멀티웰 마이크로플레이트를 사용하는 자동화된 해석은 단일 실험에서 다양한 조건의 평가를 허용함으로써 경로 조절기관을 식별하는 데 유리한 접근 방식입니다. 여기에서는 잘 확립된 매크로피노솜 이미징 및 정량화 프로토콜을 96웰 마이크로플레이트 형식으로 조정했으며 멀티 모드 플레이트 판독기를 사용하여 자동화를 위한 포괄적인 개요를 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
Macropinocytosis는 세포가 대량 내세포증을 통해 단백질, 병원균 및 세포 파편과 같은 큰 세포외 화물을 내면화할 수 있는 비특이적 유체 상 섭취 경로입니다. 이 통로는 면역 반응과 암 세포 대사의 조절을 포함하여 다양한 세포 프로세스에서 필수적인 역할을 합니다. 생물학적 기능에 있는 이 중요성을 감안할 때, 세포 배양 조건을 검토하는 것은 이 통로의 레귤레이터를 확인하고 새로운 치료 접근의 발견에 이용될 조건을 최적화해서 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다. 이 연구는 부착 된 세포에서 매크로 피노키틱 인덱스의 신속한 정량화를 위한 표준 실험실 장비 및 세포 이미징 다중 모드 플레이트 리더를 사용하여 자동화 된 이미징 및 분석 기술을 설명합니다. 자동화된 방법은 고분자 형광 dextran의 섭취를 기반으로 하며 유리 커버립에 장착된 하나의 실험 또는 고정 샘플에서 여러 조건의 평가를 용이하게 하기 위해 96웰 마이크로플레이트에 적용할 수 있다. 이 방법은 재현성을 극대화하고 실험적 변화를 줄이는 동시에 시간 절약과 비용 효율적인 방식을 목표로 합니다.
서론
macropinocytosis의 비 특이적 내세포 통로는 세포세포 액체와 그 성분의 대량 섭취를 통해 영양분, 단백질, 항원 및 병원균을 포함한 다양한 세포 외 구성 요소를 내면화 할 수 있습니다1. 수많은 세포 모형의 생물학을 위해 중요하더라도, 점점, macropinocytosis 통로는 종양 생물학에 있는 필수적인 역할을 하기 위하여 기술됩니다, 여기서, 대식세포 섭취를 통해, 종양 세포는 영양 고갈된 microenvironment2의 존재에서 생존하고 증식할 수 있습니다2,3. 알부민 및 세포 외 매트릭스및 괴사 세포 파편을 포함한 세포 외 거대 분자의 섭취는 거형 및 리소솜 및 리소성 융합 매개화물 이화 이화증4,5,6,7,8을 통해 아미노산, 설탕, 지질 및 뉴클레오티드를 생성하여 바이오매스 생산을위한 대체 영양소 소스를 제공합니다.
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프로토콜
1. 재료 의 준비
- 20 mg/mL 용액을 얻기 위해 PBS에서 FITC 또는 테트라메틸lr호다민(TMR)으로 표시된 70kDa dextran을 용해하십시오. 알리쿼트를 -20°C에 저장합니다.
- ddH2O에 DAPI를 용해하여 1 mg/mL 용액을 얻습니다. 알리쿼트를 -20°C에 저장합니다.
주의: DAPI는 잠재적인 발암물질이며 신중하게 처리되어야 합니다. - 고정 당일 PBS에서 3.7% ACS 등급 포름알데히드를 준비합니다.
주의: 포름알데히드는 고정성, 알려진 발암물질이며 흡입시 독성이 있습니다. 흡입을 피하고 조심스럽게 처리하기 위해 화학 연기 후드의 용액을 만드십시오. - 산세척 커버립을 준비합니다.
- 500mL 비커와 수조를 사용하여 직경 12mm의 보로실리케이트 유리 커버립 28g과 1M HCl의 100mL에서 56°C에서 24시간 동안 1.5g의 두께를 가열하여 광범위한 증발을 피하기 위해 플라스틱 랩으로 비커를 밀봉하십시오.
주의: HCl은 부식성이 높고 따라서 흡입을 피하기 위해 화학 연기 후드에 사용되어야하는 강한 산입니다. - 커버립을 증류수로 씻으시다. 워시를 4번 반복합니다. 그런 다음 커버립을 95% 에탄올로 씻습니다. 워시를 4번 반....
- 500mL 비커와 수조를 사용하여 직경 12mm의 보로실리케이트 유리 커버립 28g과 1M HCl의 100mL에서 56°C에서 24시간 동안 1.5g의 두께를 가열하여 광범위한 증발을 피하기 위해 플라스틱 랩으로 비커를 밀봉하십시오.
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결과
전술한 프로토콜의 단계 및 조정이 그에 따라 따를 때, 최종 실험 결과는 연구된 세포 배양 조건 또는 억제제가 관심 있는 세포주에서 거체피노세포증을 유도하거나 감소시키는지에 대한 정보를 제공해야 한다. 이러한 발견의 타당성을 강화하기 위해 제어 조건을 포함하면 실험이 성공적으로 완료되었는지 여부를 결정할 수 있습니다. 매크로피노세포증 유도 컨트롤은 상대적인 수준의 대시노세포증에 대한 정보를 제공합니다. 이러한 목적을 위해, 리간드 EGF는 가장 일반적으로 사용13. AsPC-1 PDAC 세포에서, Dextran을 추가하기 전에 5 분 동안 100 ng/mL에서 EGF를 첨가하면 거시피노키토시스가 활성화됩니다(그림 5A). 더욱이, 대식세포증의 자가크림 EGF 활성화는 16-24h(도 5A)에 대한 글루타민세포를 박탈함으로써 유도될 수 있다. 대안적으로, 다른 유도자는 세포 유형 및.......
