이 작업은 면역 조직 화학을위한 합성 항원 대조군을 만드는 간단한 방법을 문서화합니다. 이 기술은 광범위한 농도에서 다양한 항원에 적응할 수 있다. 샘플은 인트라 및 인터-어세이 성능 및 재현성을 평가하기 위한 참조를 제공한다.
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이 논문에서
요약
초록
면역조직화학(IHC) 분석은 단백질 발현 패턴에 대한 귀중한 통찰력을 제공하며, 이에 대한 신뢰할 수 있는 해석은 잘 특성화된 양성 및 음성 대조군 샘플을 필요로 합니다. 적절한 조직 또는 세포주 조절이 항상 이용 가능한 것은 아니기 때문에, 합성 IHC 대조군을 생성하는 간단한 방법이 유익할 수 있다. 이러한 방법은 여기에 설명되어 있습니다. 단백질, 펩티드 또는 올리고뉴클레오티드를 포함한 다양한 항원 유형에 광범위한 농도로 적응할 수 있다. 이 프로토콜은 다양한 진단적 관련 항체에 의해 인식되는 인간 적혈구 종양유전자 B2 (ERBB2/HER2) 세포내 도메인 (ICD)으로부터의 펩티드를 예로서 사용하여 합성 항원 조절을 생성하는 데 필요한 단계를 설명한다. 소 혈청 알부민 (BSA) 용액에서 HER2 ICD 펩티드의 연속 희석물을 포름알데히드와 혼합하고 85°C에서 10분 동안 가열하여 펩티드/BSA 혼합물을 응고시키고 가교시킨다. 생성된 겔은 조직처럼 처리, 절편화 및 염색될 수 있고, 광범위한 염색 강도에 걸쳐 공지된 항원 농도의 일련의 샘플을 산출한다.
이 간단한 프로토콜은 일상적인 조직학 실험실 절차와 일치합니다. 상기 방법은 단지 사용자가 원하는 항원의 충분한 양을 가질 것을 요구한다. 관련 에피토프를 인코딩하는 재조합 단백질, 단백질 도메인, 또는 선형 펩티드는 국부적으로 또는 상업적으로 합성될 수 있다. 사내 항체를 생성하는 실험실은 합성 대조군 표적으로서 면역화 항원의 분취량을 예비할 수 있다. 광범위한 농도에 걸쳐 잘 정의된 양성 대조군을 만들 수 있는 기회를 통해 사용자는 실험실 내 및 실험실 간 분석 성능을 평가하고, 분석의 동적 범위와 선형성에 대한 통찰력을 얻고, 특정 실험 목표에 맞게 분석 조건을 최적화할 수 있습니다.
서론
면역조직화학(IHC)은 포르말린-고정, 파라핀 포매(FFPE) 조직 절편에서 표적 항원의 민감하고 특이적이며 공간적으로 정밀한 검출을 가능하게 한다. 그러나, IHC 염색 결과는 온온 및 냉 허혈 시간, 조직 고정, 조직 전처리, 항체 반응성 및 농도, 분석 검출 화학, 및 반응 시간1을 포함하는 다수의 변수에 의해 영향을 받을 수 있다. 따라서, IHC 반응의 재현 가능한 성능 및 해석은 이들 변수의 엄격한 제어와 잘 특성화된 양성 및 음성 대조군 샘플의 사용을 필요로 한다. 자주 사용되는 대조군에는 관심 항원을 발현하는 독립적인 분석으로부터 공지된 파라핀 포매된 조직 또는 배양된 세포주가 포함되지만, 이러한 샘플이 항상 이용가능한 것은 아니다1. 더욱이, 조직 및 세포주 조절에서 표적 항원의 발현 수준은 일반적으로 단지 정성적으로만 이해되고 가변적일 수 있다. 재현 가능하고 정확하게 알려진 표적 항원 농도를 함유하는 대조군은 IHC 반응 조건의 최적화를 보조할 수 있다. 합성 IHC 대조군 샘플을 생성하기 위해 생리학적으로 관련된 농도 범위에서 다양한 항원 유형에 적응할 수 있는 일반적인 방법이 저자2에 의해 기술되었다. 이러한 유형의 표준을 만들고 사용하기 위....
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프로토콜
1. 원액 및 도구의 준비
- 50 mL 원뿔형 튜브에서 5 mL의 PBS, pH 7.2의 5 mL BSA 분말을 혼합하여 25% w/v BSA 용액 20 mL를 고르게 분산시킬 때까지 준비한다. BSA 분말을 분산시키기 위해 필요에 따라 소용돌이.
- 완전한 용해를 허용하도록 용액을 4°C에서 하룻밤 동안 유지한다. PBS로 최종 부피를 20 mL로 조정하여 25% w/v 원액을 만든다.
- 6.26 g BSA 분말을 PBS 13 mL에 혼합하고, pH 7.2를 50 mL 원뿔형 튜브에 혼합하여 31.3% w/v BSA 용액 20 mL를 고르게 분산시킬 때까지 준비한다. 완전한 용해를 허용하도록 용액을 4°C에서 하룻밤 동안 유지한다. PBS로 최종 부피를 20 mL로 조정하여 31.3% w/v 원액을 만든다.
- 열 블록을 85°C로 예열합니다.
참고: 아래 프로토콜은 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 형성된 1.26-1.4mL의 부피를 가진 펩티드/BSA 젤을 생성합니다. 더 작은 부피를 사용하기 위해, 예를 들어, 항원 재고가 제한될 때, PCR 튜브에서 겔을 제조하고 열 블록으로서 85°C로 설정된 열사이클러를 사용한다. - BSA/포름알데히드 혼합물이 25% BSA 용액 700μL와 37....
