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방법 논문

로봇 팔을 사용한 고처리량 스크리닝을 위한 Toxoplasm gondii 및 Neospora caninum 의 Nucleoside Triphosphate Hydrolases Assay

816 조회수

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DOI:

10.3791/62874

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2022년 7월 22일

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1Education and Research Center for Pharmaceutical Sciences, Faculty of Pharmacy, Osaka Medical and Pharmaceutical University, 2Independent Scholar, Tokyo, Japan, 3Division of Functional Genomics and Therapeutic Innovation, Research Center for Advanced Genomics, Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki University, 4School of Chemistry, Chemical Engineering and Life Sciences, School of Materials and Engineering, Wuhan University of Technology, 5Data Science Center, Jichi Medical University, 6Department of Cardiovascular Medicine, The Cardiovascular Institute, 7Department of Immunology and Parasitology, University of Occupational and Environmental Health, 8Division of Cardiology and Metabolism, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 9Department of Cardiovascular Medicine, Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki University Hospital

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii )와 네오스포라 카니눔(Neospora caninum ) 감염은 인간과 동물에서 발견되며 심각한 건강 문제를 일으킵니다. 두 기생충은 유사한 뉴클레오시드 삼인산 가수분해효소를 공유하며 번식과 생존에 중요한 역할을 합니다. 우리는 로봇 팔 사용을 필요로 하는 효소에 대한 높은 수준의 분석을 확립했습니다.

초록

원생동물 기생충은 인간과 많은 온혈 동물을 감염시킵니다. 주요 원생동물 기생충인 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii)는 HIV 양성 환자, 장기 이식 수혜자 및 임산부에서 흔히 발견되며, 이로 인해 심각한 건강 상태인 톡소플라즈마증(Toxoplasmosis)이 발생합니다. 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii)와 많은 유사점을 가진 또 다른 주요 원생동물인 네오스포라 카니눔(Neospora caninum)은 개와 암소에서 뇌척수염(Encephalomyelitis)과 근염-다발복사염(Myositis-Polyradiculitis)과 마찬가지로 동물에게 심각한 질병을 일으켜 사산된 송아지를 낳는다. 이들 모두는 유사한 뉴클레오시드 삼인산 가수분해효소(NTPase)를 나타냈습니다. Neospora caninum에는 NcNTPase가 있고 Toxoplasma gondii에는 TgNTPase-I가 있습니다. 효소는 번식과 생존에 중요한 역할을 하는 것으로 생각됩니다. 원생동물 감염을 예방하는 화합물 및/또는 추출물을 확립하기 위해 우리는 약물 발견을 위해 이러한 효소를 표적으로 삼았습니다. 다음 단계는 ADP 함량을 측정하기 위해 기존의 생화학 효소 분석법과 형광 분석을 결합하여 새롭고 감도가 높으며 정확도가 높은 분석을 확립하는 것이었습니다. 또한 새로운 분석법이 두 원생동물 효소에서 HTS(High-Throughput Screening)를 수행하기 위한 기준을 충족한다는 것을 검증했습니다. HTS를 수행하여 각각 2개의 합성 화합물 라이브러리와 해양 박테리아에서 유래한 추출물 라이브러리에서 19개의 화합물과 6개의 추출물을 식별했습니다. 본 연구에서는 시약, 장치, 로봇 팔 등의 제조에 대한 정보를 포함하여 HTS를 수행하는 방법에 대한 자세한 설명을 소개했습니다.

