HaCaT 각질세포의 세포 운동성을 고처리량으로 측정하기 위한 이 프로토콜은 ImageJ 플러그인 TrackMate를 사용하여 세포핵의 이미지를 수집 및 처리하고 입자 추적을 수행하는 방법을 설명합니다.
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방법 논문
핵 추적을 사용하여 2차원 세포 운동성을 측정하기 위한 TrackMate 출력의 분석 및 통합을 위한 프로토콜
이 논문에서
요약
초록
집단 세포 이동은 발달, 상처 치유 및 암 전이를 포함한 많은 기본적인 생물학적 과정에서 중요한 역할을 합니다. 세포 운동성의 조절을 이해하려면 다양한 조건에서 쉽고 일관되게 측정할 수 있어야 합니다. 여기에서는 핵 염색을 사용하여 HaCaT 각질세포의 단세포 및 벌크 운동성을 측정하고 정량화하는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법에는 TrackMate 출력 파일을 분석하여 단일 셀에서 변위, 운동성 속도 및 궤적 각도를 계산하고 이미징 사이트에 대한 대량으로 계산하기 위한 MATLAB 스크립트가 포함되어 있습니다. 이 운동성 분석 스크립트를 사용하면 TrackMate 데이터에서 세포 운동성을 빠르고 간단하며 확장 가능한 방식으로 분석할 수 있으며, 상피 세포의 운동성 조절을 식별하고 연구하는 데 광범위하게 사용될 수 있습니다. 또한 현미경에서 수집된 현미경 비디오를 재구성하고 ImageJ TrackMate 플러그인을 사용하여 대량으로 분석할 수 있는 TIF 스택으로 변환하기 위한 MATLAB 스크립트를 제공합니다. 이 방법론을 사용하여 HaCaT 각질세포에서 세포 운동성을 조절하는 데 있어 부착 접합부 및 액틴 세포골격 역학의 역할을 탐구함으로써 HaCaT 각질세포에서 α-카테닌 고갈 후 나타나는 운동성 증가에 Arp2/3 활성이 필요하다는 증거를 입증했습니다.
서론
상피 세포의 세포 운동성을 정확하고 즉각적으로 조절하는 것은 상처 치유와 상피층 보충에 매우 중요합니다. 운동성을 유지하지 못하면 배아 발달 및 상처 치유1 에 문제가 발생할 수 있으며, 과도한 운동성 신호전달은 암 전이의 주요 원인입니다2.
HaCaT 각질세포의 운동성 세포 조절에 대한 이해는 이러한 과정에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 여기에 요약된 절차는 단일 세포 또는 집단 수준에서 세포 운동성의 평균 크기에 대한 일관된 측정 및 계산을 제공합니다. 우리는 이 방법을 사용하여 유전적 섭동 또는 소분자 억제제 처리 후 HaCaT 각질세포의 운동성을 측정하여 운동성 속도를 조절하는 세포 신호를 이해했습니다. 제공된 MATLAB 스크립트는 각 셀에 대한 운동성의 평균 속도와 평균 방향을 모두 측정합니다.
집단 세포 운동성은 발달과 암 전이 모두에서 상피-중간엽 전이에 매우 중요합니다3. 세포는 접착(adhesion), 분극(polarization), 돌출(protusion), 수축(retraction)....
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프로토콜
1. 세포 배양 및 이미징 플레이트 준비
- 가습 인큐베이터에서 37°C에서 세포 배양 배지(2mM L-글루타민, 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신 및 10%(v/v) 소 태아 혈청이 보충된 Dulbecco의 Modified Eagle's Medium)에서 HaCaT 세포를 배양합니다.
- 96웰 이미징 플레이트(예: 96웰 블랙 폴리스티렌 마이크로플레이트)에 웰당 원하는 수의 세포(5000 - 20,000 세포/웰 사용)를 시드합니다. 3개의 웰에 중간 크기(세포 없음)만 추가합니다.
- 플레이트를 완전히 평평한 표면에 20 - 30분 동안 놓아 세포가 균일한 공간 분포로 플레이트 바닥에 부착될 수 있도록 합니다.
- 플레이트를 가습된 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5% 이산화탄소)로 4-6시간 동안 옮겨 세포가 플레이트 바닥에 완전히 부착되도록 합니다.
- 플레이트에서 배지를 제거하고 세포 배양 배지를 2 μg/mL Hoechst 염료(1 mg/mL 원액의 1:5000 희석)로 교체합니다.
- 플레이트를 가습된 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5% 이산화탄소)에 2시간 동안 반환합니다.
- ....
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결과
당사의 분석 스크립트가 신뢰할 수 있고 일관성이 있는지 확인하기 위해 세 가지 독립적인 실험에서 HaCaT 각질 세포의 운동성을 측정했습니다. 세포 운동성의 표준 편차는 실험마다 차이가 있지만(아마도 융합 및 기계적 자극에 대한 HaCaT 세포의 민감성 때문일 수 있음), 쌍꼬리 학생의 t-검정에 따르면 반복 간에 통계적으로 유의미한 차이 없이 평균 운동성이 여러 실험에서 일관되게 반복되었음을 발견했습니다(그림 2).
