Method Article

광학적으로 기화된 퍼플루오로카본 나노방울의 제형 및 음향 변조

DOI:

10.3791/62814

⸱

July 16th, 2021

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering and School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

광학적으로 활성화 된 퍼플 루오로 카본 나노 방울은 혈관 시스템 외부의 이미징 응용 분야에서 가능성을 보여줍니다. 이 기사에서는 이러한 입자를 합성하고, 폴리아크릴아미드 팬텀을 가교결합하고, 액적을 음향적으로 변조하여 신호를 향상시키는 방법을 보여줍니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

마이크로 버블은 초음파에서 가장 일반적으로 사용되는 영상 조영제입니다. 그러나 크기 때문에 혈관 구획으로 제한됩니다. 이러한 마이크로버블은 혈관을 유출할 수 있을 만큼 충분히 작은 과불화탄소 나노방울(PFCnD)로 응축되거나 공식화될 수 있으며 표적 부위에서 음향적으로 촉발될 수 있습니다. 이들 나노입자는 근적외선 유기 염료 또는 나노입자(예를 들어, 황화구리 나노입자 또는 금 나노입자/나노로드)와 같은 광흡수제를 포함함으로써 더욱 향상될 수 있다. 광학적으로 태그가 지정된 PFCnD는 광학 액적 기화(ODV)로 알려진 공정에서 레이저 조사를 통해 기화될 수 있습니다. 이 활성화 과정은 진단 이미징을 위한 최대 기계적 지수 임계값 미만에서 음향적으로 기화될 수 없는 고비점 퍼플루오로카본 코어의 사용을 가능하게 합니다. 끓는점 코어가 높을수록 기화 후 재응축되는 액적이 생성되어 기화 후 나노액적 형태로 다시 응축되기 전에 잠시 대비를 생성하는 "깜박임" PFCnD가 생성됩니다. 이 프로세스를 반복하여 필요에 따라 대비를 생성할 수 있으므로 광학 및 음향 변조를 통해 배경 없는 이미징, 멀티플렉싱, 초고해상도 및 대비 향상이 가능합니다. 이 기사에서는 프로브 초음파 처리를 사용하여 광학적으로 트리거 가능한 지질 쉘 PFCnD를 합성하고, 나노 방울을 특성화하기 위해 폴리 아크릴아미드 팬텀을 만들고, ODV 후 PFCnD를 음향 조절하여 대비를 개선하는 방법을 보여줍니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microbubbles는 연조직에 비해 생체 적합성과 우수한 에코 발생성으로 인해 가장 유비쿼터스 초음파 조영제입니다. 이것은 혈류, 장기 묘사 및기타 응용 프로그램을 시각화하는 데 유용한 도구가 됩니다1. 그러나 공진 주파수를 기반으로 한 이미징에 탁월한 크기 (1-10 μm)는 적용을 혈관 구조2로 제한합니다.

이러한 한계로 인해 액체 퍼플루오로카본 코어 주위에 둘러싸인 계면활성제로 구성된 나노 에멀젼인 PFCnD가 개발되었습니다. 이 나노 입자는 200nm만큼 작은 크기로 합성 될 수 있으며 종양 혈관계에서 발견되는 "누출 된"혈관 구조 또는 기공 및 열린 fenestrations를 활용하도록 설계되었습니다. 이러한 파괴는 종양 의존적이지만,이 투과성은 종양에 따라 ~ 200 nm - 1.2 μm의 나노 입자의 혈관 외 유출을 허용합니다 3,4. 초기 형태에서 이러한 입자는 초음파 대비를 거의 또는 전혀 생성하지 않습니다. 음향 또는 광학적으로 유도 된 기화시 코어 상이 액체에서 기체로 바뀌어 직경 5,6,7이 2 배 반에서5 배 증가하고 광 음향 및 초음파 대비가 생성됩니다. 음향 기화가 가장 일반적인 활성화 방법이지만 이 접근 방식은 기화의 이미징을 제한하는 음향 아티팩트를 생성합니다. 또한 대부분의 퍼플루오로카본은 기화하기 위해 안전 임계값을 초과하는 기계적 지수를 가진 집중 초음파가필요합니다8. 이로 인해 저비점 PFCnD가 개발되었으며, 이는 마이크로 버블을 나노 방울9로 응축하여 합성 할 수 있습니다. 그러나, 이들 액적은 더 휘발성이고 자발적인 기화(10)를 받는다.