서론

로봇 공학은 생화학, 분자 생물학 및 임상 연구와 같은 산업 및 제조 공학을 넘어 다양한 분야, 특히 HTS 1,2,3과 같은 분야에서 중요한 돌파구를 달성하기 위한 정교하고 강력한 도구로 확립되었습니다. 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii)는 주요 기생충이자 단세포 기생 진핵생물4로 인간5 및 많은 동종 동물4에게 심각한 건강 문제를 일으켜 AIDS 환자6, 장기 이식 수혜자7 및 임산부8에게 특히 심각한 상태인 톡소플라스마증을 유발하는 감염을 일으킨다. Phylum Apicomplexa9에 속하는 Neospora caninum은 주로 개와 소6를 감염시켜 개10,11에서 뇌척수염 및 근염-다발복사염을 일으키고 암소12,13에서 유산을 일으킵니다. 또한, Neospora caninum은 Toxoplasma gondii 9,14의 형태학적, 계통발생학적으로 밀접한 유사성을 나타냅니다. 또한, 그들은 뉴클레오시드 삼인산 가수분해효소(NTPase; EC3.6.1.15)14. 이 효소는 기존의 ecto-ATPase14와는 상당히 다릅니다. 이 기생충은 전체 단백질의 2%-8%인 상당한 양의 NTPase 단백질을 생성하며 타키조이트15단계에서 휴면 효소로서 중요한 역할을 합니다. 조밀한 분비 과립에서 이들은 응축되어16 기생 액포16 로 분비된다는 점에 유의해야 합니다. 생화학적 효소 특성으로서 NTPase는 디티오트레이톨17에 의해 활성화됩니다. 디티올 화합물과 같은 유도 물질, 디티올-이황화 산화환원효소와 같은 미확인 효소 및 다른 하나는 동일한 성질을 나타내는 것으로 예측됩니다. 그들은 아직 기생충에서 확인되지 않았습니다. 그러나 이 효소는 감염된 숙주 세포에서 타키조이트를 방출하는 데 중요한 역할을 합니다17.

톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii)는 두 개의 NTPase 이소형(18)을 가지고 있는데, I형 효소 TgNTPase-I와 II형 효소 TgNTPase-II18이다. 전자는 기질(18)로서 트리포스페이트 뉴클레오시드(triphosphate nucleosides)를 우선적으로 이용한다. 후자는 삼인산과 이인산 뉴클레오시드를 모두 가수분해합니다18. 상동성은 아미노산 수치에서 97%입니다18. Neospora caninum은 또한 NcNTPase19라는 TgNTPase-I의 orthologue를 가지고 있습니다. 상동성은 아미노산 수치에서 73%입니다19. Asai 교수와 Harada 교수는 E. coli를 사용하여 NTPase의 재조합체를 생성하고, 이전에 보고된 바와 같이 이들의 구조적으로 활성화된 돌연변이를 변경했습니다20. 그들은 친절하게도 두 명의 활동적인 돌연변이에게 선물을 주었습니다. 두 효소 모두 ATP를 시험관 내에서 ADP로 전환할 수 있습니다 20. 아주 최근에 우리는 효소에 의해 가수분해된 ADP 함량을 사용하여 NTPase의 활성을 측정했습니다. 마지막으로, 우리는 이전에 보고된 바와 같이 형광과 효소 반응의 조합으로 ADP 함량을 측정하는 과정을 통해 높은 수준의 분석을 확립하는 데 성공했습니다21,22. 또한 고처리량 스크리닝(HTS)22을 수행했습니다.

본 연구에서는 새로운 고정밀 및 동적 범위 분석(high-accuracy and dynamic-range assay21)의 상세한 절차를 소개하고, HTS용 로봇팔을 사용하여 효소 활성을 측정하고 형광 강도를 개발하기 위해 시약을 준비하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다.

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프로토콜

1. 재조합 TgNTPase-I 및 NcNTPase의 발현 및 정제

  1. 플라스미드라는 표현을 준비하여 E. coli 에 도입합니다.균주 BL21.
    참고: 구성 및 절차에 대한 자세한 정보는 이전 보고서14에 나와 있습니다. 이 연구에서 TgNTPase-I와 NcNTPase 구성 활성 돌연변이는 모두 Asai 교수와 Harada 교수에 의해 친절하게 선물되었습니다.

