결핵에 대한 숙주 유도 요법의 전임상 테스트에 사용하기 위한 자동화된 배양 시스템

요약

세포 내 M. 결핵 성장의 신속하고 효율적인 정량화는 결핵(TB)에 대한 개선된 치료법을 추구하는 데 중요합니다 . 이 프로토콜은 후보 숙주 지시 요법으로 처리된 대식세포에서 Mtb 성장을 정량화하기 위해 자동화된 액체 배양 시스템을 사용하는 브로스 기반 비색 검출 분석을 설명합니다.

초록

결핵(TB)의 원인균인 결핵균(Mtb)은 COVID-19가 출현하기 전까지 전 세계적으로 가장 심각한 전염병 사망자였습니다. Mtb는 세포 내 환경에서 지속되고 숙주 방어를 피하며 많은 항 결핵 약물에 대한 내성을 개발하도록 진화했습니다. 내성을 해결하는 한 가지 접근법은 Mtb에 대한 숙주 면역 반응을 증가시키는 기존의 승인 된 약물을 식별하는 것입니다. 그런 다음 이러한 약물을 보조 숙주 유도 요법(HDT)으로 용도를 변경하여 치료 시간을 단축하고 항생제 내성을 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다.

대식세포에서 세포내 Mtb 성장의 정량화는 잠재적인 HDT를 평가하는 중요한 측면입니다. Mtb 성장을 측정하기 위한 황금 표준은 한천 플레이트에서 집락 형성 단위(CFU)를 계산하는 것입니다. 이것은 약물의 신속한 스크리닝에 적합하지 않은 느리고 노동 집약적 인 분석입니다. 이 프로토콜에서는 임상 표본에서 Mtb를 검출하는 데 더 일반적으로 사용되는 자동화된 브로스 기반 배양 시스템이 숙주 지시 요법의 전임상 스크리닝에 맞게 조정되었습니다. HDT로 처리된 대식세포에서 세포내 Mtb 성장을 조사하기 위한 액체 배양 분석 시스템의 용량을 평가하였다. Mtb 성장을 억제하는 능력에 대해 테스트된 HDT는 용액에 담겨 있고 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 미립자와 인터페론-감마와 리네졸리드의 조합으로 캡슐화된 올-트랜스 레티노산(AtRA)이었습니다. CFU 방법에 비해 이 자동화된 액체 배양 기반 기술의 장점은 설정이 간단하고, 노동 집약적인 준비가 적고, 결과 도출 시간이 더 빠르다는 것입니다(한천 플레이트의 경우 21일 이상에 비해 5-12일).

서론

결핵의 원인균인 결핵균(Mtb)은 2019년 전 세계적으로 가장 심각한 전염병 사망자였습니다¹. 숙주 방어를 피하기 위해 Mtb는 대식세포 및 수지상 세포(DC)와 같은 선천성 면역 세포의 진균 살균 활성을 파괴하여 세포 내에서 지속되고 복제할 수 있도록^합니다2. 성인 폐결핵을 예방하는 효과적인 백신의 부족과 약물 내성 균주의 출현 증가는 새로운 치료법의 긴급한 필요성을 강조합니다.

보조 숙주 지시 요법(HDT)은 치료 시간을 단축^{하고 내성을} 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다3. 대식세포 내에서 진균살균 활성을 결정하기 위한 시험관 내 HDT 후보의 전임상 평가는 종종 고체 한천 플레이트에서 콜로니 형성 단위(CFU)에 의한 Mtb 성장의 정량화에 의존합니다. 이것은 약물의 신속한 스크리닝에 적합하지 않은 느리고 노동 집약적 인 분석입니다. 상업적으로 이용 가능한 자동화된 브로스 기반 미생물 검출 시스템은 임상 표본에서 Mtb 및 기타 마이코박테리아 종의 검출 및 약물 감수성 테스트를 위해 임상 미생물학 실험실에서 더 일반적으로^{사용됩니다4.}....

프로토콜

이 프로토콜에 설명된 실험은 봉쇄 레벨 37 실험실에서 처리할 수 있는 Mtb의 약독화된 H2Ra 균주를 사용하여 수행되었습니다. 살아있는 마이코 박테리아의 모든 조작은 클래스 II 생물학적 안전 캐비닛 (BSC)에서 수행되었습니다. 실험 절차는 에어로졸 생성을 최소화하도록 설계되었습니다. 진핵 세포 배양 (THP-1 세포)은 또한 클래스 II BSC에서 수행되었다. 실험실은 위험 평가를 수행하고 모든 절차가 기관 및 국가 생물 안전 규정에 따라 수행되었는지 확인했습니다. 인간 단핵구 THP-1 세포주를 사용하여 기재된 바와 같은 방법을 수행하였다(단계 1). 세포는 마이코박테리아에 감염되기 전에 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)로 자극한 후 대식세포로 분화됩니다.

1. 세포 배양

1. 알부민-덱스트로스-카탈라아제(ADC) 농축(10%) 및 0.05% 폴리소르베이트 80이 보충된 미들브룩 7H9(MB) 브로쓰에서 H37Ra 종자 스톡을 로그 단계로 전파합니다. H37Ra 재고를 1mL 분취량에 담아 -80°C 냉동고에 최대 1년 동안 보관하십시오.
2. Mtb-H37Ra 1mL 바이알을 해동하고 계획된 실험 약 25주 전에 MB 보충 국물 9mL가 들어 있는 필터 캡이 있는 T1 플라스크로 옮깁니다. 정....

