방법 논문

광유전학 적 TAEL/C120 시스템을 사용하여 제브라피시 배아에서 빛 유발 GFP 발현

DOI:

10.3791/62818

⸱

2021년 8월 19일

 , 
1Department of Molecular Cell Biology, University of California

이 논문에서

요약

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광유전학은 광범위한 응용 프로그램을 가진 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 청색 광 반응 TAEL/C120 시스템을 사용하여 제브라피시 배아에서 빛을 유도할 수 없는 유전자 발현을 달성하는 방법을 보여줍니다.

초록

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유도 성 유전자 발현 시스템은 생물학적 과정을 연구하기위한 귀중한 도구입니다. 광유전학 적 발현 시스템은 유도제로 빛을 사용하여 유전자 발현 타이밍, 위치 및 진폭에 대한 정밀한 제어를 제공 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 광유전학 발현 시스템은 제브라피시 배아에서 빛을 유도할 수 없는 유전자 발현을 달성하기 위하여 이용됩니다. 이 시스템은 박테리아 E. litoralis에서자연적으로 발생하는 빛 활성화 전사 인자를 기반으로 TAEL이라는 엔지니어링 전사 인자에 의존한다. 파란색 광으로 조명되면 TAEL은 C120이라는 코그네이트 규제 요소에 팽창하고 전사를 활성화합니다. 이 프로토콜은 유비쿼터스 유브 프로모터의 통제 하에 TAEL 전사 인자를 표현하는 형질전환 제브라피시 배아를 사용합니다. 동시에, C120 조절 원소는 형광 기자 유전자(GFP)의 발현을 구동한다. 간단한 LED 패널을 사용하여 활성화된 청색광을 전달하며, GFP 발현의 유도는 30분 후에 먼저 검출될 수 있으며 3시간 이상의 광처리 후 130배 이상의 유도에 도달할 수 있다. 발현 유도는 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR) 및 형광 현미경 검사법에 의해 평가될 수 있다. 이 방법은 광유전학 유전자 발현을 위한 다재다능하고 사용하기 쉬운 접근법입니다.

서론

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유도 성 유전자 발현 시스템은 유전자 발현의 양, 타이밍 및 위치를 제어하는 데 도움이됩니다. 그러나, 다세포 유기체에 있는 정확한 공간 및 측두색 통제를 달성하는 것은 도전적이고 있습니다. 측두성 조절은 가장 일반적으로 소분자 화합물 을 첨가하여 달성1 또는 열 충격 프로모터2의 활성화. 여전히 두 가지 접근 방식은 타이밍, 유도 강도 및 오프 타겟 스트레스 응답 문제에 취약합니다. 공간 제어는 주로 조직 별 발기인3의사용에 의해 달성되지만,이 방법은 항상 사용할 수없는 적합한 프로모터 또는 규제 요소를 필요로하며, 하위 조직 수준 유도에 도움이되지 않습니다.

이러한 종래의 접근법과는 달리, 빛 활성화된 광유전적 전사 활성제는 유전자 발현4의더 미세한 공간 및 측두각 제어를 위한 잠재력을 갖는다. 파란색 광 반응형 TAEL/C120 시스템은 제브라피시 배아5,6에서사용하도록 개발및 최적화되었다. 본 시스템은 박테리아 E. 리토랄리스

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프로토콜

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이 연구는 캘리포니아 메르세데스 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 승인으로 수행되었습니다.

1. 제브라피시 횡단 및 배아 수집

  1. TAEL 전사 활성제 또는 C120 대조 기자 유전자를 포함하는 별도의 형질전환 제브라피시 라인을 유지하여 스퓨리어스 활성화를 최소화한다.
  2. 표준 방법9를 사용하여 각 라인에서 6-8 성인 제브라피쉬를 교차하여 TAEL 및 C120성분(도 1B)을모두 포함하는 이중 형질전환 배아를 생성한다.
    참고: 대안적으로, 두 성분 모두 표준방법(10)을사용하여 mRNA 또는 플라스미드 DNA의 미세 주입을 통해 과도하게 발현될 수 있다.
  3. 달걀 물(증류수에 용해된 60 μg/mL 인스턴트 오션 바다 소금)이 함유된 페트리 접시에 배아를 수집하며, 조건당 약 30개의 배아를 테스트합니다.
  4. 주변 광에 의한 의도하지 않은 활성화를 최소화하기 위해 광루프 상자 또는 알루미늄 호일로 덮어 놓습니다(표 1참조).