반면에 광학 액적 기화 (ODV)는 나노 입자 11,12,13 또는 염료 6,14,15와 같은 광학 트리거를 추가해야하며 ANSI 안전 한계 (11) 내의 플루언스를 사용하여 더 높은 끓는점 퍼플 루오로 카본을 기화 할 수 있습니다. 더 높은 끓는점 코어로 합성된 PFCnD는 더 안정적이고 기화 후 재응축되어 배경 없는 이미징16, 멀티플렉싱(17) 및 초고해상도(18)가 가능합니다. 이러한 기술의 주요 한계 중 하나는 높은 끓는점 PFCnD가 기화 후 밀리 초19의 규모로 짧은 시간 동안 만 에코 생성되고 상대적으로 희미하다는 사실입니다. 이 문제는 반복적인 기화 및 평균화를 통해 완화할 수 있지만 액적 신호의 검출 및 분리는 여전히 과제로 남아 있습니다.

펄스 반전으로부터 영감을 얻어서, 지속 시간 및 대비는 초음파 이미징 펄스(19)의 위상을 수정함으로써 향상될 수 있다. 희박한 단계 (n- 펄스)로 초음파 이미징 펄스를 시작하면 기화 된 PFCnD의 지속 시간과 대비가 모두 증가합니다. 대조적으로, 압축 위상 (p- 펄스)으로 초음파 영상 펄스를 시작하면 대비가 감소하고 지속 시간이 단축됩니다. 이 기사에서는 광학적으로 트리거 가능한 퍼플루오로카본 나노방울, 이미징에 일반적으로 사용되는 폴리아크릴아미드 팬텀을 합성하고 음향 변조를 통해 대비 향상 및 향상된 신호 수명을 입증하는 방법을 설명합니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 퍼플루오로카본 나노방울 제형

  1. 10mL 둥근바닥 플라스크를 클로로포름으로 헹구고 10μL 및 1mL 밀폐 유리 주사기를 클로로포름으로 씻어내고 전체 주사기 부피를 반복적으로 흡인하여 총 3회 배출합니다.
    주의 : 클로로포름은 휘발성이며 흡입하면 유독 할 수 있습니다. 이 용매를 사용한 모든 작업은 흄 후드에서 수행해야합니다.
  2. 주사기를 사용하여 200μL의 DSPE-mPEG2000(25mg/mL), 6.3μL의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC, 25mg/mL) 및 1mL의 IR 1048(클로로포름에서 1mg/mL)을 둥근 바닥 플라스크에 추가합니다. 스톡의 오염을 방지하기 위해 지질/염료 사이의 주사기를 청소하는 것을 잊지 마십시오.
    알림: 적외선 염료는 빛에 민감하며 작업은 어두운 조건에서 수행하거나 플라스크를 알루미늄 호일로 덮어야합니다.
  3. 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거합니다. 범핑을 방지하기 위해 진공을 332mbar로 천천히 조정하십시오. 5분 후 압력을 42mbar로 낮추어 용액에 들어갔을 수 있는 물을 제거합니다.
    참고: 지질 케이크는 4°C에서 파라필름으로 덮인 둥근 바닥 플라스크에 밤새 보관할 수 있습니다.
  4. 지질 케이크를 1mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 현탁시키고 실온에서 5분 동안 또는 모든 지질 케이크가 현탁되고 용액에 용해될 때까지 초음파 처리 또는 와동합니다. 용액을 균질화하기 위해 추가 2분 동안 초음파 처리하십시오.
  5. 용액을 7mL 유리 바이알에 옮기고 바이알을 얼음으로 채워진 유리 접시에 넣어 용액을 5분 동안 식힌 후 기밀 유리 주사기를 사용하여 50μL의 퍼플루오로헥산을 추가합니다. 주사기를 바이알에 분주하기 전에 퍼플루오로헥산으로 헹구는 것을 잊지 마십시오.
  6. 지질과 얼음 배스가 들어있는 유리 바이알을 프로브 초음파 처리기 인클로저에 넣고 프로브 팁을 미니 커스 아래에 담그십시오. 초음파 처리기 프로브의 측면이 유리 바이알의 입술에 닿지 않는지 확인하십시오.
  7. 프로브는 다음 설정으로 혼합물을 초음파 처리합니다 : 진폭 1, 공정 시간 : 20 초, 펄스 온 : 1 초, 펄스 오프 : 5 초. 그런 다음 다음 설정에서 초음파 처리: 진폭: 50, 프로세스 시간: 5초, 펄스 켜짐: 1초, 펄스 오프: 10초.
  8. 나노 액적 용액을 1.5mL 원심분리 튜브로 옮기고 300 x g 에서 3분 동안 원심분리하여 작은 액적에서 큰 액적(>1μm)을 분리합니다.
  9. 펠릿을 버리고 상청액을 다른 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 3000 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 상청액을 세척하고 용액의 모든 액적을 펠릿화합니다. 펠릿을 위아래로 피펫팅하여 PBS 1mL에 PFCnD를 재현탁한 다음 목욕 초음파 처리기에서 1분 동안 초음파 처리합니다.
  10. 동적 광산란(DLS)을 사용하여 액적의 크기를 측정합니다. 스톡 PFCnD를 100배(PBS 990μL에 PFCnD 스톡 10μL)로 희석하고 측정하기 전에 PFCnD를 분산시키기 위해 배스 초음파 처리합니다. 대표적인 결과를 도 1에 나타내었다.
  11. 나노 입자 추적 분석기를 사용하여 PFCnD의 농도를 결정합니다 ( 재료 표 참조). 농도의 정확한 측정을 보장하기 위해 PFCnD를 100-1000배 희석합니다. 프로토콜은 일반적으로 1010 입자 / mL 정도의 농도로 액적을 생성합니다.
  12. 50mL 원심 분리 튜브에 10mL의 초음파 커플 링 젤을 준비하고 1 % (v / v) 또는 100μL의 PFCnD를 추가하여 ~ 108 입자 / mL의 용액을 만듭니다. 혼합 할 용액을 소용돌이. 혼합물을 4000 x g 에서 3분 동안 원심분리하여 기포를 제거합니다.