2. 플레이트에 생체 형광 반응 용액의 준비 및 배치

  1. 384웰 형식의 400웰 분석을 위한 마스터 믹스 2mL에 대해 표 1 에 설명된 대로 2x 생형광 반응 용액을 준비합니다.
  2. Resazurin 및 N-ethylmaleimide를 제외한 각 표시된 농도에 대해 증류수(DW)를 사용하여 원액을 준비합니다. 나머지 2개의 시약을 적절한 농도의 DMSO로 용해시킵니다. 그런 다음 실험을 수행할 때까지 시약을 -30°C에서 보관하십시오.
  3. 15μL의 2x 생체 형광 반응 용액을 368개의 웰(384웰 형식) 각각에 추가합니다.
    참고: 첫 번째 플레이트는 실험을 두 번 수행할 수 있는 충분한 시약을 담을 수 있는 저장소 역할을 합니다.

3. 테스트 화합물 또는 추출물을 분석 플레이트의 각 웰 바닥에 놓습니다.

  1. 테스트 화합물을 포함하여 라이브러리 마더 플레이트의 로봇 암을 사용하여 각 화합물 0.5μL를 플레이트 바닥에 넣습니다.
  2. 0.5μL의 DMSO를 음성 대조군과 양성 대조군 모두에 추가합니다.

4. 효소 반응 혼합물의 준비 및 반응의 시작

  1. 효소 반응 용액을 표 2에 표시된 바와 같이 준비한다.
  2. 효소 반응 혼합물 50mL에 NTPase(최종 농도는 0.0002μg/mL)를 첨가하고 빠르게 혼합한 후 플라스틱 저장소로 옮깁니다.
  3. 로봇 암을 사용하여 negative control line을 제외한 각 well에 4.5μL를 동시에 주입합니다.
  4. 동시 주입 대신 PBS와 동일한 양의 효소 반응 혼합물을 첨가합니다.
  5. 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 10분 동안 놓습니다.

5. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 효소 활성을 실시간으로 측정합니다.

  1. 10분 배양 후 로봇 암을 사용하여 즉시 각 웰에 5μL의 2x 생체 형광 반응 용액을 동시에 첨가합니다.
  2. 로봇 암을 일시적으로 중지하여 플레이트를 배치할 위치 위에 각 팁의 용액을 고정합니다.
  3. 분석 플레이트가 제자리에 놓이면 로봇 암을 다시 시작합니다.
    알림: 생성된 ADP의 포화를 방지하려면 즉시 형광 강도를 측정하십시오.
  4. 플레이트를 빠르게 회전시키고(200분 동안 1 x g ) 플레이트를 플레이트 리더에 놓습니다.
  5. 540 nm/590 nm(여기/방출)에서 1시간 동안 매분 형광의 실시간 측정을 시작합니다.

6. 결과 분석

  1. 각 실험 그룹에서 표시되고 복제된 샘플의 평균 ± 표준 오차(SEM)로 값을 계산합니다. 일관성을 보장하기 위해 실험을 반복합니다.
  2. 스튜던트 t-검정을 사용하여 통계적 유의성을 수행합니다.
  3. P 값이 P < 0.05인 경우 통계적으로 유의한 값을 계산합니다.
  4. 다음 공식을 사용하여 신호 대 배경 비율(S/B), 신호 대 잡음 비율(S/N) 및 Z'-계수를 계산합니다.
    S/B = 평균 리간드/평균 차량
    S/N = (평균 리간드 - 평균 차량)/표준 편차 차량
    Z'-factor = 1 - (3 x 표준 편차 리간드 + 표준 편차 비히클)/(평균 리간드 - 평균 비히클)
  5. S/B, S/N 및 Z'-factor가 각각 3, 10 및 0.5보다 큰지 확인합니다.
    참고: 각 실험이 이전 보고서23,24에서 언급한 바와 같이 HTS를 수행하기에 충분한 일반 기준을 충족하는지 확인합니다.

