본 프로토콜은 인공 매체를 사용하여 피어싱 빨아 먹는 곤충으로부터 충분한 타액을 수집하는 방법을 설명합니다. 이것은 곤충 타액을 수집하고 곤충 먹이 기법과 벡터 매개 바이러스 전송에 타액 기능을 연구하기위한 편리한 방법입니다.
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이 논문에서
요약
초록
동아시아에서 농업의 상당한 경제적 손실을 일으키는 쌀 줄무늬 바이러스 (RSV),는 전적으로 숙주 쌀 사이에서 효과적인 전송을위한 곤충 벡터에 의존한다. Laodelphax striatellus (작은 갈색 식물호퍼, SBPH)는 phloem에서 수액을 빨아들이면서 RSV를 수평으로 전송하는 1 차 곤충 벡터입니다. 타액은 곤충의 먹이 행동에 중요한 역할을합니다. 피어싱-빠는 먹이 기법으로 곤충의 타액에 대한 연구에 유용한 편리한 방법이 여기에 설명되어 있습니다. 이 방법에서 곤충은 두 개의 뻗은 파라핀 필름 층 사이에 끼어있는 인공 식단을 먹을 수있었습니다. 타액을 함유한 식단은 매일 수집, 여과, 농축등을 통해 추가 분석을 위해 집중되었다. 마지막으로, 수집된 타액의 질은 단백질 염색 및 면역 블로팅에 의해 검사되었다. 이 방법은 SBPH의 타액에서 RSV 와 무신 과 같은 단백질의 존재를 검출함으로써 예시되었다. 이러한 인공 공급 및 타액 수집 방법은 먹이 행동과 바이러스 전송과 관련된 곤충 타액의 요인에 대한 추가 연구를위한 기초를 마련할 것입니다.
서론
테누이바이러스속의 네거티브 좌초 RNA 바이러스인 쌀줄무늬 바이러스(RSV)는 동아시아1,2,3에서쌀 생산에 심각한 질병을 일으킨다. 감염된 쌀 식물에서 건강한 식물로 RSV를 전송하는 것은 곤충 벡터에 따라 달라집니다, 주로 라오델파엑스 스트트리아텔루스, 이는 지속적인 전파 방식으로 RSV를 전송. SBPH는 RSV 감염 식물에 먹이 후 바이러스를 취득. 곤충 내부에 들어가면 RSV는 먹이기 하루 후 미드구트 상피 세포를 감염시키고 중간 구트 장벽을 통과하여 혈류를 관통합니다. 그 후, RSV는 혈몰리프를 통해 다른 조직으로 퍼지고 전파합니다. 약 10-14일 후의 잠정 기간 후, 침샘 내부의 바이러스는 분비타액을 통해 건강한 숙주 식물로 전염될 수 있으며, SBPH는 플록4,5,6,7,
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프로토콜
1. SBPH 유지 보수
- 실험실의 유리 챔버 당 5-6 쌀(Oryza sativa cv. Nipponbare) 모종유리 인큐베이터 (65 x 200mm)에 viruliferous 및 RSV가없는 SBPH 개인을 후면하십시오. 16h 광/8h 다크 포토기간 하에서 쌀 식물을 25°C로 성장시다.
참고: 비수명과 RSV가 없는 SBPH 개인은 처음에는 중국 장쑤성에서 잡혔습니다. - RSV 리보뉴클레오단백질(RNP)에 대해 제기된 토끼 RSV 특이적 폴리클론 항체(재료표참조)를 가진 점 효소-연결된 면역소벤트 분석(dot-ELISA)에 의해 SBPH에서 RSV를 검출한다.
참고: 높은 자손 감염 효율을 보장하기 위해, viruliferous 여성은 별도로 유지되었고, 그들의 자손의 15%는 RSV 감염을 위해 무작위로 시험되었습니다. dot-ELISA의 세부 사항은 1.3-1.7 단계에 설명되어 있습니다. - 코팅 버퍼 의 20 μL에서 단일 SBPH를 균질화 (0.05 M Na2CO3-NaHCO3,pH 9.5). 나일론 멤브레인에 각각 3 μL을 점(재료 표참조), 실온(RT)에서 멤브레인을 건조시킵니다....