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토론
실험 및 데이터 수집의 품질은 시약의 품질, 설정 최적화 및 커버립 및 마이크로 플레이트의 청결에 따라 크게 달라집니다. 최종 결과는 복제 간에 최소한의 변형을 제공해야 합니다. 그러나 생물학적 변이는 자연적으로 발생하거나 여러 가지 요인에 의해 발생할 수 있습니다. 세포 밀도는 세포가 거시세포증 유도제 또는 억제제에 다소 반응하도록 원인이 될 수 있다. 따라서 프로토콜에서 제안된 80%의 수렴을 준수하는 것이 중요합니다. 또는 마이크로 플레이트 제조업체가 미디어 증발이 96웰 마이크로 플레이트에서 발생한다는 것을 잘 문서화합니다. 여기서, 외부 우물은 내부 우물에 비해 더 많은 증발의 대상이 되며, 이로 인해 대식세포증에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 해석에 외부 우물을 포함하지 않고 대신 PBS로 이러한 우물을 채우기 위해 내부 유정을 광범위한 증발으로부터 보호하기 위해 '버퍼 월'을 구축할 수 있도록 선택할 수 있다.
각 조건에 대한 이미지를 시각적으로 검사하여 획득이 성.......
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공개 사항
C.C.'암 진단, 치료제 및 약물 발견'이라는 제목의 특허의 발명가입니다.' 특허 번호: 9,983,194.
감사의 글
이 작품은 NIH/NCI 보조금(R01CA207189, R21CA243701)이 C.C KMO.G.에 지원하여 TRDRP 박사 후 펠로우십 어워드(T30FT0952)의 수상자입니다. BioTek Cytation 5는 NCI 암 센터 지원 보조금 (P30 CA030199)으로부터 재정 지원을받는 샌포드 번햄 프리비스 세포 이미징 코어의 일부입니다. 그림 1-3은 BioRender를 사용하여 만들어졌습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 칼슘, 마그네슘 및 중탄산나트륨이 없는 HBSS의 | 0.25% 트립신 | 코닝 | 25053CI |
| 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브 | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 10cm 조직 배양 접시 | Greiner Bio-One | 664160 | CELLSTAR |
| 15mL 원심분리기 튜브 | Fisherbrand | 07-200-886 | |
| 2L 비커 | Fisherbrand | 02-591-33 | |
| 24웰 조직 배양 플레이트 | Greiner Bio-One | 662160 | CELLSTAR |
| 25mL 시약 저장소 | Genesee Scientific Corporation | 28-121 | |
| 500mL 비커 | Fisherbrand02-591-30 | ||
| 6cm 조직 배양 접시 | Greiner Bio-One | 628160 | CELLSTAR |
| 8채널 흡인 어댑터 | Integra 표준 팁용 Biosciences | 155503 | |
| 8채널 흡인 어댑터 | Integra Biosciences | 159024 | |
| 95% 에탄올 | Decon Laboratories Inc | 4355226 | |
| 암모니아 무함유 유리 세정제 | Sparkle | FUN20500CT | |
| Black 96웰 고함량 스크리닝 마이크로플레이트 | PerkinElmer | 6055300 | CellCarrier-96 Ultra |
| 면 팁 애플리케이터 | Fisherbrand | 23-400-101 | |
| Coverslips | Fisherbrand | 12-545-80 | 12mm 직경 |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | CYT5FW | |
| DAPI | Millipore Sigma | 5.08741 | |
| Dextran 70 kDa - FITC | Life Technologies | D1822 | Lysine-fixable |
| Dextran 70 kDa - TMR | Life Technologies | D1819 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D1435 | |
| DPBS | Corning | 21031CV | 칼슘 및 마그네슘 |
| 겸 | 미포함 Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| 포름알데히드, 37% | Ricca Chemical | RSOF0010-250A | ACS 시약 등급 |
| 글리세롤 | 피셔 BioReagents | BP229-1 | |
| 경화 형광 마운팅 미디어 | Agilent Tech | S302380-2 | DAKO |
| Hoechst 33342 | Millipore Sigma | B2261 | |
| 염산 (HCl) | Fisher Chemical | A144-212 | 인증 ACS Plus, 36.5%– 38.0% |
| 보푸라기 없는 와이프 | Kimberly-Clark | 34155 | Kimwipes |
| Miscroscope 슬라이드 | Fisherbrand | 12-544-1 | 프리미엄 평면 유리 |
| 멀티채널 피펫 | Gilson | FA10013 | 8 채널, 0.5– 10 & 마이크로; L |
| 멀티채널 피펫 | Gilson | FA10012 | 12 채널, 20– 200 &마이크로; L |
| 다중 채널 피펫 | Gilson | FA10011 | 8 채널, 20– 200 &마이크로; L |
| Parafilm M | Pechiney | PM996 | |
| 플라스틱 랩 | Kirkland Signature | 208733 | Stretch-Tite |
| 실리콘 절연체 | Grace Bio Labs Inc | 664107 13mm 직경 X 0.8mm 깊이 ID, 25mm X 25mm | |
| 슬라이드 어댑터 | Biotek | 1220548 | |
| 세척 병 | Fisherbrand | FB0340922C |
참고문헌
- Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. Macropinocytosis in different cell types: similarities and differences. Membranes. 10 (8), 21(2020).
- Recouvreux, M. V., Commisso, C. Macropinocytosis: a metabolic adaptation to nutrient stress in cancer. Frontier....
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재인쇄 및 허가