2. 폴리아크릴아미드 팬텀 준비

  1. 500mL 진공 플라스크에 400mL의 탈이온수를 채워 물을 탈가스시키고, 고무 코르크로 밀봉하고, 플라스크를 진공 라인에 연결한다. 진공 라인을 열고 플라스크의 바닥을 욕조 초음파 처리기에 담그십시오. 5 분 동안 또는 가스 거품 형성이 보이지 않을 때까지 초음파 처리하십시오.
  2. 탈기 된 물 500mL에 500mg을 용해시켜 10 % 과황산 암모늄 (APS) 용액을 준비합니다. 과황산 암모늄이 완전히 녹지 않으면 용액을 부드럽게 소용돌이 치십시오.
  3. 교반 플레이트에 교반 막대가 있는 400mL 비커에 탈기수 150mL와 40%(w/v) 아크릴아미드-비스아크릴아미드 용액 50mL를 추가하여 10% 아크릴아미드-비스아크릴아미드 용액 200mL를 형성합니다. 기포를 도입하지 않고 적절한 혼합을 허용하도록 혼합물을 200rpm으로 저어줍니다.
    주의 : 아크릴 아마이드는 발암 물질이며, 특히 분말 형태의 아크릴 아마이드로 작업하는 경우 모든 작업은 장갑이 달린 흄 후드에서 수행해야합니다.
  4. 실리카 400mg을 칭량하여 2.3단계의 10% 아크릴아미드-비스아크릴아미드 용액에 첨가하여 0.2%(w/v)의 실리카 및 아크릴아미드 용액을 형성합니다.
    주의 : 흡입시 실리카는 발암 물질이 될 수 있습니다. 계량을 포함한 모든 작업은 흄 후드에서 수행해야 합니다.
  5. 플라스틱 이송 피펫에서 팁을 잘라 실험실 테이프로 금형에 지지하여 원통형 포함물이 있는 58mm x 58mm x 78mm 정사각형 금형을 준비합니다. 그림 2를 참조합니다.
  6. 비커에 10% APS 용액 2mL를 추가하여 최종 농도 0.1% APS가 되도록 하고 팬텀 용액에 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED) 250μL를 추가합니다. 용액을 짧게 저어줍니다(1분 미만).
  7. 용액에 기포가 유입되지 않도록 주의하면서 용액을 몰드에 빠르게 붓습니다. 용액은 10 분 이내에 중합되어야합니다. 실험실 주걱의 평평한 끝을 금형 가장자리에 돌리고 금형을 뒤집어 팬텀을 제거합니다.
    알림: 이 팬텀은 여러 번 재사용할 수 있으므로 물에 담그고 4°C에서 보관해야 합니다.