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결과
펩티드는 실온에서 적절한 용매에 전적으로 용해되어 광학적으로 투명한 용액을 형성해야 한다. 가시적 미립자 물질이 30-60분 후에도 여전히 존재하는 경우, 표 1에서 계산된 5x 펩티드 원액의 의도된 부피를 초과하지 않는 원래의 용매 또는 대체 용매의 추가 부피를 첨가하는 것이 도움이 될 수 있다. 마찬가지로 결합된 펩티드/BSA 용액은 반투명하게 유지되어야 합니다(그림 1A).
펩티드/BSA 겔 샘플은 37% 포름알데히드로 가열한 후 불투명한 고무 덩어리를 형성해야 합니다(그림 1B-I). 겔 샘플의 경미한 파쇄는 마이크로원심분리 튜브로부터 제거하는 동안 발생할 수 있다(도 3A). 이것들은 후속 단계를 방해해서는 안됩니다. 파라.......
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토론
이 방법을 통해 사용자는 대부분의 조직학 실험실에 익숙한 재료 및 기술을 사용하여 IHC 반응의 표준으로 알려진 조성 및 항원 농도의 균일 한 샘플을 만들 수 있습니다. 가장 중요한 단계는 관심있는 항체가 결합하는 에피토프를 확인하는 것이다. 이 프로토콜은 ERBB2/HER2 ICD로부터의 선형 펩티드 항원을 사용하는 것을 기술한다. 동일한 프로토콜이 올리고뉴클레오티드, 형광 표지, 단백질 도메인, 또는 전장 단백질을 함유하는 BSA 겔을 형성하는데 사용될 수 있다. 이러한 후자의 접근법은 단일 선형 펩티드 서열에 의해 재생성되지 않는 형태적 에피토프에 결합하는 항체에 도움이 될 수 있다. 예를 들어, 마우스, 래트 및 토끼의 0.1 mg/mL 순진한 IgG를 함유하는 BSA 겔 표준은 이차 검출 및 염색 단계가 예상대로 작동하였음을 확인하기 위한 공정 대조군으로 사용될 수 있다.
여기에 기재된 항원-BSA 겔 방법은 IHC 반응을 제어하고 표준화하기 위한 다른 기술을 보완한다........
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공개 사항
Charles A. Havnar, Kathy J. Hötzel, Charles A. Jones, Carmina M. Espiritu, Linda K. Rangell 및 Franklin V. Peale은 Genentech와 Roche의 직원 및 주주입니다. 그들의 계열사는이 연구에 사용 된 시약 및 도구를 생산합니다.
감사의 글
저자들은 펩티드 합성을 위한 제프리 톰과 아이민 송, TMA 구축을 위한 Nianfeng Ge, IHC 염색을 위한 Shari Lau, 디지털 현미경 스캐닝을 위한 Melissa Edick, 디지털 이미지 정량화를 위한 Hai Ngu를 감사하게 여긴다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Anti-HER2/neu clone 4B5 | Ventana | 5278368001 | |
| Biopsy Wraps | Leica | 3801090 | |
| Bovine Serum Albumin, ultra pure | Cell Signaling Technology | BSA #9998 | |
| 50 mL 원뿔 | 튜브 Corning | 352070 | |
| 일회용 베이스 몰드 (15 mm x 15 mm) | Fisher | 22-363-553 | |
| 일회용 베이스 몰드 (24 mm x 24 mm) | Fisher | 22-363-554 | |
| 일회용 주걱 | VWR | 80081-188 | |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22331 | |
| 37% 포름알데히드 | 전자 현미경 과학 | 15686 | |
| ERBB2 / HER2 펩타이드 | UniProt P04626-1; a.a. 1240-55 | ||
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | |
| Magnetic Stir Bar | |||
| NanoZoomer 2.0 HT 전체 슬라이드 이미저 | Hamamatsu | ||
| 10% 중성 완충 포르말린 | VWR | 16004-128 | |
| 뉴클레아제가 없는 마이크로퓨지 튜브 1.5mL | |||
| 파라플라스트 파라핀 | Leica | 39601006 | |
| 펩타이드 매개변수 계산기 | Pep-Calc17 | https://www.pep-calc.com/ | |
| 펩타이드 공급업체 | ABclonal Science | 사용자는 질량, 순도 및 비용에 대한 자세한 내용은 펩타이드 공급업체에 문의해야 합니다. | |
| Anaspec 펩타이드 | 사용자는 질량, 순도 및 비용에 대한 자세한 내용을 위해 펩타이드 공급업체에 문의해야 합니다. | ||
| CPC Scientific | 사용자는 질량, 순도 및 비용에 대한 자세한 내용은 펩타이드 공급업체에 문의해야 합니다. | ||
| 뉴잉글랜드 펩티드 | 사용자는 질량, 순도 및 비용에 대한 자세한 내용은 펩타이드 공급업체에 문의해야 합니다. | ||
| 인산염 완충 식염수 pH 7.2 | |||
| 시약 알코올 | Thermo Scientific | 9111 | |
| Single Edge Razor | VWR | 55411-050 | |
| Superfrost Plus 양전하 현미경 슬라이드 | Thermo Scientific | 6776214 | |
| TMA Tissue Grand Master | 3DHISTECH | ||
| Xylenes | VWR | 89370-088 |
참고문헌
- Torlakovic, E. E., et al. Standardization of positive controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the International Ad Hoc Expert Committee. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 23 (1), 1-18 (2015).
- Hötzel, K. J., et al.
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재인쇄 및 허가
