적 지수 임계값 미만에서 음향적으로 기화될 수 없는 고비점 퍼플루오로카본 코어의 사용을 가능하게 합니다. 끓는점 코어가 높을수록 기화 후 재응축되는 액적이 생성되어 기화 후 나노액적 형태로 다시 응축되기 전에 잠시 대비를 생성하는 "깜박임" PFCnD가 생성됩니다. 이 프로세스를 반복하여 필요에 따라 대비를 생성할 수 있으므로 광학 및 음향 변조를 통해 배경 없는 이미징, 멀티플렉싱, 초고해상도 및 대비 향상이 가능합니다. 이 기사에서는 프로브 초음파 처리를 사용하여 광학적으로 트리거 가능한 지질 쉘 PFCnD를 합성하고, 나노 방울을 특성화하기 위해 폴리 아크릴아미드 팬텀을 만들고, ODV 후 PFCnD를 음향 조절하여 대비를 개선하는 방법을 보여줍니다.

Introduction

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Microbubbles는 연조직에 비해 생체 적합성과 우수한 에코 발생성으로 인해 가장 유비쿼터스 초음파 조영제입니다. 이것은 혈류, 장기 묘사 및기타 응용 프로그램을 시각화하는 데 유용한 도구가 됩니다1. 그러나 공진 주파수를 기반으로 한 이미징에 탁월한 크기 (1-10 μm)는 적용을 혈관 구조2로 제한합니다.

이러한 한계로 인해 액체 퍼플루오로카본 코어 주위에 둘러싸인 계면활성제로 구성된 나노 에멀젼인 PFCnD가 개발되었습니다. 이 나노 입자는 200nm만큼 작은 크기로 합성 될 수 있으며 종양 혈관계에서 발견되는 "누출 된"혈관 구조 또는 기공 및 열린 fenestrations를 활용하도록 설계되었습니다. 이러한 파괴는 종양 의존적이지만,이 투과성은 종양에 따라 ~ 200 nm - 1.2 μm의 나노 입자의 혈관 외 유출을 허용합니다 3,4. 초기 형태에서 이러한 입자는 초음파 대비를 거의 또는 전혀 생성하지 않습니다. 음향 또는 광학적으로 유도 된 기화시 코어 상이 액체에서 기체로 바뀌어 직경 5,6,7

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Protocol

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1. 퍼플루오로카본 나노방울 제형

  1. 10mL 둥근바닥 플라스크를 클로로포름으로 헹구고 10μL 및 1mL 밀폐 유리 주사기를 클로로포름으로 씻어내고 전체 주사기 부피를 반복적으로 흡인하여 총 3회 배출합니다.
    주의 : 클로로포름은 휘발성이며 흡입하면 유독 할 수 있습니다. 이 용매를 사용한 모든 작업은 흄 후드에서 수행해야합니다.
  2. 주사기를 사용하여 200μL의 DSPE-mPEG2000(25mg/mL), 6.3μL의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC, 25mg/mL) 및 1mL의 IR 1048(클로로포름에서 1mg/mL)을 둥근 바닥 플라스크에 추가합니다. 스톡의 오염을 방지하기 위해 지질/염료 사이의 주사기를 청소하는 것을 잊지 마십시오.
    알림: 적외선 염료는 빛에 민감하며 작업은 어두운 조건에서 수행하거나 플라스크를 알루미늄 호일로 덮어야합니다.
  3. 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거합니다. 범핑을 방지하기 위해 진공을 332mbar로 천천히 조정하십시오. 5분 후 압력을 42mbar로 낮추어 용액에 들어갔을 수 있는 물을 제거합니다.
    참고: 지질 케이크는 4°C에서 파라필름으로 덮인 둥근 바닥 플라스크에 밤새 보관할 수 있습니다.
  4. 지질 케이크를 1mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 ....

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Results

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PFCnD의 성공적인 포뮬레이션 및 원심 분리는 직경 200-300nm 크기의 액적을 생성해야 합니다(그림 1A). 부적절하게 분리된 액적은 약 1μm의 작은 피크를 보일 수 있습니다. 이러한 용액은 더 큰 물방울을 분해하기 위해 더 많은 욕조를 초음파 처리 할 수 있습니다. 액적의 크기는 Ostwald 숙성21,22로 알려진 과정에서 유착 및/또는 확산으로 인해 시간이 지남에 따라 증가합니다(그림 1B).