3. 퍼플루오로카본 나노방울 이미징

  1. 제조업체 지침에 따라 펄스 레이저 시스템을 켜고 ~20분 동안 예열합니다. 광섬유 번들이 레이저 출력에 제대로 연결되어 있고 두 다리가 광섬유 번들 홀더 내에 올바르게 배치되었는지 확인하십시오.
  2. 초음파 이미징 시스템을 켜고 어레이 이미징 변환기(L11-4v)를 시스템에 연결하고 홀더 내부에 변환기를 고정하여 이미징 평면을 레이저 단면에 맞춥니다.
  3. 레이저 시스템의 펄스 반복 주파수를 10Hz로 설정하고 광섬유 다발 끝에 파워미터를 배치하여 에너지를 측정합니다. 추정된 플루언스가 70mJ/cm2가 될 때까지 q-스위치 지연을 조정합니다.
    주의 : 레이저를 발사 할 때는 적절한 안경을 착용해야하며 레이저 커튼은 공간을 둘러 쌉니다.
  4. 1mL 플라스틱 슬립 팁 주사기를 사용하여 폴리아크릴아미드 팬텀의 채널 중 하나를 초음파 젤/PFCnD 혼합물로 채우십시오. 채널 상단을 초음파 젤로 자유롭게 덮고 1mL 플라스틱 슬립 팁 주사기로 기포를 제거합니다. 그림 3과 같이 폴리아크릴아미드 팬텀을 변환기와 섬유 다발 아래에 놓습니다.
  5. 소프트웨어(20 )에 기초한 결합된 레이저 초음파 및 탄성(CLUE) 이미징 플랫폼을 사용하여 광학 활성화와 동기화된 PFCnD를 이미징한다. 이미징을 위한 Param 구조에서 일반 사용자 정의 매개변수를 변경합니다: 시작/끝 깊이를 0/40mm로, 중심 주파수를 6.9MHz로, 변환기 이름을 'L11-4v'로 설정합니다.
  6. 새로운 RunCase 를 정의하고 반복적인 광학 활성화/재축합 및 PFHnD의 US 이미징을 위한 모듈 시퀀스를 설계합니다. 이는 초고속 이미징(mUF), 외부 레이저(mExtLaser) 및 유휴(mIdle)와 같은 사전 정의된 모듈을 나열하여 수행됩니다.
    1. 시퀀스 세트 mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF 를 두 번 반복하여 n-펄스 및 p-펄스 이미징 데이터를 모두 획득합니다.
      참고: 각 시퀀스의 첫 번째 mExtLaser 모듈은 ExtLaser.Enable 을 0으로 설정하여 가짜 레이저로 설정되고 레이저 활성화 후 배경 미국 이미지와 n/p 펄스 미국 이미지 사이의 시간을 최소화하기 위해 'mIdle'이 포함됩니다.
  7. 현재 실행 사례의 모듈 시퀀스에 배치된 각 모듈에 대한 모듈 매개 변수를 설정합니다. 모듈 시퀀스의 순서에 해당하는 인덱스로 각 모듈 매개 변수에 액세스합니다. 모듈은 사용자가 여기에 설정 한 모듈 매개 변수로 미리 정의 된 작업을 실행합니다.
    1. 외부 레이저 모듈의 ExtLaser.QSdelay 를 3.3단계에서 조정한 레이저 Q-스위치 지연 값(마이크로초)으로 설정합니다. 이 모듈은 레이저 시스템의 플래시 램프 트리거가 꺼질 때까지 기다렸다가 QSdelay에 지정된 지연 후에 Q-스위치 트리거를 생성합니다.
    2. 초고속 이미징 모듈에서 Resource.numFrame 을 100으로 설정하고, SeqControl.PRI 를 200(μs)으로 설정하고, TW.극성 을 P 펄스의 경우 1로, N 펄스의 경우 -1로 설정합니다(해당 펄스 모양은 그림 4 참조). 이 모듈은 TW.polarity에 지정된 펄스 유형으로 초고속 0도 평면파를 전송합니다.
      1. SeqControl.PRI의 펄스 반복 간격인 Resource.numFrame에서 프레임 수에 대해 38.8mm 너비의 전체 조리개 이미징 창을 획득한 다음 오프라인 처리를 위해 데이터를 저장합니다.
    3. 유휴 모듈의 SeqControl.lastPRI_Module 레이저 펄스 사이의 시간 길이(100ms)에서 Q-스위치 지연, 이미징 데이터 수집 시간(20ms) 및 신호가 이동하는 20μs 여유를 뺀 값으로 설정합니다. 이 모듈은 이미징 데이터 수집 종료와 다음 레이저 펄스 여기 사이의 시간 간격을 채우기 위해 SeqControl.lastPRI_Module 시간 동안 시스템을 '작동 없음' 상태로 유지합니다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PFCnD의 성공적인 포뮬레이션 및 원심 분리는 직경 200-300nm 크기의 액적을 생성해야 합니다(그림 1A). 부적절하게 분리된 액적은 약 1μm의 작은 피크를 보일 수 있습니다. 이러한 용액은 더 큰 물방울을 분해하기 위해 더 많은 욕조를 초음파 처리 할 수 있습니다. 액적의 크기는 Ostwald 숙성21,22로 알려진 과정에서 유착 및/또는 확산으로 인해 시간이 지남에 따라 증가합니다(그림 1B).