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결과
인공 공급 설치 및 타액 수집의 회로도
도 1A는 타액을 수집하는 먹이 챔버로 사용되는 유리 실린더(15cm x 2.5cm)를 묘사한다. 첫째, SBPH 애벌레는 수집 효율을 향상시키기 위해 몇 시간 동안 굶주린 다음 5 분 동안 냉각하여 고정되었습니다. 곤충이 유리 실린더로 옮겨진 후, 챔버의 두 개의 열린 끝은 뻗은 파라핀 멤브레인으로 덮여 있었다. 한쪽 끝에서, 5% 자당의 200 μL은 파라핀 막의 두 층 사이에 끼어 원래 영역(그림 1B)의약 두 배로 확장되었다. 챔버는 호일로 덮여 있었지만 인공 식단으로 끝은 빛에 노출되었습니다. SBPH는 광로행동을 표시하기 때문에, 끝에 모인 굶주린 곤충은 빛에 노출되어 뻗어 있는 내부 파라핀 멤브레인을 통해 인공 식단 용액에 공급되었다. 이를 바탕으로 타액은 매일 수집된 인공 식단으로 방출될 수 있습니다. 파라필름 다이어트 장치는 매일 새.......
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토론
인공 식단에 곤충의 성공적인 양육은 1962년에 미틀러와 Dadd가 인공 식단29,30을보유하기 위해 파라핀 막 기술을 설명했을 때 처음 보고되었습니다. 그리고이 방법은 곤충 생물학 및 행동의 많은 측면에서 탐구 되었습니다., 예를 들어, 영양소 보충, dsRNA 공급, 그리고 바이러스 수집. 타액 분석의 요구 사항에 따라, 5% 자당은 이 연구에서 SBPH의 타액을 수집하는 일반적인 인공 식단으로 사용됩니다. 성공적인 타액 컬렉션을 위해 몇 가지 중요한 단계는 여기에서 주목할 가치가 있습니다. 첫째, 타액 수집의 효율성을 보장하기 위해 챔버에 도입하기 전에 실험 곤충을 굶주릴 필요가있다. 둘째, 스타일 환경을 모방하기 위해 2 층 파라핀 샌드위치가 만들어집니다. SBPH가 인공 식단에 먹이를 주면, 침액 칼집은 식단을 향한 내부 끝에 형성되며, 물 타액은 이후에 분비됩니다. 셋째, 수집된 시료의 미생물 오염을 줄이기 위해 .......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 중국 국립과학재단(2019YFC1200503호)과 청소년혁신진흥협회 32072385(2021084)가 지원했다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 10-KD 원심 필터 | Merck Millipore | R5PA83496 | For concentration |
| 10x Protein Transfer Buffer(wet) | macGENE | MP008 | Transfer buffer for western blotting |
| 10x TBST buffer | Coolaber | SL1328-500mL× 10 | 웨스턴 블로팅을 위한 |
| 세척 버퍼 Azure c600 바이오시스템 | Azure Biosystems | Azure c600 | 웨스턴 블로팅 및 은 염색을 위한 이미징 시스템 |
| 색상 사전 염색 단백질 래더 | GenStar | M221-01 | 웨스턴 블로팅 ECL을 위한 단백질 마커 |
| ; 웨스턴 블로팅 검출 시약 | GE Healthcare | RPN2209 | 웨스턴 블로팅 검출 |
| Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit | TIANGEN | 발색 반응 | |
| 양 고추 냉이 과산화 효소 접합 염소 안티 토끼 항체 | Sigma | 401393-2ML | 웨스턴 블로팅용 다클론 2차 항체 |
| Immobilon(R)-P 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인 | Merck Millipore | IPVH00010 | 웨스턴 블로팅을 위한 전사 멤브레인 |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR) |
| KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES | Bio-Rad | 1708891 | 역전사 PCR(RT-PCR)용 |
| Millex-GP 필터, 0.22 &마이크로; m | Merck Millipore | SLGP033RB | 여과용 |
| Mini-PROTEAB TGX 젤 | Bio-Rad | 4561043 | SDS-PAGE |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | 단백질 농도 검출 |
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참고문헌
- Cheng, X., Zhu, L., He, G. Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper. Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).
- Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. Current insights into research on Rice Stripe Vir....
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