결과

이 연구에 사용 된 자동화 된 액체 배양 기기는 10 분마다 CO₂ 수준을 모니터링합니다. 계기 병 바닥에 있는 센서의 색상 변화는 비색으로 측정되고 반사율 단위로 표시됩니다. 그런 다음 기기 소프트웨어는 검출 알고리즘을 적용하여 양성까지의 시간(TTP), 즉 접종 후 배양이 양성으로 플래그가 지정될 때까지의 일수를 계산합니다(그림 1A). 초기 접종물에서 TTP와 log₁₀CFU(한천 플레이트 방법으로 결정)¹² 사이의 반비례 관계가 그림 1B에 나와 있습니다. 약리학적 억제제의 존재 또는 부재 하에 1-2에서 5-10 범위의 MOI에서 감염된 대식세포 내 Mtb 성장(그림 1C)을 설명된 자동 배양 방법 또는 고형 한천 상의 콜로니 열거에 의해 비교했을 때, 두 방법 모두에 의해 얻어진.......

토론

저자들은 이 프로토콜에 설명된 액체 배양 방법을 사용하여 PMA^11,16,17로 분화된 단핵구 유래 대식세포 및 폐포 대식세포 및 THP-1 세포에서 Mtb 성장을 모니터링했습니다. 이 기술은 또한 비부착성 세포⁽¹²)와 함께 사용하기 위해 변형될 수 있다. 보다 최근에이 기기는 TB¹⁷에 대한 HDT로서 흡입 된 모든 트랜스 레티노 산 (AtRA)을 평가하기위한 전임상 연구에도 사용되었습니다. 프로토콜의 중요한 단계에는 (1) 약물 전처리로 인한 차등 식균 작용과 같은 요인을 완화하고 더 낮은 MOI에서 발생할 가능성이 적은 세포 사멸을 최소화하기 위해 AFB 염색에 의한 Mtb 흡수를 제어하는 것, (2) MOI에 따라 세포 용해물을 희석하여 분석의 동적 범위를 최대화해야 할.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
IX51 형광 현미경	Olympus, 일본	N/A	AFB 검출 및 이미징
2mL 마이크로튜브, 평평한 바닥, 나사 캡, 멸균	Sarstedt, North Carolina, USA	72.694.006	Mtb 감염 macropahges
5mL 주사기, Luer lock	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	SZR-150-031K	Macropahges/CFU
50mL 튜브	Sarstedt, North 미국 캐롤라이나,	62.547.254	Mtb 감염 macropahges
all-trans-Retinoic Acid (ATRA) ≥ 98% (HPLC)	Sigma Aldrich, Missouri, USA	R2625	호스트 지시 치료 후보
BacT/ALERT 3D 미생물 검출 시스템	Biomerieux ( Hampshire, UK)	247001	국물 기반 비색 검출 시스템
BACT/ALERT MP  BACT/ALERT MP 영양 보충제	Biomerieux (영국 햄프셔)	414997	국물 기반 비색 검출 분석
BACT/ALERT MP 배양 병	Biomerieux (영국 햄프셔)	419744	국물 기반 비색 검출 분석
BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mL	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	M0553	Mycobacterium 액체 배양
BD BBL Middlebrook OADC 농축, 20mL	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	M0678	콜로니 형성 단위
세포 스크레이퍼, 25cm	Sarstedt, North Carolina, USA	83.1830	대식 세포 용해물
수확 Corning 주사기 필터, 0.2 &마이크로; m	Corning Incorporated, Germany	431219	용해 완충액
살균 커버 유리(붕규산), 24 x 50mm, #1.5 두께	VWR International Limited	631 - 0147
Cycloheximide, from microbial	Sigma Aldrich, Missouri, USA	C7698	Colony Forming Units
Dako Fluorescent Mounting Medium	Agilent Technologies Ireland Limited	S3023	Antifade 장착 매체
Dulbecco' s Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich, Missouri, USA	D8537	Mtb infection of macropahges
Fetal Bovine Serum, Gibco	Thermo Fisher, Massachusetts, USA	10270106	대식세포 세포 배양
글리세롤, Difco	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	228220	Colony Forming Units
Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride)	Sigma Aldrich, Missouri, USA	B2261	핵 염색
IFNγ, 재조합 인간	R& D Systems Inc, Minnesota, USA	285-IF	호스트 지시 치료 후보
Labtek 2-well 챔버 슬라이드, sterile, Nunc	Thermo Fisher, Massachusetts, USA	TKT-210-150R	macropahges
L-Asparagine의	Sigma Aldrich, Missouri, USA	A4159	콜로니 형성 유닛
Linezolid	Sigma Aldrich, Missouri, USA	PZ0014	항생제
Microlance Hypodermic Needle 25 G	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	300400	Mtb 감염 macropahges/CFU
Middlebrook 7H10 Agar Base	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	M0303	Colony Forming
Units Middlebrook 7H9 Broth Base	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	M0178	Mycobacterium 액체 배양
변성 Auramine O Stain 및 탈색제	Scientific Device Laboratory, IL, USA	345-250	AFB stain
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich, Missouri, USA	158127	macropahges Petri dish의 Mtb 감염
, 92 x 16mm (20/bag)	Sarstedt, North Carolina, USA	82.1473.001	Colony Forming Units
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma Aldrich, Missouri, USA	P8139	대식세포 배양
Polysorbate 80, Difco	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	231181	Mycobacterium liquid culture
RPMI-1640, Gibco	Thermo Fisher, Massachusetts, USA	52400025	대식세포 배양
멸균 세포 스프레더, L-Shaped	Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA	RB-44103	콜로니 형성 유닛
T25 TC 플라스크, 앵글형 넥, 필터 캡, 멸균, Nunc	Thermo Fisher, 미국 매사추세츠	156367	Mycobacterium 액체 배양
THP-1 세포주	ATCC, 미국 버지니아	ATCC TIB-202	대식세포 배양

의 Mtb 감염, 멸균 Mtb 감염, 무수