이미징 펄스를 조작하여 액적의 음향 변조는 기화된 PFCnD의 대비를 개선했습니다. 이것은 빔 포밍 이미지의 인접한 프레임을 빼서 재구성 된 PFCnD 이미지에서 입증되었으므로 기화 된 PFCnD에서 반환 된 신호 만 보이고 고정 된 배경 신호는 억제됩니다. 콘트라스...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

프로브 초음파 처리는 PFCnD를 제조하는 비교적 간단하고 배우기 쉬운 방법입니다. 주의를 기울여야 할 몇 가지 단계가 있습니다. 클로로포름을 취급할 때는 휘발성이고 표준 공기 변위 피펫에서 "누출"되므로 용적형 피펫 또는 유리 주사기를 사용해야 합니다. 또한 정변위를 사용하는 경우 클로로포름이 대부분의 플라스틱 팁을 용해시켜 용액에 오염 물질을 유입시킬 수 있으므로 적절한 팁을 사용해야 합니다. 용적형 피펫 또는 유리 주사기는 퍼플루오로헥산에도 권장되는데, 이는 퍼플루오로헥산이 물보다 휘발성이고 밀도가 높기 때문입니다. 일반적으로 휘발성 및 고밀도의 개별 효과는 공기 변위 피펫에서 사전 습윤하고 스케일을 사용하여 피펫에 설정된 부피를 조정함으로써 각각 줄일 수 있습니다. 그러나 두 가지 특성을 모두 가진 퍼플루오로헥산의 경우 휘발성으로 인해 정확한 중량 측정을 얻기 어려워 용적식 피펫/유리 주사기가 가장 실행 가능한 옵션입니다.

프로브 용액을 초음파 처리하기 전에 지질과 퍼플루...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 BCRF-20-043 보조금으로 유방암 연구 재단에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
과황산 암모늄 (APS)VWR97064-592
1,2- 디스테아로 일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 콜린 (DSPC)Avanti Polar Lipids850365C지질, 이들은 클로로포름 또는 분말 형태로 현탁 구입할 수 있습니다. 장기 보관의 경우 분말 형태가 가장 좋지만 클로로포름이 더 실용적입니다.
1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](암모늄염) (DSPE-PEG)Avanti Polar Lipids880120C지질은 클로로포름 또는 분말 형태로 현탁하여 구입할 수 있습니다. 장기 보관의 경우 분말 형태가 가장 좋지만 클로로포름이 더 실용적입니다.
아크릴 아미드 : Bisacrylamide 용액 (19 : 1) 40 % (w / v), OmniPur®VWREM-1300아크릴아미드 용액, 저농도/ 분말
IR-1048시그마405175적외선 염료
L11-4vVerasonics-초음파 선형 어레이 트랜스듀서
Microtip 1/8"Qsonica LLC4418마이크로팁 프로브 초음파 발생기
N, N, N′, N′ -테트라메틸에틸렌디아민 (TEMED)VWR97064-902과황산암모늄의 존재 하에서 자유 라디칼을 형성하여 폴리아크릴아미드를 중합하는 데 사용
Nova IIOphir-Spiricon7Z01550레이저 파워 미터
과불화헥산플루오롬APF-60M과불화탄소 액체
인산염 완충 식염수(PBS) 정제VWR97062-732
Q500Qsonica LLC를 만드는 데 사용Q500-110프로브 초음파 발생기
실리카겔Sigma-Aldrich2885002-25 μ m 입자 크기
Tempest 30New waveresearch-Pulsedlaser system
Vantage 128Verasonics-researchultrasonic imaging system
Zetasizer Nano ZSMalvern Instruments Ltd-dynamiclight scattering을 기반으로 크기 측정
PBS

References

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