액틴 역학을 매개하는 Arp2/3 복합체의 역할, Arp2/3에 대한 α-카테닌의 알려진 억제 효과, α-카테닌의 고갈이 운동성증가로 이어진다는 이전 관찰 3으로 인해, 소분자 억제제 CK-666을 사용하여 Arp2/3 복합체를 억제하면 α-카테닌 고갈 시 향상된 운동성이 제거되는지 여부를 조사했습니다. 앞서 설명한바와 같이 생.......
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토론
위에서 설명한 방법론 및 분석 툴은 MATLAB을 사용하며 최소한의 프로그래밍 경험만 있으면 되는 HaCaT 각질세포의 운동성을 측정하고 정량화할 수 있는 간단하고 확장 가능한 수단을 제공합니다. 이 프로토콜은 세포핵을 최소 5시간 동안 염색하고 이미지화할 것을 요구합니다. 데이터 수집은 모든 적절한 현미경에서 수행할 수 있지만, 이 프로토콜은 ImageXpress Micro XL 현미경에서 수집된 이미지를 모든 시점에서 세포핵 위치의 타임 랩스를 보여주는 각 이미징 부위의 TIFF 스택으로 처리하기 위한 스크립트를 제공합니다. ImageJ용 TrackMate 플러그인을 통해 이러한 TIFF 스택을 처리한 후 이 프로토콜을 사용하면 출력 트랙을 각 이미징 부위 및 단일 셀에 대한 평균 운동성, 표준 편차 및 트랙을 포함하는 단일 MATLAB 셀 구조로 통합할 수 있습니다.
다른 세포 운동성 분석 도구도 사용할 수 있지만.......
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공개 사항
X.L.과 University of Colorado Boulder는 치료제를 위한 HDAC 억제제 개발에 재정적 이해관계를 가지고 있으며 OnKure의 지분을 소유하고 있습니다. X.L.은 콜로라도 볼더 대학교(University of Colorado Boulder)로부터 독점 HDAC 억제제에 대한 라이선스를 취득한 OnKure의 공동 창립자이자 이사회 구성원입니다. OnKure는 이 연구의 실험 설계나 자금 지원에 관여하지 않습니다.
감사의 글
Daniel Messenger, Lewis Baker, Douglas Chapnick, Adrian Ramirez, Quanbin Xu 및 Liu 및 Bortz 연구소의 다른 구성원들의 통찰력과 조언에 감사드립니다. MATLAB에 대한 전문 지식을 공유해 주시고 XML import를 위한 함수를 작성해 주신 Jian Tay에게 감사드립니다. 현미경 검사 및 이미징 지원을 제공해 주신 BioFrontiers Advanced Light Microscopy Core의 Joseph Dragavon에게 감사드립니다. 세포 배양 지원 및 세포 배양 핵심 시설의 Theresa Nahreini와 Nicole Kethley에게 감사드립니다. 이 연구는 국립보건원(National Cancer Institute)과 국립보건원(National Institutes of Health, R01AR068254)의 관절염 및 근골격 및 피부질환 연구소(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)의 보조금으로 지원되었으며, X. L. 및 국립일반의학연구소(NIGMS)의 R01GM126559, D.B. 및 X.L.G.E.W. 및 E.N.B.는 NIGMS(T32GM08759)의 박사 전....
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 96웰 플랫 투명 바닥 블랙 폴리스티린 TC 처리 마이크로플레이트, 개별 포장, 뚜껑 포함, 멸균 | Corning | 3603 | |
| Dulbecco의 변형 독수리 배지(고 D-포도당) | Life Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific | 12800-082 | |
| 소 태아 혈청 | Sigma-Aldrich Inc | F0926 | |
| Fluorobrite Dulbecco의 변형 독수리 배지(높은 D-포도당, 3.7g/L 중탄산나트륨, L-글루타민 없음, 페놀 레드 없음) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | A18967-01 | |
| GlutaminePlus | R& 주식회사 디 시스템즈 | R90210 | |
| Hoechst 33342, 트리하이드로클로라이드, 트리하이드레이트 | Invitrogen/Thermo Fisher Scientific | H21492 | |
| 페니실린 스트렙토마이신 | Life Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| 인산염 완충 식염수 | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 14190-144 |
참고문헌
- Li, L., He, Y., Zhao, M., Jiang, J. Collective cell migration: Implications for wound healing and cancer invasion. Burns & Trauma. 1 (1), 21-26 (2015).
- Stuelten, C. H., Parent, C. A., Montell, D. J. Cell motility in cancer invasion and me....
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재인쇄 및 허가