이미징 펄스를 조작하여 액적의 음향 변조는 기화된 PFCnD의 대비를 개선했습니다. 이것은 빔 포밍 이미지의 인접한 프레임을 빼서 재구성 된 PFCnD 이미지에서 입증되었으므로 기화 된 PFCnD에서 반환 된 신호 만 보이고 고정 된 배경 신호는 억제됩니다. 콘트라스.......

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Discussion

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프로브 초음파 처리는 PFCnD를 제조하는 비교적 간단하고 배우기 쉬운 방법입니다. 주의를 기울여야 할 몇 가지 단계가 있습니다. 클로로포름을 취급할 때는 휘발성이고 표준 공기 변위 피펫에서 "누출"되므로 용적형 피펫 또는 유리 주사기를 사용해야 합니다. 또한 정변위를 사용하는 경우 클로로포름이 대부분의 플라스틱 팁을 용해시켜 용액에 오염 물질을 유입시킬 수 있으므로 적절한 팁을 사용해야 합니다. 용적형 피펫 또는 유리 주사기는 퍼플루오로헥산에도 권장되는데, 이는 퍼플루오로헥산이 물보다 휘발성이고 밀도가 높기 때문입니다. 일반적으로 휘발성 및 고밀도의 개별 효과는 공기 변위 피펫에서 사전 습윤하고 스케일을 사용하여 피펫에 설정된 부피를 조정함으로써 각각 줄일 수 있습니다. 그러나 두 가지 특성을 모두 가진 퍼플루오로헥산의 경우 휘발성으로 인해 정확한 중량 측정을 얻기 어려워 용적식 피펫/유리 주사기가 가장 실행 가능한 옵션입니다.

프로브 용액을 초음파 처리하기 전에 지질과 퍼플루.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 BCRF-20-043 보조금으로 유방암 연구 재단에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
과황산 암모늄 (APS)VWR97064-592
1,2- 디스테아로 일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 콜린 (DSPC)Avanti Polar Lipids850365C지질, 이들은 클로로포름 또는 분말 형태로 현탁 구입할 수 있습니다. 장기 보관의 경우 분말 형태가 가장 좋지만 클로로포름이 더 실용적입니다.
1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](암모늄염) (DSPE-PEG)Avanti Polar Lipids880120C지질은 클로로포름 또는 분말 형태로 현탁하여 구입할 수 있습니다. 장기 보관의 경우 분말 형태가 가장 좋지만 클로로포름이 더 실용적입니다.
아크릴 아미드 : Bisacrylamide 용액 (19 : 1) 40 % (w / v), OmniPur®VWREM-1300아크릴아미드 용액, 저농도/ 분말
IR-1048시그마405175적외선 염료
L11-4vVerasonics-초음파 선형 어레이 트랜스듀서
Microtip 1/8"Qsonica LLC4418마이크로팁 프로브 초음파 발생기
N, N, N′, N′ -테트라메틸에틸렌디아민 (TEMED)VWR97064-902과황산암모늄의 존재 하에서 자유 라디칼을 형성하여 폴리아크릴아미드를 중합하는 데 사용
Nova IIOphir-Spiricon7Z01550레이저 파워 미터
과불화헥산플루오롬APF-60M과불화탄소 액체
인산염 완충 식염수(PBS) 정제VWR97062-732
Q500Qsonica LLC를 만드는 데 사용Q500-110프로브 초음파 발생기
실리카겔Sigma-Aldrich2885002-25 μ m 입자 크기
Tempest 30New waveresearch-Pulsedlaser system
Vantage 128Verasonics-researchultrasonic imaging system
Zetasizer Nano ZSMalvern Instruments Ltd-dynamiclight scattering을 기반으로 크기 측정
PBS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schutt, E. G., Klein, D. H., Mattrey, R. M., Riess, J. G. Injectable microbubbles as contrast agents for diagnostic ultrasound imaging: the key role of perfluorochemicals. Angewandte Chemie International Edition. 42 (28), 3218-3235 (2003).
  2. Lee, H., et al.

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Perfluorocarbon NanodropletsOptical Droplet VaporizationAcoustic ModulationUltrasound Contrast AgentsLipid Shell NanodropletsProbe SonicationDynamic Light ScatteringPolyacrylamide PhantomCentrifugal SeparationOstwald Ripening

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