2. 글로....

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결과

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이 데모에서는 C120 반응형 GFP 리포터라인(Tg(C120F:GFP)ucm107)이 유비퀴틴 b(ubb)프로모터(Tg(ubb:TAEL-N)ucm113)로부터타엘-N 유비쿼터스를 발현하는 형질선과 교차하여 이중 암분요소를 함유하고 있다. 24h 후 수정, 배아는 청색광을 활성화하기 위해 노출되었고, 1h on/1 hoff의 주파수로 펄스되었다. GFP 발현의 유도는 qRT-PCR에 의해 30분, 1h, 3h 및 6h 사후활성화(도 2B 및 표 1)로정량화되었다. 대조군 형제 배아가 어둠 속에서 유지됨에 비해, GFP 발현의 유도는 청색광 노출 후 30분 즉시 검출되었다. 그런 다음 GFP 발현 의 수준은 활성화 후 6 시간까지 꾸준히 증가했습니다.

GFP 유도는 또한 활성화 후

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토론

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이 프로토콜은 청색 광 유도성 유전자 발현을 달성하기 위하여 광유전학 TAEL/C120 시스템의 사용을 기술합니다. 이 시스템은 발광시 블루라이트로 이산화하고 C120 조절 요소의 하류에 대한 관심 유전자의 전사를 활성화하는 전사 활성제 인 TAEL로 구성됩니다. GFP 리포터의 유도된 발현은 30분 에 불과한 빛 노출 후에 검출될 수 있으며, 이는 이 접근법이 상대적으로 빠르고 반응성이 뛰어난 운동학을 가지고 있음을 시사한다.

몇몇 요인은 유도 수준에 영향을 미칠 수 있습니다. 가장 중요한 것은 빛을 활성화시키는 파장과 힘입니다. 이 프로토콜에서는 1.5W/cm2에서 전달된 465nm LED 조명이 사용되었습니다. 파장이 짧고 길어지고(각각 보라색과 녹색 광)와 낮은 광전력은 발현을 효과적으로 활성화하지 못한다(데이터가 표시되지 않음). 다른 한편으로는, 더 많은 빛 힘은 배아를 손상의 리스크를 증가시킵니다. 따라서, TAEL 시스템의 성공적인 사용을 위해서.......

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공개 사항

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이해 상충이 선언되지 않았습니다.

감사의 글

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우리는 스테판 Materna와 이 프로토콜에 대한 유용한 제안과 의견에 대한 우와 마테나 연구소의 구성원에게 감사드립니다. 이 프로토콜을 개발하면서 안나 리드, 케빈 가드너, 로라 모타 메나에게 귀중한 토론과 통찰력을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 국립 보건원 (NIH)의 보조금에 의해 지원되었다; R03 DK106358) 및 캘리포니아 대학 암 연구 조정 위원회 (CRN-20-636896) S.W.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
BioRender 웹 기반 과학 일러스트레이션 도구BioRenderhttps://biorender.com/
Color CCD 디지털 카메라Lumenara755-107
컴팩트 파워 및 에너지 미터 콘솔, 디지털 4" LCDThorlabsPM100D
여기 필터, 545nmOlympusET545/25x
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트리카인(에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트)시그마-알드리치E10521
X-Cite 120 형광 LED 광원Excelitas010-00326R단종 X-Cite mini+로 대체되었습니다.

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
  2. Halloran, M. C., et al.

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재인쇄 및 허가

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Optogenetic Gene ExpressionLight Induced ExpressionZebrafish EmbryosTAEL C120 SystemGFP ExpressionBlue Light ActivationFluorescence MicroscopyQuantitative PCRInducible Expression SystemTransgenic Zebrafish

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