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결과

분석의 원리는 보충 그림 1에 요약되어 있으며 이전 보고서12,18을 기반으로 합니다. 분석은 그림 1과 같이 384웰 형식으로 설계되었습니다. 플레이트에서 맨 오른쪽과 왼쪽 라인은 피했습니다. 그런 다음 맨 왼쪽 및 오른쪽 선 옆에 있는 두 줄을 각각 효소가 있거나 없는 음성 대조군과 양성 대조군으로 사용했습니다(n = 16). 이를 통해 플레이트에 있는 320개의 화합물을 쉽게 검사할 수 있었습니다. 그림 1B는 이 연구에 사용된 플레이트, 용기, 로봇 팔, 팁 및 마이크로플레이트 리더를 나타냅니다. 이 연구에 사용된 절차는 그림 1C에 나와 있습니다. 처음에는 형광 강도를 측정하기 위해 2x 생체 형광 반응 용액을 준비하고 맨 오른...

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토론

우리는 Tg 및 Nc ATPase22를 포함한 ATPase를 통한 최종 산물인 ADP에 대한 형광 분석과 고전적인 효소 분석의 조합으로 새로운 고동적 범위와 정확도 분석을 확립하는 데 성공했습니다. HTS를 수행하기 위해서는 분석이 고전적인 효소 분석보다 더 나은 S/B, S/N 및 Z' 인자 값을 갖는 것이 중요합니다15,22. 또한 HCl과 같은 산으로 효소 반응을 중단하는 단계를 생략하고 1시간 동안 1분마다 모든 웰에서 형광을 실시간 측정하면 취급이 더 쉬워지고 오해의 소지가 최소화되어 샘플 간에 포화된 부적절한 시점과 데이터를 잘 비교할 수 있습니다. 효소 반응의 속도가 너무 빨라 반응의 포화로 인해 부적절한 시점에서 올바른 활성을 측정할 수 없습니다.

본 논문에서...

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공개 사항

저자는 이 연구에 재정적 이해관계가 없습니다.

감사의 글

이 연구는 일본과학진흥회(Japan Society for Promotion of Science)의 과학 연구 보조금(C)인 Platform for Drug Discovery, Informatics and Structural Life Science(JSPS-21K06566)의 일부 지원을 받았습니다. 저자는 Asai(Keio University School of Medicine)와 Harada(Kyoto Institute of Technology) 및 Stephen Stratton이 각각 두 개의 NTPase 활성 돌연변이를 재조합 선물로 준 것과 이 원고 작성에 기여한 것에 대해 진심으로 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
12 스테이지 워크스테이션 EDR-384 SXBiotec Co., Ltd.EDR-384SX로봇 팔 피펫 시스템
384 웰 팁Biotech Co., Ltd.맞춤형
ADP-hexokinaseAsahi Kasei Pharma Co., Ltd.T-92
ATP동양 효모, Co, Ltd.45140000
BSAWako 순수 화학 산업, Ltd.011-15144
디아포라제-아이유니티카Di-1
DMSONacalai Tesch, Inc.13406-55
G6P 탈수소효소동양 효모, Co, Ltd.306-50143
포도Wako 순수 화학 산업, Ltd.049-31165
Greiner 384 웰 마이크로 플레이트 비 바인딩 얕은 우물 블랙# 784900
HEPESWako Pure Chemical Industries, Ltd.342-01375
Mg(CH3COO)2Wako Pure Chemical Industries, Ltd.130-00095
NADP동양효모(주)44332000
N-에틸말레이미드Wako Pure Chemical Industries, Ltd.056-02062
페라스타 FSBMG LABTECH JAPAN L.t.d.PHERAstar FS다중 모드 마이크로플레이트 리더
ResazurinWako Pure Chemical Industries, Ltd.191-07581
Seahorse Labware 384 웰 로우 프로파일 저수지S30022 25/CS
TrisHClWako Pure Chemical Industries, Ltd.W01COBQE-4120
트리톤 X-100Nacalai Tesch, Inc.35501-02
(주)당 년

참고문헌

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